La<em&gt; En ovo</em&gt; CAM-ensayo como un Xenograftmodel para el sarcoma

Resumen

La In ovo Membrana corioalantoidea (CAM) se injerta con sarcoma de tejidos frescos derivados del tumor, sus suspensiones de células individuales, y estableció líneas celulares de sarcoma etiqueta fluorescente permanentes y transitorios. El modelo se utiliza para estudiar injerto (viabilidad, índice de proliferación Ki67, la necrosis, la infiltración) y el anfitrión (la infiltración de fibroblastos, crecimiento vascular) comportamiento.

Resumen

El sarcoma es una enfermedad muy rara que es de naturaleza heterogénea, todos obstaculicen el desarrollo de nuevos tratamientos. Pacientes con sarcomas son candidatos ideales para la medicina personalizada después de la estratificación, que explica el interés actual en el desarrollo de un modelo de xenotrasplante reproducible y de bajo costo para esta enfermedad. La membrana corioalantoidea de pollo es un anfitrión inmunodeficiente natural capaz de sostener los tejidos y las células injertadas sin restricciones específicas de la especie. Además, es de fácil acceso, manipulado y fotografiado usando microscopía estereoscópica óptica y de fluorescencia. Histología permite un análisis más detallado de las interacciones celulares heterotípicos.

Este protocolo se describe en detalle la in ovo de injerto de la membrana corioalantoidea con sarcoma de tejidos frescos derivados del tumor, sus suspensiones de células individuales, y la etiqueta fluorescente establecidos líneas celulares de sarcoma permanentes y transitorios (Saos-2 y SW1353). La rata de supervivencia de los pollueloses son hasta un 75%. El modelo se utiliza para estudiar injerto (viabilidad, índice de proliferación Ki67, la necrosis, la infiltración) y el anfitrión (la infiltración de fibroblastos, crecimiento vascular) comportamiento. Para localizada injerto de suspensiones de células individuales, ECM gel proporciona ventajas significativas sobre los materiales inertes de contención. El índice de proliferación Ki67 se relaciona con la distancia de las células de la superficie de la CAM y la duración de la aplicación sobre la CAM, este último la determinación de un marco de tiempo para la adición de productos terapéuticos.

Introducción

El sarcoma es un tumor poco frecuente de los tejidos conectivos con una alta mortalidad por ^1,2 resistencia a la terapia. El progreso en la supervivencia del paciente se ve obstaculizada por su baja incidencia anual, su amplia diversidad, y el hecho de que las células del sarcoma son reportados a ser difícil de cultivo in vitro ^3,4.

El uso de células cultivadas para la evaluación de la terapia preclínica ha puesto de manifiesto que, aparentemente nuevas moléculas activas in vitro no siempre reflejan los resultados en el entorno clínico. Por otra parte, las aberraciones del genoma reveladas por las matrices de expresión génica no siempre son correlacionados con características de comportamiento del tumor en el paciente individual ^5-7. Con el fin de tratar de resolver estos problemas, la medicina personalizada ha ganado en importancia, lo que se refleja en el aumento de búsqueda de modelos de xenoinjertos ^8-12.

Un ensayo in vivo tiene la ventaja de reflejar la compleja interacción entre cÁNCER células y el medio ambiente tejido del huésped en los tumores sólidos, que sean necesarias para la proliferación del cáncer y la invasión ^13. Actualmente se estudia el uso de la prueba de la membrana corioalantoides (CAM-ensayo) como un modelo de xenotrasplante reproducible para el sarcoma ^14,15. Este ensayo es ampliamente utilizado para el estudio de la angiogénesis tumoral ^16,17. En la literatura, sin embargo, hemos encontrado diferentes protocolos para este ensayo, mientras que otros estudios se observó una marcada diferencia en el crecimiento o la angiogénesis de acuerdo con diferentes protocolos de ^18,19.

En este artículo se investiga el efecto de la variación de las condiciones del ensayo-CAM en el comportamiento celular mediante injertos tumorales, suspensiones de células individuales derivados del tumor y los cultivos celulares de sarcoma establecidos.

Protocolo

Ver Figura 1 para una visión general

Material tumoral

1. Obtención y preparación de las muestras tumorales

Para el uso de material del paciente, es necesario la aprobación del Comité de Ética y consentimiento informado tiene que ser obtenida del paciente.

1. Material de cosecha representante (mínimo 1 cm ³⁾ en el momento de la intervención, ya sea una biopsia o una resección de un sarcoma. El lugar adecuado de la biopsia se define utilizando dinámica de contraste de resonancia magnética.
2. Coloque el material inmediatamente en un vial estéril que contiene DMEM suplementado con 1.000 U de penicilina y 1 mg / ml de estreptomicina.
3. Transporte el vial inmediatamente (30-90 min) al laboratorio.

Todos los siguientes procedimientos se realizan bajo un flujo laminar.

4. Verter el contenido del vial en una placa de Petri estéril.
5. Coloque la muestra de tumor en pequeñas partes de máximo 1 mm ³ utilizando un bisturí estéril. Retire todas las partes calcificadas ya que tienden a deteriorar aún más el procesamiento del tejido.
6. Tomar al azar 10 injertos tumorales para su aplicación en la CAM.

2. Preparación de derivados del tumor Suspensiones sola célula

Duración aproximada: 3 horas

1. Pesar el tejido restante de la muestra.
2. Ponga 2 - puede ser necesario 4 g de tejido en un tubo de disociador, más de un tubo de digerir todo el tejido tumoral restante.
3. Para la digestión de 2 - 4 g de tejido, añadir 2,5 ml de solución de colagenasa 2 (500 U / ml de RPMI 1640) y 2,5 ml de solución de DNasa (22 KU / ml de RPMI 1640).
4. Procesar el tejido de acuerdo con el protocolo h_tumor disociador. Esto implica 2 ciclos de incubación a 37 ° C en CO ₂ incubadora mientras que el tubo se agita suavemente durante 30 min.
5. Se filtra la suspensión restante a través de un filtro de células de 150 micras.
6. Se centrifuga el lisado a 1.000 rpm durante 5 millasn.
7. Eliminar el sobrenadante.
8. Resuspender el precipitado en 10 ml de tampón de lisis de eritrocitos (ELB), permitiendo 10 minutos de incubación con suspensión regular.

Nota: tampón de lisis de los eritrocitos se fabrica de la siguiente manera: Añadir 0,037 g de EDTA, 0,99 g de K ₂ HPO _4, 8,29 g de _NH4Cl a 1000 ml de agua, usar NaOH 10 N para ajustar el pH a 7,3, filtro bajo presión a través de unas 0,22 micras filtrar. Almacenar a 4 ° C.

9. Añadir 25 ml de medio de cultivo (DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina) para detener la reacción.
10. Centrifugar la suspensión a 1000 rpm durante 5 min. El color de la pastilla debe ser blanco ahora.
11. Eliminar el sobrenadante.
12. Añadir 5 ml de medio a la pastilla. Se filtra la suspensión a través de un filtro de células de 70 micras.
13. Contar el número de células vivas / ml por medio de un contador de células automático.

3. CLíneas celulares Ancer

SAOS2 células de osteosarcoma (número de registro ATCC: HTB-85) que expresan la proteína verde fluorescente se sometieron a electroporación por el vector pEGFP-C1 usando la Línea Celular Nucleofector Kit de V de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para establecer líneas celulares estables, las células transfectadas se seleccionaron en G418 (1 mg / ml) durante 4 semanas de acuerdo con el protocolo establecido anterior ^20. Además clasificación se llevó a cabo por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las células de la línea celular SW1353 condrosarcoma (número de registro ATCC: HTB-94) o suspensiones de células individuales tumorales recién preparados están etiquetados utilizando una membrana lipofílica fluorescente mancha roja.

1. Retire las células del frasco de cultivo de una manera clásica usando tripsina (0,5% peso / volumen) de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; 0,2% en peso / vol) de solución.
2. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 1000 rpm.
3. Retire el supernatant.
4. Añadir 1 ml de medio libre de suero y 5 l Dil (Vybrant rojo) / 10 ⁶ células.
5. Envuelva el vial en papel de aluminio y colocarlo en la incubadora de CO ₂ durante 10 minutos a 37 ° C.
6. Se centrifuga de nuevo durante 5 min a 1000 rpm y eliminar el sobrenadante.

Ensayo de membrana corioalantoidea

1. La incubación del huevo

1. Se requieren huevos fertilizados de un criadero local comercial garantiza el 95% de fertilización de los huevos.
2. Los huevos fertilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta por 10 días.

Nota: antes de comenzar la incubación, la suciedad, las plumas y excrementos se retiran cuidadosamente de las cáscaras de huevo mecánicamente por lavado en seco con toallas de papel, que tienen un duro en lugar de una estructura de superficie blanda. Limpieza de los huevos con 70% de etanol desnaturalizado o cualquier otro reactivo de limpieza reduce significativamente la tasa de supervivencia de los embriones de pollo.

3. Ponga los huevos en la incubator en un lado, marcando la superficie superior. El día en el que los huevos se ponen en la incubadora se designa 0 días de desarrollo embrionario.
4. Ajuste la temperatura de incubación a 37,8 º C, y la humedad al 47%. Asegúrese de que la opción de rotación automática está desactivada.

2. Apertura de los huevos

Duración: ± 60 min para 25 huevos

En el día 3 de desarrollo, los huevos se abren bajo flujo de aire laminar. Abrir los huevos en una etapa de desarrollo más resultados en daños a la CAM, como la membrana tiende a pegarse a la cáscara. Una lámpara de infrarrojos se utiliza para mantener los huevos calientes durante el procedimiento. Para mejorar la esterilidad, se recomienda el uso de guantes de la mano.

1. Coloque el huevo en la huevera, con el lado marcado hacia arriba.
2. Bajar el nivel de la CAM mediante la eliminación de dos ml de albúmina a través de una aguja de 18 G insertado en la punta del huevo. Si la aguja no está afilada después de perforar varioscáscaras de huevo, cambiar la aguja. Si no es así, el exceso de fuerza tiene que ser ejercida, lo que podría dañar la yema de huevo o la fractura de la cáscara. A veces, la aguja está bloqueado por la chalaza, uno de 2 bandas espirales de suspensión de la yema en la albúmina. Esto se puede resolver, presionando suavemente el émbolo hacia abajo hasta que se resuelva el bloque. Si la yema de huevo es aspirado en la jeringa, reemplazar la aguja, así como la jeringa. A veces, el embrión muere después de este evento. Si se elimina una cantidad insuficiente de la albúmina, la CAM se daña cuando se quita la cáscara.
3. Aplicar una película adhesiva semipermeable en el lado superior marcada de la cáscara con el fin de evitar que se derrame de partículas de conchas en la CAM, mientras que el corte de la ventana.
4. Hacer un agujero de introducción con un punzón pequeño en la superficie del huevo.
5. Cortar una ventana de 1 cm ² en el depósito, con un par de tijeras quirúrgicas puntiagudos estériles.
6. Corazón palpitante del embrión y vasos adyacentes se pueden observar en el thsuperficie e de la yema de huevo. Retire los huevos no fertilizados o embriones muertos. Un aspecto interrumpida de los vasos sanguíneos caracteriza embriones muertos.
7. Selle la ventana con una película adhesiva semipermeable. No es necesario para cubrir el sitio de punción, a menos que la cáscara se ha agrietado durante la inserción de la aguja.

3. Procedimiento de inoculación

Duración: ± 1 hora por cada línea celular

En el desarrollo de embriones de pollo día 9, los huevos se inoculan bajo flujo de aire laminar.

Evaluación de las células de cáncer de difusión a través de la CAM requiere la contención de las células a una superficie limitada durante la inoculación. Matrigel es una matriz (ECM) de gel extracelular del sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm utilizado con frecuencia en condiciones de cultivo celular experimentales. Se trata de un líquido cuando se enfría, pero sufrirá polimerización térmicamente activado cuando se pone a 20 - 40 º C, formando de esta manera un gel estable. Durantelos experimentos, Matrigel se mantiene en una caja que contiene la fusión del hielo.

Nota: Insistimos en no utilizar cubreobjetos perforadas. Se observó unión y el crecimiento de las células cancerosas injertadas en el disco de plástico de desviación por lo tanto el potencial de crecimiento de las células de la propia membrana.

1. Resuspender el sedimento celular en gel de ECM enfriado a una concentración de 10 ⁶ células/100 gel de ECM l. Mantener esta solución en la fusión del hielo.
2. Impuestos Especiales parte de la membrana semipermeable con un par de quirúrgica estéril bajo flujo de aire laminar. Si la película de adhesivo se elimina por completo, esto se traducirá en una mayor proporción de la muerte del embrión debido a la contaminación.
3. Toque la derecha CAM por debajo de la ventana de shell suavemente con una varilla de vidrio estéril, con el fin de eliminar la capa de células epiteliales. Tocar la CAM con una varilla de vidrio estéril demuestra ser menos traumática que el uso de un bisturí n º 11, que requiere más destreza y experiencia. Pueden producirse hemorragias pequeñas.
4. Ladding material tumoral.
5. Por injertos tumorales: baje suavemente una pieza de tejido en la CAM con un par de pinzas estériles, sin apretar.
6. Para el procedimiento de gel de ECM: 4x Añadir 25 l de la suspensión celular del gel-ECM a la CAM, en la parte superior de uno al otro, permitiendo que el gel de ECM para polimerizar entre las aplicaciones. De esta manera se crea una placa adherente que contiene las células cancerosas.
7. Selle la ventana del shell de nuevo con una película adhesiva semipermeable.

4. Imágenes y recolección de la CAM

Duración: 2 horas para 25 huevos

En el desarrollo de embriones de pollo 16 días, las CAM se cosechan. Trabajando bajo flujo de aire laminar no es necesario.

1. Amplíe la ventana con un par de tijeras quirúrgicas. Asegúrese de no cortar demasiado, de lo contrario la CAM se dañará, lo que resulta en el sangrado de los vasos lesionados.
2. Agregar 300 - 500 l de PBS ^D con una pipeta sobre la secta CAMde iones que contiene el material inoculado. Si no se usan sondas fluorescentes, formaldehído tamponado puede ser utilizado como esto hace que la membrana más rígida, lo que facilita el corte de la membrana.
3. Hacer una fotografía de la CAM en el huevo a través de un microscopio de fluorescencia estéreo, equipado con una cámara digital en color, utilizando tanto la GFP o el filtro de DSR, y sin filtro. Para los injertos tumorales, todas las fotografías se toman sin filtros. Iluminación desde arriba por las luces LED se recomienda durante la fotografía (Figura 2).
4. Registro de migración de células tumorales de las células marcadas. Las fronteras de los tumores pueden ser irregulares y deshilachados. Células aisladas pueden estar presentes cerca de los límites del tumor. En algunas muestras, se pueden observar las filas de las células tumorales (Figura 3).
5. Cortar la membrana con un par de tijeras estériles en la frontera se extiende contra la cáscara.
6. Coloque la CAM recolectadas en una placa de Petri estéril llena con PBS ^D o tamponada paraformaldehído.
7. Hacer una fotografía de tanto el lado superior y el lado inferior de la CAM, con y sin filtro.
8. Colocar la membrana en un recipiente etiquetado con formaldehído tamponado durante al menos 72 horas.
9. Insertar las CAM en parafina y prepararlos para el examen histológico. Tener cuidado para cortar los injertos tumorales en el centro del nódulo, asegurándose de que la superficie de corte es paralelo a la parte inferior de la casete. Si no, la interacción entre la leva y el injerto del tumor no será visible. La misma estrategia se aplica a las placas de gel de ECM: la superficie que mira hacia la cuchilla de corte debe ser perpendicular a la placa.

5. Evaluación Histológica

Tinción Hematoxilina-Eosina y Ki-67 inmunohistoquímica se realizaron para cualquier aclaración, si es necesario. La inmunohistoquímica se realizó sobre secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina de 3,5 m de espesor, utilizando una tinción de portaobjetos automatizada segúna las instrucciones del fabricante. Se utilizó un anticuerpo monoclonal primario de ratón para Ki-67 (clon MIB-1, dilución 1/100). El calor inducido por recuperación del epítopo se realizó mediante acondicionamiento de células 1, y la visualización se logró con el Kit de detección de DAB universal, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Deshidratación de las secciones de tejido se realizó utilizando un cubreobjetos automatizado.

Para la las líneas de células SW1353 SAOS2 y, el número de células Ki67-positivo-negativo y Ki67 nuclei/100 ² micras fueron contados en tres zonas: una cerca de la frontera de la CAM, uno cerca de la superficie y uno en el centro de la placa de gel de ECM. Este procedimiento se repitió 6 veces para cada diapositiva Ki-67 manchado. El índice de proliferación se determinó para cada diapositiva dividiendo el número de células Ki67 positivas por el número total de células contadas.

La necrosis se define por una pérdida de dispersión fina de la cromatina en el núcleo de la célula, acompañado por fading de márgenes distintos de células. Para xenoinjertos, la necrosis se anotó como completa, parcial (a menudo en la superficie), o está ausente. La infiltración de células tumorales en la CAM se define por la observación de las células tumorales en el mesodermo de la CAM, y se anotó como presente o ausente.

Tres elementos se anotaron para el comportamiento del sistema. Infiltración de fibroblastos se define como células alargadas dejando la CAM e invadiendo el injerto / placa del tumor, y se anotó como presente o ausente. Crecimiento vascular se puede observar como crecimiento hacia el interior de la proliferación de los vasos de pollo, que se caracteriza por la presencia de eritrocitos de pollo nucleadas.

Resultados

Evaluación de la CAM

Injertos tumorales se vuelven adherentes a la CAM (Figura 2A). Suspensiones de células individuales de material del paciente con frecuencia muestran una placa ligeramente elevada seca (Figura 2D). Después de la escisión de la CAM, marcada arrugamiento de la membrana se produce (Figuras 2E y 2F).

Para las líneas celulares comerciales la placa se hace más opaca en el tiempo,...

Discusión

Tiempo de la inoculación y la cosecha

Medir el tiempo del día de la inoculación se realizó utilizando SAOS2 en gel de ECM (36 CAMs) y varió entre el desarrollo embrionario días 5 y 10.

Antes del día 9 de incubación, la CAM no fue siempre lo suficientemente grande para sostener el gel ECM se aplicó. En la cosecha, las células tumorales a veces tenían que ser recuperados de la CAM más profundo, y algunas muestras de gel ECM yacían sueltos en la albúmina ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line Nucleofector Kit V	Amaxa	VCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)	Sigma Aldrich	C6885
DMEM	Invitrogen	41965-039
DMSO	Sigma	D8418
Dnase solution	Sigma Aldrich	DN25
G418	Invitrogen	11811031
Matrigel	Sigma-Aldrich	E1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67	Dako Denmark	MIB-1
Paraformaldehyde	Fluka	D76240
PBS	Invitrogen	20012019
PBSD	Invitrogen	14040083
peGFP-C1 vector	Clontech	632470
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15140163
RPMI	Invitrogen	22409-015
Trypsin-EDTA solution	Invitrogen	25300054
Vybrant cell-labeling DiI	Lifetechnologies	22885
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
digital color camera	Leica	DFC 340 FX
Digital Egg Incubator	Auto Elex Co	R-COM 50
FACS	BD Biosciences	FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube	Miltenyi Biotech	130-093-237
Gentlemacs Dissociator	Miltenyi Biotech	130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol	Miltenyi Biotech
[header]
semipermeable adhesive film (Suprasorb F)	Lohmann&Rauscher	20468
stereo fluorescence microscope	Leica	M205 FA
Tissue-Tek Film automated Coverslipper	Sakura	6400
ultraView Universal DAB Detection Kit	Ventana Medical Systems Inc	760-500
Ventana Automated Slide Stainer	Ventana Medical Systems	Benchmark XT