Diferencias Evaluación de Capacidad Competitiva de espermatozoides en<em&gt; Drosophila</em

Resumen

Diferencial espermatozoides capacidad competitiva entre Drosophila Machos con genotipos distintos se pueden determinar a través de experimentos de doble contacto. Cada uno de estos experimentos consiste en uno de los machos de interés y un macho de referencia. Marcadores fácilmente identificables en la progenie permiten la inferencia de la fracción de individuos engendrados por cada macho.

Resumen

La competencia entre los machos conespecíficos para fertilizar los óvulos es uno de los mecanismos de selección sexual, es decir, selección que opera en maximizar el número de eventos de apareamiento con éxito en lugar de sobre la supervivencia y la maximización de la viabilidad ^1. La competencia de esperma representa la competencia entre los machos después de copular con la misma hembra ^2, en el que sus espermatozoides son coincidentes en el tiempo y el espacio. Este fenómeno se ha informado en varias especies de plantas y animales ^3. Por ejemplo, silvestres D. hembras melanogaster por lo general contienen esperma 2-3 machos ^4. Los espermatozoides se almacenan en órganos especializados con limitada capacidad de almacenamiento, lo que podría dar lugar a la competencia directa de los espermatozoides de diferentes machos ^2,5.

Comparando los espermatozoides capacidad competitiva de los diferentes machos de interés (tipos masculinos experimentales) se ha realizado a través de la experimentación de doble acoplamiento controladots en el laboratorio ^6,7. En pocas palabras, una sola hembra está expuesto a dos machos diferentes consecutivamente, uno masculino experimental y un macho de referencia cruzada de apareamiento. El mismo esquema de apareamiento es seguido utilizando otros tipos masculinos experimentales, facilitando así la comparación indirecta de la capacidad competitiva de su esperma a través de una referencia común. La fracción de individuos engendrados por los machos experimentales y de referencia se identifica usando marcadores, que permite estimar la capacidad competitiva de espermatozoides usando expresiones matemáticas simples ^7,8. Además, la capacidad competitiva de esperma puede ser estimado en dos escenarios diferentes dependiendo de si el macho experimental es segundo o primero para aparearse (delito y ensayo de defensa, respectivamente) ^9, que se supone que ser el reflejo de diferentes atributos de competencia.

Aquí se describe un método que ayuda a interrogar al papel de los diferentes factores genéticos que supuestamente subyacen tque fenómeno de la capacidad competitiva de esperma en D. melanogaster.

Introducción

Desde Geoff Parker señaló que la prevalencia de la competencia espermática en los insectos y sus implicaciones evolutivas ^2, una oleada de estudios en Drosophila y otras especies han tratado de arrojar algo de luz sobre este fenómeno en muchos niveles diferentes. Algunos ejemplos de las áreas de interés han sido el estudio de la variación de las poblaciones naturales de ^9,10, su arquitectura genética subyacente y la relevancia de los factores genéticos ^11-14, y su papel en la coevolución entre los sexos ^15,16 conducción. En D. hembras melanogaster, la capacidad limitada de los órganos de esperma de almacenamiento especializados, un par de espermateca y el receptáculo seminal ^6,17, contribuye a la competencia de los espermatozoides de diferentes machos. Aproximadamente 1.500 espermatozoides se transfieren durante el apareamiento de la hembra, pero sólo ~ 500 pueden alojarse en los órganos mencionados ^18,19. En el laboratorio, controlado, doble acoplamiento experimentalciones que implican un hombre de referencia y uno o más machos de interés se han utilizado ampliamente para evaluar la capacidad competitiva de espermatozoides ^7,8.

Capacidad competitiva de esperma se calcula como la proporción de la progenie engendrado por el macho experimental en los experimentos de doble acoplamiento sobre la progenie total, es decir que a partir de tanto el grupo experimental y los machos de referencia. Capacidad competitiva de esperma comprende dos componentes, cada uno de ellos evaluado en un ensayo separado. En el ensayo de infracción, la capacidad del esperma masculino experimental para desplazar el esperma desde el primer macho, es decir, el macho de referencia, se evalúa. Por el contrario, en el ensayo de defensa, la capacidad del esperma masculino experimental para resistir el desplazamiento o para reducir el éxito de la fertilización de la esperma masculino referencia se evalúa. Dependiendo del tipo de ensayo, la defensa o ataque, la capacidad competitiva de espermatozoides se calcula a través de las puntuaciones de _P1 o _P2, respectivamente. P₁ y P ₂ sólo puede tomar valores entre 0 y 1. Los valores intermedios suelen interpretarse como evidencia indirecta de semen mezclado, lo que sugiere una situación fisiológica que implica la competencia de esperma directa. Siguiendo el mismo razonamiento, valores extremos pueden ser interpretados como evidencia de la fuerte diferencial de esperma capacidad competitiva. Los primeros estudios mostraron que P ₂ en D. melanogaster es más de 0.8 aumentando a medida que el tiempo transcurrido entre los dos apareamientos alarga ^7. Este mismo diseño experimental se ha utilizado en otras especies de Drosophila, P ₂ siendo la estadística comúnmente utilizado en los estudios para evaluar la capacidad competitiva de esperma ^20. Para la mayoría de las especies, los valores de P ₂ de las cepas ensayadas es mayor que 0,6 ^21. Sin embargo, otros mecanismos no relacionados con la competencia directa entre los espermatozoides de diferentes machos pueden producir resultados idénticos (ver Discusión).

Dprogenie istinguishing engendrado por los primeros o segundos machos es posible mediante el uso de marcadores fácilmente identificables. En los primeros estudios, uno de los machos se irradió a dosis subletales de, por ejemplo, rayos-X de tal manera que prácticamente todos los óvulos fertilizados por el esperma irradiado no eclosionó ^7. Posteriormente, las mutaciones que alteran la pigmentación de los ojos o la forma del ala han sido los marcadores más utilizados. Ejemplos de los primeros son las mutaciones de peso corporal (marrón) ^9, cn (cinabrio) y ²² W (blanco) ^23, mientras que la mutación Cy (rizado) ²⁴ se corresponde con el segundo tipo de fenotipos; algunas de estas mutaciones se han combinado en el mismo individuo, por ejemplo, cn peso corporal. En menor medida, alozimas ²⁵ y microsatélites ^26,27 con patrones de herencia conocidos también se han utilizado.

El diseño experimental para probar las diferencias encapacidad competitiva de esperma se describe aquí sigue esencialmente el de Clark et al. ^9. Los resultados derivados de estos experimentos dan información únicamente acerca de la paternidad diferencial de los tipos masculinos experimentales bajo escrutinio. Los ensayos, que también tienen en cuenta las diferencias después de la fertilización en la aptitud ^14,28 y técnicas de visualización de esperma ²⁴ permiten a las diferencias en P ₁ o P ₍₂₎ resultados sean interpretados como diferencias en la competencia espermática.

La figura 1 resume los fundamentos tanto de la infracción y los ensayos de defensa. Para ilustrar la logística del proceso, un experimento delito lleva a cabo en D. melanogaster ¹⁴ se explicará en detalle. Este ensayo delito en particular se utilizó para la prueba de un efecto mensurable de la familia de cadena intermedia dynein esperma específico multigénica (SDIC) de la capacidad competitiva de esperma. Todo el miembros de esta familia multigénica residen en tándem en el cromosoma X. Machos Knockout se generaron mediante la supresión de la agrupación NaDCC. Debido a que el segmento eliminado también incluye el gen esencial ala corta (SW) y el propósito del estudio fue evaluar la relevancia de NaDCC, los machos que llevan la deleción NaDCC-sw fueron rescatados por una copia transgénica de sw (simbolizado como P {sw} , que también llevó a un gen reportero mini-blanco) en el cromosoma 2. Mis ojos se utilizó como un marcador visible para la identificación de paternidad. Todas las moscas estaban en un mutante de fondo blanco con la excepción de los de la cepa Oregon-R, que se utilizaron como referencia los machos.

Protocolo

Experimentos a pequeña escala se debe realizar para familiarizarse con todo el procedimiento.

1. Recopilación de hembras vírgenes y hombres de Naïve

La versión más simple del experimento descrito consta de cuatro tipos de cruces iniciales, que implican la combinación de los adultos: a) w particulares ¹¹¹⁸ con el fin de recoger las hembras vírgenes, b) Oregon-R individuos con el fin de recoger los varones referencia ingenuos, c ) P {sw} machos homocigotos y hembras vírgenes de una línea de control que lleva a la organización de tipo salvaje de SDIC el fin de recoger los machos experimentales tratados previamente (tipo I), y d) P {sw} machos homocigotos y SDIC-sw-supresión -llevar a hembras vírgenes con el fin de recoger los machos experimentales no tratados previamente que llevan la deficiencia de NaDCC-sw (Tipo II).

1. Configurar múltiples viales que contienen 8-10 mujeres y 5 hombres cada una. Permitir que las hembras ponenhuevos y transferir los adultos a los nuevos viales cada 3-5 días. Utilice botellas en lugar de viales si es necesario y utilizar siempre los alimentos frescos. El número de viales necesarios dependerá del número de tipos de machos experimentales en estudio y el número de individuos que se estima necesario para detectar diferencias (Tabla 1). Más de 10 hembras por vial podrían resultar en el hacinamiento durante el crecimiento de las larvas, que pueden causar variaciones en la fertilidad de la progenie. Guarde los viales a 25 ° C en una cámara de temperatura controlada.
2. Comience a recoger hembras vírgenes y machos ingenuos en los días 11 ^y 12 de ^noviembre después de la creación de los cruces iniciales. El período de espera varía en función de la temperatura; inferior resultado temperaturas en el tiempo de desarrollo más largo retraso de la colección de individuos. Otro factor que afecta el tiempo de eclosión es el tipo de medio. Alimentos nutritivos, como medio de harina de maíz, la levadura ^29, asegura el correcto desarrollo del adultosistema reproductivo, lo que facilita el apareamiento. Recoger unmated vuela cada 4-6 horas. Al recoger, anestesiar moscas mediante la introducción de CO ₂ en el vial, toque las moscas hacia abajo, y el sexo a bajo microscopio estereoscópico (Figura 2). Coloque las moscas deseadas en diferentes viales por sexo y fenotipo y la etiqueta de los viales adecuadamente.

Nota 1. Colección rutina comienza en la mañana descartando los adultos que emergieron durante la noche anterior. Recoger las hembras vírgenes y machos ingenuos una o dos veces durante el día. Típicamente, D. los machos alcanzan la madurez sexual melanogaster 8 horas después de la eclosión a 25 ° C ^30. Si las moscas se mantuvieron en ciclos de luz / oscuridad 12:12 h, se espera que dos picos de eclosión: durante la primera 1-2 horas después de que la luz se enciende, y durante la 2 horas antes de la luz se apaga. Eclosión ocurre dentro de 24 horas después de la pupa se oscurece.

Nota 2. No más de 10 mujeres shía ser puesto en el mismo vial para evitar el hacinamiento. Esto limita también la pérdida de las hembras en el caso de que tengan que ser descartado, porque al menos uno de ellos no es virgen.

Nota 3. Con el fin de recoger la cantidad apropiada de hembras vírgenes y machos ingenuos en un corto período de tiempo, las siguientes medidas pueden adoptarse. Configure 15-20 frascos de ¹¹¹⁸ w de experimentos con dos tipos de machos experimentales (Tabla 1). Espolvorear ligeramente la superficie de los medios de comunicación y añadir unas pastillas de levadura seca activa para facilitar la oviposición. Traslado padres por lo menos 4 veces en días consecutivos. Para aumentar la superficie disponible para la fase de pupa en cada vial, inserte el papel multi-plegada (7 x 5 cm) durante el 4 ^º o 5 ^º día después de que los padres se transfieren a otro vial (Figura 3). Si el número de adultos emergidos de las cruces inicial no es suficiente, esperar unos días más y cobrar individualmenteALS de viales establecidos en diferentes fechas. Plan para llevar a cabo los experimentos durante varios días consecutivos para igualar la carga de trabajo.

2. Experimentos doble de apareamiento

La figura 4 muestra las principales etapas implicadas en experimentos de doble acoplamiento realizadas en ^14.

1. En la mañana del día 1, creó el primer apareamiento. Los machos Oregon-R son el primero para acoplarse en el ensayo de delito.
   1. Usando el aspirador, creado viales conteniendo 10 4 a 5 días de edad, de ojos blancos w hembras vírgenes ¹¹¹⁸ y 10 de ojos rojos Oregon-R machos ingenuos cada uno. Dos a tres viales se configuran al día durante 5 días consecutivos. El número de viales necesarios para la creación puede variar en función del número de personas disponibles. Permita que las moscas para aparearse durante 2 horas.
   2. Descartar Oregon-R machos y colocar cada hembra en un nuevo vial utilizando un aspirador (Figura 5). La identificación del sexo se puede lograr mediante la inspección visual de unos pocosdiferencias morfológicas (Figura 2). Marque cada vial adecuada y dejar a la hembra en el vial durante 2 días (en adelante "v1").
2. El día 3, configure el segundo acoplamiento. Selección de los varones y transversales establecidos se debe realizar al azar con el fin de minimizar cualquier sesgo potencial hacia cualquiera de los tipos masculinos experimentales.
   1. Dos horas antes de que la luz está apagada, vuelva a transferir a la mujer a un nuevo vial con un aspirador. Marque el nuevo vial adecuada (en lo sucesivo "v2").
   2. Introducir tres 5-6-días de edad, machos experimentales del mismo genotipo en v2.
   3. Repita 2.2.1 y 2.2.2 para cada mujer.
   4. El día 4, a dos horas justo antes de la luz se activa (es decir, no más de 12 horas después de la 2.2.1), desechar los hombres mediante el aspirador.
3. En el Día 6, transferir cada hembra de nuevo en otro frasco nuevo. Etiquetar los nuevos viales debidamente (en adelante "v3").
4. El día 10, deseche el ¹¹¹⁸ w hembras.
5. Examine las progenies en v2 y v3. La primera inspección se lleva a cabo después de 13-15 días después de que se introdujo la hembra en v2 (o V3), por ejemplo, en el día 17 después de la primera hembra oviposición se inició en v2. La segunda inspección se realiza exactamente después de 17 días. Este período de tiempo representa un límite temporal máximo de seguridad que garantiza que no habrá segunda generación en el mismo vial. Dos inspecciones evitar el hacinamiento, facilitando conteo progenie.
   1. El día 17, inspeccione v1 y asegurar que hay descendencia de ojos rojos presentes, si no marcar el vial en consecuencia. Presencia de la progenie de ojos blancos indica que la hembra no era virgen en el momento de apareamiento inicial mientras que ninguna progenie indica que el apareamiento con la referencia o los machos experimentales no ocurrir.
   2. El día 17, lleve a cabo la primera inspección de la v2. Anesthetize surgió progenie en v2 con CO ₂ y ordenarlos por color de los ojos y el sexo. Números de progenie Registro engendrados por el primer y segundomachos ond. Figura 6 muestra los fenotipos esperados en la progenie de cada esquema de apareamiento. En este experimento en particular ^14, sólo progenie femenina se puede asignar de forma inequívoca como engendrado por la referencia o los machos experimentales y por lo tanto sólo la información de las hijas se puede utilizar para calcular P _2. Si con otros marcadores de la paternidad de la descendencia masculina se puede asignar de forma inequívoca, los recuentos de progenie de ambos sexos pueden ser utilizados en los cálculos posteriores. Deseche la progenie, pero mantener v2 de segunda inspección.
   3. El día 20, proceder como en 2.5.2 con la progenie de reciente creación en v2 y luego desechar el vial.
   4. En el Día 20, inspeccionar la progenie surgido en v3 por primera vez y siga el paso 2.5.2.
   5. El día 23, proceder como en 2.5.3 con la progenie de reciente creación en v3.

Nota 1: Debido al potencial efecto de inflar las puntuaciones de P que el apareamiento múltiple podría tener (2.2.2 y 2.2.3), el apareamientopuede ser limitado a un lapso de tiempo determinado. El marco de tiempo dependerá de la frecuencia de aparearse de nuevo asociado con el genotipo de la hembra y machos usados. La probabilidad de apareamiento múltiple es especialmente reducido durante la noche ^11.

Nota 2: No añadir pastillas de levadura vivas, ya que esto podría causar problemas debido al potencial de crecimiento excesivo de la levadura cuando el número de moscas adultas es baja.

3. Análisis de Datos

1. Cuenta progenie grabados deben organizarse adecuadamente para facilitar la inspección visual y análisis eficiente con un paquete estadístico adecuado (por ejemplo JMP de SAS Institute) o herramientas gratuitas basadas en la Web (por ejemplo http://vassarstats.net/ ).
2. Capacidad competitiva de esperma. Añadir cuenta de v2 y v3. Las moscas hembras que han dado lugar a ninguna o muy limitada progenie (por ejemplo, <10), fallecido durante el procedimiento, o sólo de éxito inseminaciónted por uno de los dos hombres se consideran como no-informativo y están excluidos de cualquier análisis estadístico posterior (2.5.1 y Tabla 2). Calcular la puntuación P ₂ para cada mujer informativo.
3. Probar si existen diferencias estadísticamente significativas en los valores de P ₂ entre los machos experimentales comparados. Esto puede hacerse usando pruebas no paramétricas (por ejemplo de acero-Dwass) dependiendo de varios factores, incluyendo la asimetría de la distribución de los valores de P ₂ y la dependencia entre la varianza y la media paramétrica (HSD de Tukey por ejemplo) o. La transformación angular se aplica comúnmente a proporciones tales como P ₂ antes de que el uso de pruebas no paramétricas ^31.
4. Diferencias de acoplamiento (opcional). Para cada tipo macho experimental, calcular el número de las hembras apareadas por partida doble y los que sólo se apareó con el primer macho (el macho de referencia en el ensayo de ataque y el macho experimental en el densayo efense). Uso de una prueba exacta de Fisher de dos colas (disponible en http://www.langsrud.com/fisher.htm ), determinar si existen diferencias estadísticamente significativas entre los dos tipos de machos experimentales.
5. Tasa de masculinidad (opcional). Para cada hombre experimental, utilice la prueba de chi-cuadrado para determinar si la proporción de sexos en la descendencia de cada hembra se desvía de la proporción esperada de 1:1.

Resultados

La tabla 2 resume algunas de las características más destacadas de dos experimentos delito (ensayos 1 y 2) en el que D. melanogaster machos experimentales con y sin (Tipo I y II, respectivamente) un grupo funcional NaDCC se comparan ^14. Después de tomar en cuenta las diferentes incidencias encontradas con algunas repeticiones, 58-83% de las mujeres resultaron ser de carácter informativo, por lo que los recuentos de paternidad de su progenie se podrían utilizar para el c...

Discusión

Hemos descrito el diseño experimental para evaluar las diferencias en la contribución relativa de genéticamente distinta D. melanogaster hombres a la progenie en los experimentos de doble acoplamiento controlados ^7,8. Esto se ha hecho en el contexto de un factor genético planteado la hipótesis de influir en la capacidad competitiva de esperma y se ha ilustrado en el ensayo de delito aunque se aplica un procedimiento similar al ensayo de defensa (Figura 1). Este diseño experimen...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes