Construcción de un microscopio de alta resolución con capacidades de captura óptica convencional y holográfica

Resumen

El sistema descrito en este documento emplea una trampa óptica tradicional, así como una línea de trampas ópticas holográficas independiente, capaz de crear y manipular múltiples trampas. Esto permite la creación de disposiciones geométricas complejas de partículas de refracción a la vez que permite mediciones simultáneas de alta velocidad, de alta resolución de la actividad de enzimas biológicas.

Resumen

Sistemas de microscopio de alta resolución con trampas ópticas permiten la manipulación precisa de los diversos objetos de refracción, tal como perlas de dieléctricos ¹ u orgánulos celulares ^2,3, así como para la lectura de alta resolución espacial y temporal de su posición con respecto al centro de la trampa. El sistema descrito en este documento tiene como "tradicional" trampa funciona a 980 nm. Es, además, proporciona un segundo sistema de captura óptica que utiliza un paquete holográfica disponibles comercialmente para crear y manipular simultáneamente patrones de trampas complejos en el campo de visión del microscopio ^4,5 a una longitud de onda de 1064 nm. La combinación de los dos sistemas permite la manipulación de varios objetos de refracción al mismo tiempo, mientras que la realización simultánea mediciones de alta resolución de movimiento y la fuerza de producción a escala nanométrica y picoNewton alta velocidad y.

Introducción

Atrapamiento óptico es una de las técnicas principales en la biofísica ^6. Un avance crucial en la captura óptica ha sido el desarrollo de trampas holográficas que permiten la creación de patrones de trampas tridimensionales en lugar de trampas de punto convencionales ^7. Tales trampas holográficas poseen la ventaja de la versatilidad en el posicionamiento de los objetos de refracción. Sin embargo trampas convencionales pueden ser fácilmente alineados a ser más simétrico que los kits holográficas disponibles comercialmente. También permiten rápido seguimiento preciso de los objetos atrapados. Aquí se describe un sistema (Figura 1) que combina los dos enfoques de captura en un solo instrumento y permite al usuario explotar los beneficios de ambos según sea apropiado.

Las consideraciones generales de la construcción de trampas ópticas (basados ​​en rayos láser simples o múltiples) se discuten en detalle en otra parte ^8-10. A continuación, resumimos los aspectos específicos de nuestro sETUP y proporcionar los detalles de nuestro proceso de alineación. Por ejemplo, los sistemas con dos haces ópticos de captura no se han descrito antes (por ejemplo, ref. ^11), típicamente usando un haz de láser para atrapar un objeto de refracción y el uso de la otra (rayo de energía intencionalmente bajo) para la lectura desacoplado de la posición del objeto atrapado . Aquí, sin embargo, los dos haces de láser deben ser de alta potencia (300 mW o superior) debido a que ambos se van a utilizar para la captura. Para las mediciones de los sistemas biológicos, los láseres utilizados para la captura deberían caer de manera óptima dentro de una ventana de longitud de onda NIR específica para minimizar la degradación de la proteína inducida por la luz ^1. Aquí se ha optado por utilizar el diodo 980 nm y 1064 nm láser DPSS debido a su bajo costo, alta disponibilidad y facilidad de operación.

También hemos optado por utilizar un modulador espacial de luz (SLM) para crear y manipular múltiples trampas simultáneamente en ^4,5 tiempo real. Estos dispositivos están disponibles comercialmentesin embargo, su integración en una instalación completa presenta desafíos únicos. Aquí se describe un enfoque práctico que aborda estas dificultades potenciales y proporciona un instrumento muy versátil. Se presenta un ejemplo explícito para la configuración específica descrita, que puede ser utilizado como una guía para los diseños modificados.

Protocolo

1. La instalación de 980 nm Longitud de onda única trampa óptica

1. Trampas ópticas a 980 nm de longitud de onda es a menudo óptima para experimentos biofísica y diodos láser de bajo costo están disponibles con una salida de potencia de hasta 300 mW. Es preferible que un láser de diodo que se trenza con la polarización de preservación de fibra monomodo con un diámetro de campo de modo conocido. La fibra tiene que ser suficientemente largo para actuar como un filtro de modo y por lo general se termina ya sea con una FC / PC o conector FC / APC. De éstos, es preferible minimizar la reflexión posterior de luz y el potencial de inestabilidades de retroalimentación FC / APC.
2. Asegure el diodo láser 980 nm en un montaje que permite el poder y control de temperatura. Lo mejor es fijar el soporte a una mesa óptica directamente a maximizar la disipación de calor pasiva y así minimizar el riesgo de fracaso del diodo debido a un mal funcionamiento del controlador de temperatura.
3. Monte el conector de fibra PC / APC a los colimadores ópticas de haz. Escrítico para asegurar que el haz colimado tiene divergencia angular mínima para puertos de fibra ajustables son más útiles. Asegúrese de que el puerto de fibra elegida coincide con el diámetro del campo modal de la fibra de la coleta del diodo. Si el haz es para ser rastered utilizando deflectores acústico-ópticos (AOD) o deflectores electro-ópticos (EOD), entonces la cintura del haz láser colimado también debe ser ligeramente menor que el tamaño de la abertura del deflector.
4. Fije el adaptador de colimación a la mesa óptica a distancia suficiente del microscopio para permitir el enrutamiento de haz, la expansión, y la colocación de otros componentes deseados. Ajuste el puerto de fibra para asegurar cintura del haz consistente en distancias comparables a la trayectoria de haz total al microscopio.
5. Instalar espejos indicados en la Figura 1. Retire el objetivo del microscopio y el uso de los espejos para dirigir el haz a través de la abertura en la etapa de montaje de objetivo. Si se prefiere, la colocación de los espejos dicroicos DM1 y DM3 se puede omitir hastamás tarde. DM2 y DM3 son tanto paso corto y transmitir la luz visible, mientras que refleja IR cercano y más.
6. Es útil para montar temporalmente un puntero láser rojo en lugar del objetivo, alineados en el eje óptico del microscopio. Un adaptador mecánico personalizado es necesario para asegurar el centrado del puntero láser. Haz visible desde el puntero láser a continuación, se puede encaminar de nuevo al centro de la abertura del puerto de fibra y luego se puede utilizar para instalar los lentes (ver más abajo).
7. Instalar el expansor de haz 980 nm (L8 y L9) a una distancia adecuada desde el puerto de fibra para permitir la inserción futuro de componentes de la dirección (AOD o EOD) según sea necesario ^1. La viga mayor, tiene que llenar demasiado poco la apertura focal posterior del objetivo. (Aquí, las lentes con distancias focales de 125 mm y 60 mm están en una disposición kepleriano a aproximadamente el doble de la cintura del haz). Utilice la luz de puntero láser visible (ver sección 1.6) para asegurar la colocación apropiada de la lente y la alineación aproximada.
8. Instalarl de las lentes de dirección 980 nm (L2 y L3) en una disposición de telescopio, como se indica (en este caso ambos tienen longitud focal 60 mm) ^1. L3 se monta en un plano conjugado al plano de back-focal del objetivo. Montaje de L3 en una etapa de posicionamiento XYZ precisión para permitir la orientación del haz. Es útil para la etapa de XYZ contar con indicadores digitales para sus micrómetros, lo que permite un posicionamiento repetible y el reposicionamiento de la trampa. El "rango de desplazamiento 0.5 suele ser suficiente, sin embargo ya viajes para el posicionamiento L3 a lo largo del eje óptico puede ser útil. Utilice puntero láser visible (ver sección 1.6) para asegurar la colocación apropiada de la lente y la alineación aproximada.

2. La instalación del detector de láser

1. Instalar el espejo dicroico DM3 encima del condensador, como se muestra en la Figura 1. Normalmente se requiere un montaje personalizado. Asegure el fotodiodo cuádruple (QPD) o un detector sensible a la posición (PSD) ⁸ hacia el lado del conjunto de condensador y ensure que el rayo láser 980 nm refleja en DM3 está golpeando es más o menos en el centro. Cuando se utiliza QPD, asegurarse de que está montado en una pequeña etapa de XY para permitir el centrado exacto del sensor en el haz de láser.
2. Instalar L1 (típicamente una lente de 30 mm) entre DM3 y el sensor. Posición L1 para enfocar el haz a un solo punto del sensor.
3. Instalar el filtro de muesca justo antes de L1 para bloquear el haz de 1064 nm, así como cualquier reflexión de luz visible callejeros del iluminador microscopio y la iluminación ambiente.

3. La instalación de 1.064 nm de longitud de onda holográfica Trampa

1. La parte holográfica de la instalación se construye en torno a un paquete de hardware / software disponible en el mercado Los espejos holográficos utilizados en este paquete están clasificados para una potencia máxima de incidencia de 5 a 10 W / cm ^2. Monomodo TEM00 vigas en este rango de potencia pueden ser fácilmente obtienen de un láser DPSS a 1064 nm de longitud de onda.
2. Montar el láser 1064 nm en un elevadoplataforma para que coincida con la altura de la trayectoria del haz de la línea 980 (véase la sección 1).
3. Si no directamente controlable, la potencia del láser se puede ajustar manualmente mediante la instalación de una placa de media onda (PMR) y un polarizador (PBS) inmediatamente después de la abertura de salida del láser. Es útil para montar el polarizador en una etapa rotatoria para ser capaz de igualar requisito espejo holográfico para la polarización del haz.
4. Instale el 1,064 nm expansor de haz (L6 y L7). La cintura del haz láser debe ser ampliado para que coincida con el tamaño de la diagonal del espejo holográfico. Para grandes relaciones de expansión (por encima de 10 veces) que puede ser una preocupación para mantener el tamaño del expansor pequeña. Por lo tanto, puede ser deseable usar lentes con distancia focal inusualmente pequeña (aquí: 16 mm y 175 mm).
5. Instalar los otros espejos como se indica para dirigir el haz de 1.064 nm a través del objetivo.
   1. Secure DM1 dicroico (45 ° ángulo de incidencia) en una montura cinemática y colocar el conjunto en la trayectoria del haz de 980 nm de modo que permite undiminishetransmisión d de que el haz.
   2. Activar luz de puntero láser. El espejo DM1 debe reflejar la suficiente cantidad de luz visible para colocar correctamente el modulador espacial de luz (SLM) en la trayectoria de este haz. El SLM también tiene que ser en ángulo de manera que los haces de láser entrantes y salientes están tan cerca como sea posible a la incidencia normal. Sin embargo, el ángulo de incidencia debe ser suficientemente grande para asegurar que el rayo láser no se recorta por montajes de lentes y otros componentes ópticos. Un ángulo de 5 ° debe ser fácil de lograr y es lo suficientemente pequeño. Por último la distancia desde DM1 al SLM deberá medirse con precisión de manera que la inserción de las lentes de L4 y L5 (ver 3.6 más abajo) puede conjugar el plano de simetría de SLM y el plano posterior-focal del objetivo.
   3. Instale un espejo para dirigir la luz desde 1064 expansor de haz nm para el SLM. Asegúrese de que la luz del puntero láser incide en el expansor de apertura del haz en el centro.
6. Instale lentes de L4 y L5 (en este caso las lentes con 125 mm y 200 mm, respectivamente). Este par telescopio conjuga el plano de simetría SLM con el plano focal posterior del objetivo y también reduce la cintura del haz de sobrellenado sólo ligeramente de la abertura trasera del objetivo. Elegimos objetivos con distancias focales largas para separar el SLM lejos de DM1. Esto no sólo elimina espacio para la segunda línea de láser, pero también tiende a hacer más fácil la alineación.
7. Retire el puntero láser. Deje el adaptador de montaje para servir como abertura de alineación aproximada.

4. Instalación y alineación Notas sobre el sistema

1. Lente L3 y SLM deben estar colocados de forma que sea ópticamente conjugada con el plano focal posterior del objetivo. El punto focal común de L4 y L5 es ópticamente conjugado con el plano de la muestra si los haces ópticos de captura no se inyectan en el espacio infinito del microscopio.
2. cantar Tarjeta de infrarrojos visor de alinear el haz de 980 nm para ir a lo largo del eje central de la abertura en el adaptador de puntero láser.
3. Utilice IR tarjeta de to asegurarse de que el haz de 1064 nm golpea en el mismo lugar que el haz de 980 nm en DM1, L2, y L3 y que el haz de 1064 nm va a lo largo del eje central de la abertura en el adaptador de puntero láser.
4. Vuelva a colocar el adaptador de montaje puntero láser con un objetivo. Aceite o agua objetiva apertura numérica alta es típico.
5. Alinear la trampa 980 nm como se describe en el ⁹ por "caminar" el rayo láser hasta que un patrón de interferencia radial simétrica se ve en la cámara.
6. Con el espejo holográfico off (es decir, actúa como un espejo pasivo) utilizar SLM y DM1 a "caminar" el haz no difractado 1064 nm para alinear la trampa de 1.064 nm.
7. El SLM produce un haz no difractado significativa que se traduce en una fuerte trampa láser inamovible en el campo de visión. Esto es útil para la alineación, pero puede no ser deseable para los experimentos. Para bloquear esta trampa se puede insertar un pequeño objeto opaco en el camino de la luz no difractada en el conjugado de ubicación con respecto al plano de la muestra (por ejemplo, thpunto focal común e de L4 y L5). El tamaño de este bloqueador de punto central tiene que ser algo mayor que el diámetro del disco de Airy para la luz enfocada (un bloqueador con 100-300 m de diámetro para el sistema descrito).
8. JUSTE 1064 la polarización del haz nm usando el polarizador para que coincida con la orientación SLM. Gire la placa de media onda para ajustar la potencia de salida del haz lo deseas.
9. Si lo desea, introduzca AOD o EOD elementos de orientación del haz en la línea de láser 980 nm. Asegúrese de conjugación adecuada de estos elementos para el avión de vuelta-focal del objetivo y volver a alinear la trampa. Es útil para montar los elementos de dirección en un escenario goniométrica.

Resultados

La configuración ensamblada permite al operador para atrapar varios objetos de refracción en tiempo real y la posición de ellos en todas las tres dimensiones dentro del campo de visión. Nos ilustran las capacidades holográficas del instrumento al atrapar 11 microesferas (Figura 2). La trampa de confinar cada objeto se volverá a colocar manualmente sobre la captura de manera que la disposición final muestra el logotipo de la Universidad de Utah, donde se llevó a cabo este experimento. Una funció...

Discusión

Hemos construido un instrumento que combina dos trampas ópticas de diferentes tipos (Figura 1) para proporcionar instalaciones de captura separadas para la manipulación de objetos y medición. La trampa óptica "convencional" se basa en un láser de diodo de 980 nm. Este haz se expande, dirigió y luego se inyecta en el microscopio invertido (haz "luz roja" en la Figura 1). La trampa óptica holográfica está construido alrededor de una nm láser DPSS 1064. El haz...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Optical table	Newport corporation	ST-UT2-56-8	Irvine, CA
Microscope, Inverted, Eclipse Ti	Nikon USA	MEA53220	Melville, NY
Plan apo 100X oil objective (1.4 NA)	Nikon USA	MRD01901	Melville, NY
Oil condenser Lens 1.4 NA	Nikon USA	MEL41410	Melville, NY
EMCCD camera	Andor technology USA	Ixon DU897	South Windsor, CT
1/3" CCD IEEE1394 camera	NET USA Inc	Foculus FO124SC	Highland IN
Laser, TEM00, SLM, 1,064 nm wavelength	Klastech Laser Technologies	Senza-1064-1000	Dortmund; Germany
laser diode, TEM00, SLM, 980 nm	Axcel Photonics	BF-979-0300-P5A	Marlborough, MA
laser diode mount	ILX Lightwave	LDX-3545, LDT-5525, and LDM-4984	Bozeman, MT
adjustable fiber ports	Thorlabs	PAF-X-11-B	Newton, NJ
holographic system	Arryx	HOTKIT-ADV-1064	Chicago, IL
holographic mirror	Boulder Non-linear Systems	this is a part of HOTKIT-ADV-1064	Lafayette, CO
Calcite polarizer	Thorlabs	GL10-B	Newton, NJ
half-wave plate	Thorlabs	WPH05M-1064	Newton, NJ
Polarizer rotation mount	Thorlabs	PRM1	Newton, NJ
half-wave plate rotation mount	Thorlabs	RSP1	Newton, NJ
Shutter	Thorlabs	SH05	Newton, NJ
dichroic mirrors (DM2 & DM3); 45 ° AOI	Chroma Technology	t750spxrxt	Bellows Falls, VT
dichroic mirror (DM1); 45 ° AOI	Thorlabs	DMSP1000R	Newton, NJ
custom mechanical adapter	Thorlabs	SM1A11 and AD12F with enlarged inner bore	Newton, NJ
notch filter	Semrock	FF01-850/310-25	Rochester, NY
Acousto-Optic deflector (2-axis)	intraAction	DTD-584CA28	Bellwood, IL
goniometric stage	New Focus	9081	Santa Clara, CA
60 mm steering lenses	Thorlabs	LA1134-B	Newton, NJ
16 mm aspherical expander lens	Thorlabs	AC080-016-C	Newton, NJ
175 mm expander lens	Thorlabs	LA1229-C	Newton, NJ
Spot blocker (cabron-steel sphere)	Bal-Tec	0.0100" diameter	Los Angeles, CA
Microspheres (Carboxyl-polystyrene)	Spherotech	CP-45-10	Lake Forest, IL