Modificación Multi-Escala de implantes metálicos con gradientes de poro, polielectrolitos y su control indirecto<em&gt; En vivo</em

Resumen

En este video, vamos a demostrar las técnicas de modificación de los implantes metálicos porosos para mejorar su funcionalidad y para controlar la migración celular. Las técnicas incluyen el desarrollo de los gradientes de poros para controlar el movimiento celular en 3D y la producción de la membrana basal imita para controlar el movimiento de células en 2-D. Además, un método basado en HPLC para seguimiento de la integración del implante in vivo a través de análisis de proteínas de la sangre se describe.

Resumen

Los implantes metálicos, especialmente los implantes de titanio, son ampliamente utilizados en aplicaciones clínicas. El crecimiento del tejido y la integración de estos implantes en los tejidos son parámetros importantes para los resultados clínicos de éxito. Con el fin de mejorar la integración del tejido, los implantes metálicos porosos han de ser desarrollado. La porosidad abierta de espumas metálicas es muy ventajoso, ya que las zonas de poro se pueden funcionalizar sin comprometer las propiedades mecánicas de toda la estructura. A continuación se describen las modificaciones que utilizan implantes de titanio porosos basados ​​en microesferas de titanio. Mediante el uso de propiedades físicas inherentes, tales como hidrofobicidad de titanio, es posible obtener gradientes de poro hidrófobas dentro de los implantes metálicos basados ​​en microesferas y al mismo tiempo tener un mimético de membrana basal basa en hidrófilos, polímeros naturales. Gradientes de poro 3D están formados por polímeros sintéticos tales como ácido poli-L-láctico (PLLA) por el método de congelación-extracción. 2D nanofibrillar surcaras se forman mediante el uso de colágeno / alginato seguido de una etapa de reticulación con un agente de reticulación naturales (genipín). Esta película nanofibrillar fue construido por capa por capa (LBL) método de deposición de las dos moléculas de carga opuesta, colágeno y alginato. Por último, un implante, donde diferentes zonas pueden acomodar diferentes tipos de células, ya que esto es necesario para muchos tejidos multicelulares, se puede obtener. Por, de esta manera el movimiento celular en diferentes direcciones por diferentes tipos de células puede ser controlada. Tal sistema se describe para el caso específico de la tráquea regeneración, pero puede ser modificada para otros órganos diana. Análisis de la migración celular y los métodos posibles para la creación de diferentes gradientes de poro se elaboran. El siguiente paso en el análisis de dichos implantes es su caracterización después de la implantación. Sin embargo, el análisis histológico de los implantes metálicos es un proceso largo y engorroso, por lo tanto para la supervisión reacción del huésped a los implantes metálicos in vivo una unlternative método basado en el seguimiento de las proteínas sanguíneas CGA y diferente también se describe. Estos métodos se pueden utilizar para el desarrollo in vitro de la migración a medida y las pruebas de colonización y también se pueden utilizar para el análisis de los implantes metálicos funcionalizados in vivo sin histología.

Introducción

Actualmente los implantes metálicos disponibles son adecuados para aplicaciones de carga, pero su no degradabilidad requiere diseños que garantizan una fuerte interfase con el tejido que rodea ^1. Al proporcionar estructuras que facilitan el crecimiento celular y la colonización in vivo, la vida útil de los implantes metálicos se puede prolongar ^2. Implantes metálicos porosos están abiertamente materiales para la ingeniería de interfaz de tejido prometedores y también para garantizar una buena colonización de los implantes. Se han utilizado activamente como implantes ortopédicos y también como implantes traqueales ^3-5. Sin embargo, todavía hay problemas que necesitan ser resueltos, tales como el control preciso sobre el movimiento de las células en las zonas de poro. Falta de control de este proceso podría dar lugar a la colonización incompleta en un extremo y la restenosis en el otro. También es necesario para la consecución de funciones superiores como, la entrega de factores de crecimiento funcionalización adicional de estos implantes,vascularización dirigida y el movimiento simultáneo de diferentes tipos de células ^6-8. Para los implantes traqueales, esto es crucial, ya que es deseable la colonización del implante por un tejido vascularizado. Sin embargo, el tejido no controlada en el crecimiento a la luz de la tráquea no es deseable debido a que disminuye la permeabilidad del implante.

Una posibilidad para controlar el movimiento de la célula es de exclusión de tamaño. Al conocer el tamaño de las células diana y su capacidad para interactuar con un polímero sintético dado es posible desarrollar gradientes de poros que pueden determinar eficazmente la profundidad de movimiento de la célula. Por ejemplo mediante la creación de una arquitectura de poro que es lo suficientemente grande para la entrada de las células del tejido conectivo tales como los fibroblastos extraluminal, pero lo suficientemente pequeñas (menos de 10 micras) para evitar su movimiento intraluminal un control efectivo sobre la colonización de un implante tubular se puede lograr.

De los métodos de creación de poros disponibles, tales como congelación drying, la lixiviación de partículas, gas espumante ^9,10, y el método más fácil de adaptar para la rápida formación de gradientes de poro con mínima cantidad de equipos necesarios se congela y extracción ^11. En este método, una solución de polímero se congela en una mezcla binaria de un disolvente orgánico y agua. Después, el disolvente se intercambia a través de la extracción por un líquido pre-enfriado miscible, tal como etanol. Congelación y condiciones de extracción determinan la forma y el tamaño de los poros y si la extracción se lleva a cabo de una manera donde el movimiento de la solución de extracción puede ser controlado, el tamaño y forma de los poros pueden ser direccionalmente modulada.

Segundo paso para los tejidos multicelulares es la formación de barreras porosas entre diferentes tipos de células para el control de su interacción. Esto también es necesario para la disponibilidad de los distintos microambientes para diferentes tipos de células en función de sus requisitos de ^12,13. Tráquea es un órgano tubular que conecta la laringe con bronquioloi. Tiene un revestimiento de epitelio pseudoestratificado ciliar interior con células caliciformes interdispersados ​​que producen moco. La estructura 3D y la estabilidad de la tráquea se mantiene por el cartílago en forma de C-anillos. Por lo tanto, en una tráquea artificial no debe haber una unión definida entre el tejido conectivo y la capa del epitelio ciliar. Si bien una estructura 3D es necesario para la parte del tejido conectivo, la migración de las células epiteliales requiere una membrana-como sótano superficie para lograr el movimiento direccional y el cierre de la herida. Películas multicapa polielectrolito (PEM) son una opción posible obtener imita la membrana basal. Método de capa por capa (LBL) es un proceso versátil para obtener recubrimientos superficiales delgadas y funcional. Se basa en las interacciones electrostáticas de dos polielectrolitos de carga opuesta y su acumulado en forma secuencial para obtener recubrimientos de superficies a escala nanométrica, cuyas propiedades se pueden variar cambiando simplemente las variables tales como las especies de polielectrolitos, pH,número de la capa, la adición de una capa de cobertura, la reticulación etc Una de las principales ventajas del método LbL es su capacidad para adaptarse a la topografía del sustrato subyacente. Por lo tanto, en condiciones controladas, este método también se puede utilizar para la obtención de cobertura de la superficie de las estructuras porosas. Si colágeno se utiliza como uno de los polielectrolitos es posible obtener estructuras nanofibrillar que pueden imitar la superficie de la membrana basal. La hidrofobicidad de titanio permite el desarrollo de tales estructuras y fibrillarity puede ser preservada en revestimientos gruesos ^14. Archivo adjunto y el movimiento de células en la superficie también se puede controlar esta manera. Mediante el uso de congelación-extracción y recubrimiento de película LbL secuencialmente, una estructura en la que el movimiento de células puede ser controlado lateralmente, longitudinalmente y circunferencialmente se puede obtener ^15.

Aquí se describen dos métodos de modificación novedosos para los implantes de titanio mediante el uso de su comportamiento hidrófobo que puede serextendido a la modificación de diversos implantes porosos: i) formación de gradientes de microporos dentro de los implantes de titanio con macroporosas hidrófobos, polímeros sintéticos ii) la formación de una capa de película polimérica de espesor sobre la superficie del implante que soporta el crecimiento celular y la formación de revestimiento en multicapas de polielectrolitos. Estos métodos se pueden utilizar secuencialmente o por separado. Ellos proporcionan estructuras que aseguran la migración controlada y la organización espacial de los diferentes tipos de células en los tejidos multicelulares ^16,17. Para el caso específico de la tráquea, el resultado deseado para el implante sería la colonización por el tejido fibrovascular dentro de los gradientes de microporos sin reestenosis y la formación del revestimiento interior de las células epiteliales ciliadas en las multicapas de polielectrolitos.

Una forma de controlar la integración de los implantes es hacer pequeñas intervenciones quirúrgicas durante el período de su integración con el host in situ. Con el fin de ser capaz de t• Decidir sobre el momento de las intervenciones, es importante disponer de información sobre los efectos sistémicos de los implantes. Proteína C reactiva (PCR) se ha utilizado para el seguimiento de la infección y la respuesta inflamatoria en el ámbito clínico. Cromogranina A (CGA) también se puede utilizar de una manera similar y podría proporcionar resultados más precisos para observar el nivel de inflamación ^18. Como una posible forma de observar la integración del implante metálico in vivo, se presenta un procedimiento de vigilancia continua de los efectos sistémicos de implante por la caracterización de las muestras de sangre de animales con Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) y la secuenciación de proteínas posterior. Elaboración de este método se puede utilizar para evadir el análisis histológico de punto final normal. Corte histológico de los implantes metálicos es un proceso largo, complicado y costoso y sólo puede ser realizada en puntos de tiempo específicos. Debido a esta razón, bien diseñado pruebas de sangre que proporcionan información sólida acerca de la salud del implante secomo posibles vías para reducir los experimentos con animales a lo dispuesto por las recientes normas de la UE relativas a los experimentos con animales.

Los métodos presentados aquí pueden ser utilizados para mejorar el rendimiento de los implantes metálicos a través de funcionalización o tener una forma alternativa de seguimiento de los implantes existentes.

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Protocolo

1. Preparación de gradientes microporos en implantes metálicos macroporosas

1. Limpiar los implantes (tales como implantes hechos de perlas de titanio de grado médico con un rango de tamaño de micras 400-500, Neyco SAS, Francia) con etanol y luego someter a ultrasonidos en acetona durante 15 min.
2. Diseño y fabricación de moldes de Teflón de acuerdo con el tamaño del implante y la forma (Para los experimentos estándar, se utilizan moldes cilíndricos de 1,5 cm de diámetro con una altura de 2 cm). Los moldes deben ser modular, de modo que las ciertas partes se pueden quitar durante la extracción. Tal diseño del molde asegura el control sobre el proceso de extracción por forzar el movimiento del fluido de extracción de una manera dirigida.
3. Para los implantes tubulares diseñados para reemplazar la tráquea, la estructura debe estar compuesto por tres piezas: i) una parte inferior para determinar el tamaño del implante, ii) un mandril y iii) un núcleo exterior que es extraíble. De esta manera, el gradiente de tamaño de poro se puede formar desde el exterior hacia el interior.
4. Preparar la disolución de polímero sintético (PLLA): Para la solución de PLLA congelación / extracción tiene que estar preparado en una mezcla binaria de dioxano y agua (87:13%, v: v).
5. Calentar la mezcla a 60 ° C con el fin de obtener una solución homogénea. 60 ° C seleccionado, ya que es el límite superior de la resistencia a la temperatura para las jeringas de vidrio de precisión que tiene que ser utilizado para la introducción de la solución en los implantes.
6. Si se utilizan alta concentración (≥ 6%), soluciones de PLLA de alto peso molecular, introducir la solución en el implante inmediatamente después de calentar. De lo contrario la gelificación de la solución se produce sin la inmersión total.
7. Calcular el volumen de la solución de polímero necesaria con respecto a la porosidad del implante, para el cambio de precisión en el volumen de la solución congelada puede ser tenido en cuenta.
8. Introducir la solución en los implantes con jeringas de vidrio de precisión con exactitud de 0,1 l. El límite inferior para la concentración de polímero es3% para la formación reproducible gradiente de poro mientras que se hace difícil obtener una distribución homogénea en las muestras gruesas por encima de 6%. Sin embargo, para las aplicaciones específicas se pueden utilizar otras concentraciones.
9. Congelar las muestras ya sea directamente a -80 ° C o con un período de incubación previa de 30 min a temperatura ambiente. Condiciones de congelamiento determinar parcialmente la formación de poros, por lo tanto las condiciones de congelación se pueden ajustar de acuerdo con la porosidad dirigida. Mantener las muestras durante la noche a -80 ° C.
10. Extracción: Sumergir los implantes en 80% EtOH enfriado previamente. Llevar a cabo la extracción a -20 ° C durante la noche. Para obtener la porosidad gradientes, retire todas las partes del molde, excepto el mandril para los implantes tubulares y todas las partes excepto la parte inferior de los implantes en forma de disco. Utilice un bisturí previamente enfriado para facilitar la separación del molde.
11. Después de la extracción a -20 ° C durante la noche ^19, retirar las partes de molde restantes y secar al aire los implantes. Para la caracterización de losla porosidad global de la estructura de mercurio análisis porosímetro es necesario. Porosímetro de mercurio mediciones mostraron picos distintos que corresponden a los poros en los dos lados del implante y los poros más pequeños interdispersados. Sin embargo, los datos más crucial es la diferencia entre las porosidades de las superficies intraluminales y extraluminal, que pueden ser analizadas por Image J para la distribución de tamaño de poro con un microscopio electrónico de barrido (SEM) ^20. Para la verificación del gradiente de poro, congelar-fracturar las muestras y observar la sección transversal con SEM.
12. Debido a la naturaleza porosa abierta de los implantes utilizados y la capacidad de reflejar la luz de titanio, es posible hacer z-pilas de células marcadas dentro de los implantes porosos. Etiquetar las células con PKH26 o calceína-AM y visualizar los implantes con microscopía láser confocal.

2. Recubrimiento de superficie de los implantes metálicos porosos con Multilayers colágeno / alginato

1. Para la acumulación dede multicapas, se obtiene mayor reproducibilidad con los robots de inmersión. Sin embargo, si un robot de inmersión no está disponible en estos pasos se pueden realizar manualmente.
2. Uso de grado médico de colágeno de tipo I y alginato de sodio. Las concentraciones optimizadas son 0,5 g / L para cada uno en 150 mM de NaCl en tampón de citrato a pH 3,8.
3. Disolver la solución de colágeno durante la noche para garantizar la homogeneidad de la solución. PH ácido de 3,8 es necesaria para la acumulación estable de las capas como la estructura es inestable antes de la reticulación en pH neutro.
4. Depositar las capas por un sistema de robot de inmersión mediante la inmersión de los implantes en soluciones de colágeno y alginato alternativamente. Tiempo de deposición es de 15 minutos para cada capa posterior. Enjuague en la estructura entre los pasos de deposición con 150 mM de NaCl a pH 3,8 durante 5 min.
5. Diseño titular concreto para la utilización de los implantes con los robots de inmersión utilizados en la producción de múltiples capas polielectrolito. Depositar las capas en la superficie de cualquiera de titanio sólo implates o implantes modificados como se describe en la sección 1.
6. La estabilización de la membrana basal imitan con genipina: Preparar la solución de reticulación en un sulfóxido de dimetilo (DMSO) / tampón de citrato (150 mM de NaCl, pH 3,8) a 01:04 v: v relación. Una amplia gama de concentraciones se puede utilizar y 100 mM es adecuada para la reticulación. Disolver genipín primero en el componente de DMSO y añadir el componente de agua más tarde para evitar la formación de grumos.
7. Reticular las muestras por la inmersión en la solución de reticulación entre 12-24 horas. Después enjuague con copiosa cantidad de tampón de citrato (pH 3,8).
8. Después de etapas de lavado, esterilizar las muestras ya sea con el tratamiento UV (30 min) o un baño de antibiótico / antimicótico (penicilina / estreptomicina, Fungizone).
9. Los principales parámetros que determinan la calidad de la membrana basal son imitan su espesor y el diámetro de las fibras. Calcular los diámetros de las fibras mediante microscopía de imágenes de Fuerza Atómica (AFM) obtenidos en el modo de contacto. Secar las muestras con unaflujo de nitrógeno antes de formación de imágenes. Cuantificar el espesor de al menos 10 fibras por imagen para determinar el grosor medio de las fibrillas con el software Image J.
10. El espesor de las películas puede ser determinada por ensayos de rayado utilizando AFM. Dry (COL / ALG) ₂₄ películas de múltiples capas / COL. Utilice una aguja de la jeringa a la altura de la película. Después de la localización del cero con un microscopio de luz, obtener imágenes de AFM de 10 x 10 micras ² superficies en el límite del cero. Calcular las alturas de los perfiles obtenidos con el software AFM, que proporciona el espesor de la capa de película.

3. Monitoreo indirecta de la integración del implante in vivo mediante el análisis de plasma de la sangre

1. Todas las aprobaciones necesarias del comité se deben tomar para la experimentación animal de acuerdo con las normas que rigen en cada país ^21. En nuestro caso, la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Research Council, 2010) es seguido y thse obtiene la aprobación e del comité de ética de la Universidad de Estrasburgo.
2. Llevar a cabo la implantación en el sitio diana. El protocolo de monitoreo de sangre que aquí se utilizó para el reemplazo traqueal en conejos blancos de Nueva Zelanda de una resección traqueal 15 mm.
3. Tras la implantación de un seguimiento diario es necesario, como montioring el bienestar de los animales (cicatrización alrededor de los sitios quirúrgicos, la frecuencia respiratoria) en general, el registro de su peso.
4. Para validar la prueba de sangre, use un método bien establecido, como las pruebas de ELISA para los niveles de PCR en sangre. Pruebas de PCR para muchos animales están disponibles y la prueba específica utilizada para los conejos se muestran en la Tabla 1. Del mismo modo, utilizar el Western Blot para la determinación de los niveles de CGA. Anticuerpos anti-CGA monoclonales (anti-CGA _47-68) fueron utilizados en este protocolo.
5. Para la caracterización de plasma, obtener muestras de sangre de las venas auriculares de los conejos. Centrifugar a 5000 rpm durante 20 min a 4 °; C. Usar el sobrenadante obtenido para el análisis. En nuestro procedimiento, estas pruebas se realizan una vez por semana, pero las pruebas más frecuentes son también posibles.
6. HPLC en fase inversa de purificación del contenido de proteínas de plasma: Extraer el plasma de conejo con 0,1% de ácido trifluoroacético (1:1, v: v). Se purifica el extracto, utilizando un sistema de HPLC Dionex (Ultimate 3000; Sunnyvale, CA, EE.UU.) en una fase inversa Nucleosil-300-5C18-columna (4 x 250 mm, tamaño de partícula 5 micras; porosidad, 300 Å).
7. Leer la absorbancia a 214 y 280 nm. El sistema disolvente utilizado es i) Disolvente A: 0,1% (v / v) de ácido trifluoroacético (TFA) en agua y ii) Disolvente B: 0,09% (v / v) de TFA en 70% (v / v) acetonitrilo-agua.
8. Utilice una velocidad de flujo de 700 l / min utilizando gradientes de eluciones. Recoger las fracciones de los picos. Se concentran las fracciones mediante evaporación por aplicación de velocidad-vacío. Es importante para detener la velocidad-vacío antes de sequedad completa.
9. Relacionar los picos obtenidos en diferentes puntos de tiempo durante el course del período de implantación. Usa los péptidos purificados que están mostrando tendencias consistentes durante el curso de la implantación para la identificación por secuenciación automática de Edman.
10. La secuenciación automática de Edman de los péptidos: Determinar la secuencia N-terminal de los péptidos purificados por degradación automática de Edman utilizando un microsecuenciador Procise. Cargar la muestra a los filtros de fibra de vidrio tratados con polibreno. El siguiente paso es la identificación de ácidos feniltiohidantoına-amino-Xaa (PTH) por cromatografía en una columna de C ₁₈ (PTH C-18, 2,1 x 200 mm) ^22. Después se obtiene la secuencia, que puede ser identificado por el software usando BLAST base de datos Swiss-Prot.

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Resultados

La formación de gradientes de poro

Mediante el cambio de la concentración de la solución de PLLA, es posible controlar el tamaño de los poros en el lado extraluminal de los implantes. Tamaño y forma de los poros se vio afectada significativamente por la presencia de los implantes de titanio (Figuras 1a y 1b). Tamaños de los poros oscilaron desde 40 hasta 100 micras y la utilización de concentraciones más bajas resultaron en poros más pequeños. Conside...

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Discusión

Gradientes de poro son herramientas importantes en la ingeniería de tejidos interfaz y el sistema descrito aquí se pueden usar solos o en combinación con implantes metálicos para formar gradiente de poro para estudiar la migración celular. El sistema no requiere ninguna configuración adicional o equipo adicional, excepto una campana de extracción química para manejar disolventes orgánicos, por lo tanto, se puede aplicar en los laboratorios de biología. Polímeros similares, tales como poli (ácido glicólico) ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Dioxane	Sigma-Aldrich	360481	Toxic material, Strictly under chemical hood
PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g	Sigma-Aldrich	94829, 81273	The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.
PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate)	Novamatrix	4200006	Low viscosity(20-200 mPa.s)
Collagen type I (Bovine)	Symatese	CBPE2US100
Pen/Strep, Fungizone	Promocell	C42020
Genipin	Wako	0703021
Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1.	Bruker	MSCT
Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0%	Sigma-Aldrich	302031	Hazardous Material, Please follow MSDS carefully
Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9%	Sigma-Aldrich	34998
Calcein-AM	Invitrogen	C3100MP
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL
Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit	Genway Bio	GWB-9BF960
DMSO, Bioreagent, ≥99.7%	Sigma-Aldrich	D2650
Equipment
Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope	Bruker
Procise microsequencer	Applied Biosystems
Ultima 3000 HPLC system	Dionex
Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100	Hitachi
Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510	Zeiss
Table 1. List of Materials and Reagents.