La mejora de la tasa de éxito de cristalización de proteínas por Random Matrix Microseed Screening

Resumen

Aquí se describe un método general para la detección de la matriz microseed al azar. Esta técnica se muestra para aumentar de manera significativa la tasa de éxito de la proteína experimentos de cribado de cristalización, reducir la necesidad de optimización, y proporcionar un suministro fiable de cristales para la recopilación de datos y experimentos ligando-spa.

Resumen

Detección matriz microseed aleatorio (RMM) es una técnica de cristalización de proteínas en el que se añaden cristales de siembra a las pantallas de azar. Al aumentar la probabilidad de que los cristales crezcan en la zona metaestable del diagrama de fases de una proteína, cables adicionales de cristalización se obtienen a menudo, la calidad de los cristales producidos se puede aumentar, y se proporciona una buena cantidad de cristales para la recopilación de datos y de remojo experimentos. Aquí se describe un método general para la RMM que se pueden aplicar a cualquiera que se sienta gota o colgando experimentos de difusión de vapor de gota, establecidos ya sea a mano o con la robótica de manipulación de líquidos, en formato de 24 pocillos de la bandeja de 96 pocillos o.

Introducción

Desde su aplicación inicial por Perutz, Kendrew y compañeros de trabajo en la determinación de las estructuras de la hemoglobina y la mioglobina, a los modernos de alto rendimiento tuberías automatizados de la genómica estructural consorcios, cristalografía de rayos X macromolecular nos ha proporcionado una visión estructural sin precedentes en el mundo de la proteína . Esta técnica sigue siendo el método experimental más ampliamente aplicable que permite la visualización directa de la estructura de la proteína en atómica, o cerca de resolución atómica (es decir, en el rango de 1-3). Un requisito previo para la difracción de rayos X para ser aplicado a una proteína es que primero debe ser cristalizado, y es esta etapa del proceso que sigue siendo el paso limitante de la velocidad mayor solo en la determinación de la estructura por métodos de difracción ^{1, 2.} A pesar de los avances significativos en nuestra comprensión del proceso de cristalización de proteínas, y mejoras importantes en la calidad y disponibilidad de pantallas de cristalización,bandejas, y las tecnologías relacionadas, sigue siendo imposible predecir con fiabilidad la probabilidad de éxito de cristalización ^3. Los métodos bioquímicos y biofísicos se pueden aplicar para evaluar si una proteína de interés muestra características favorables para la nucleación y el crecimiento cristalino, es decir, es bien plegada-, homogénea, monodisperso, etc, sin embargo, estos puntos de vista de ninguna manera proporcionan un predictor definitiva de cristalización propensión.

Siembra mucho tiempo se ha pretendido ser un método viable para mejorar el número, el tamaño, y la calidad de los cristales existentes o material cristalino ^4-7. Este enfoque se basa en la premisa de que una condición que soporta la nucleación de cristales puede no ser óptima para posterior crecimiento del cristal y viceversa. Al transferir el material nucleado de una condición a otra, se puede tratar de desacoplar efectivamente estos procesos, dando así acceso a nuevos, el espacio de cristalización todavía inexploradas,y como resultado el aumento de la tasa de éxito general de un experimento de cribado. Los métodos establecidos se han documentado para (i) macroseeding, la transferencia de un solo cristal en su totalidad de una condición a otra ^8, (ii) siembra consecutivas, la transferencia de material nucleado, generalmente obtenido por la aplicación de presión direccional utilizando, por ejemplo bigote de un gato a la superficie de un cristal existente, seguido de posterior paso de la barba a través de una nueva gota de cristalización ^9, y (iii) microsiembra "clásica", la transferencia de cristal "semillas", generados por la recolección aplastado cristales (o cristalina materiales), en condiciones similares a las que se produjeron las semillas ^10. Cabe destacar que los tres de estos métodos son mucho tiempo y poco escalable, sobre todo en comparación con lo que se puede lograr con modernas robótica cristalización de manejo de líquidos. Estos factores han contribuido, en algún nivel, al menos, a la percepción de que la semillación es un método para ser visitado sólo cuando otros métodos han fallado en dar sus frutos.

Microsiembra matriz aleatoria (RMM) es una innovación metodológica reciente que combina los beneficios de microsiembra tradicional con las de detección y escalabilidad ^11-13 de alto rendimiento. Este enfoque se basa en la generación de una población de semillas, producido a partir de material cristalino nucleada, que puede estar dividió en alícuotas en / sobre cada sub-well/coverslip dentro de una pantalla estándar de cristalización de 96 condiciones. Este método es aplicable a ambos sentados o colgando experimentos de difusión de vapor de gota, establecidos ya sea a mano o con la robótica de manipulación de líquidos, en formato de 96 pocillos de la bandeja de 24 pocillos o. Rmms se ha demostrado experimentalmente para aumentar significativamente la tasa de éxito de cristalización, y producir cristales de mayor calidad y la cantidad ^{11, 13, 14} de difracción, y representa una herramienta innovadora en el arsenal de los cristalógrafos 'de enfoques en el ONgoing esfuerzo hacia el éxito de la cristalización. Aquí se describe un método general para RMM y proporcionar datos de ejemplo que ilustran la eficacia de esta técnica.

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Protocolo

1. Consideraciones Estratégicas

1. La elección de las semillas-cristales utilizado para los experimentos de microsiembra variará dependiendo del objetivo del experimento. Al inicio de un proyecto es de gran ayuda para encontrar varios éxitos de cristalización que pueden proporcionar puntos de partida alternativos para la optimización de cristal. Rmms reduce en gran medida la necesidad de optimización de cristal porque los cristales de buena calidad son más propensos a crecer en la zona metaestable del diagrama de fases, es decir, en la región en la que después de una perturbación o nucleación el sistema vuelve al equilibrio. Por lo tanto sugerimos utilizar RMM rutinaria, tan pronto como se obtengan los primeros cristales (o, más exactamente, tan pronto como los primeros cristales dejan de crecer).
2. Para la ronda inicial de RMM, una reserva de semillas debe hacerse con la mayor cantidad de material cristalino como sea posible. Si sólo hay un bien disponible que contiene cristales o si los cristales son pequeños, puede ser útil crear múltiples repeticiones de laéxito original (sin siembra) para aumentar la oferta de los cristales. Si, sin embargo, se obtienen varios resultados diferentes, cristales de siembra se pueden cosechar a partir de varias condiciones y se mezclan juntos.
3. Para evitar la separación de fases, los cristales que crecen en condiciones de alto contenido de sal deben ser cosechados por separado a partir de cristales que crecen en condiciones de alto PEG. Si se mezclan cristales de varios pozos, una solución de reserva que es menos probable para dar cristales de sal debe ser seleccionado para suspensión de siembra. Por ejemplo, altas concentraciones de fosfato, sulfato, calcio y magnesio se deben evitar.
4. Más tarde, en un proyecto que puede ser importante para buscar cristales con diferentes células de la unidad con el fin de mejorar la difracción, evitar cristales maclados y obtener cristales que son adecuados para los ligandos de unión. En esta etapa sólo los cristales más adecuados (por ejemplo, los que difractan mejor) se debe utilizar para hacer que la población de siembra. A veces se necesitan rondas repetidas de microsiembra, donde sólo la "mejor"Cristales se utilizan para hacer la reserva de semillas para la siguiente ronda. Si es posible, una" precipitante neutro "tal como PEG 3000 debe ser utilizado para suspender los cristales de siembra en animar a nuevos contactos de cristal y para cristalizar complejos que pueden ser inestables en alto soluciones ^salinas-12.
5. Experimentos microsiembra clásica, donde se utiliza una sola condición de cristalización, a menudo son útiles después de la identificación de una condición prometedora y durante la optimización posterior. A menudo es necesario para diluir la población de semillas con el fin de obtener el número deseado de cristales por gota. A "combinatoria" experimento microsiembra (donde se añaden una serie de reservas de semillas para aumentar la dilución a una condición de cristalización) es un método rápido para encontrar la dilución óptima de las existencias de semillas. Este enfoque se describe a continuación.

2. Preparación de Semilla de la Bolsa

1. Hacer una sonda de vidrio redondeada de una pipeta Pasteur de vidrio utilizando una llama Bunsen.
   1. Calentar la pipeta cerca de la mitad hasta que se ablande, luego retire rápidamente del fuego y sacarlo tirando de los extremos. Objetivo para tirar el vaso a un diámetro inferior a 0,25 mm.
   2. Romper el vidrio en el punto en el que es de alrededor de 0,25 mm y sumergirse brevemente el extremo roto en la llama. Repita este procedimiento hasta un hemisferio de vidrio con un diámetro de ~ 0,75 mm está formada en el extremo. Esta sonda es útil para la trituración de material cristalino, ya que tiene el tamaño adecuado para golpear objetos sólidos en la escala de 0,01 a 1,0 mm y que no daña la superficie de plástico de una cristalización bandeja sub-bien o cubreobjetos. Sondas más grandes (~ 1,0 mm) se pueden aplastar a los pequeños cristales de manera más eficaz porque los cristales se encuentran atrapados entre el vidrio y el plástico.
2. Coloque un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene una semilla de bolas de hielo.
3. Inspeccionar una bandeja de cristalización pre-establecido mediante un microscopio binocular o sistema de imagen cristalina y seleccione uno o más apapropiado pozos de la bandeja desde la que cosechan material cristalino para la generación de semillas. Cualquier material puede ser utilizado incluyendo agujas finas, esferulitas, microcristales y cristales irregulares, mal formados. La reserva de semillas debe hacerse tan pronto como sea posible después de que los cristales dejen de crecer, como material de más edad es más probable que sea reticulado parcialmente, reduciendo así su idoneidad para el uso en experimentos de siembra. Si existe alguna duda en cuanto a si el material cristalino para ser cosechado es la sal o la proteína del pozo puede ser visualizado usando un microscopio de fluorescencia UV o sistema de imagen antes de la apertura, o el material cristalino puede ser sometido a in situ análisis de difracción de rayos X en la bandeja. Al utilizar los antiguos cristales de proteínas enfoque será fluorescente bajo irradiación UV, aparecerán incoloro cristales de sal.
4. Abra bien la bandeja de cristalización seleccionada. Para 96 ​​pocillos sentado bandejas gota cortar a través de la lámina de sellado superior de plástico alrededor del pozo seleccionado using una hoja de bisturí. Para las bandejas gota colgante 24-así quitar el cubreobjetos usando un par de pinzas. Invierta el cubreobjetos y colóquelo en una superficie limpia y estable. Retire 50 l de la solución de reserva y la transferencia de este líquido al tubo de microcentrífuga que contiene la Semilla de bolas de asegurar que el tubo permanece en el hielo en todas partes.
5. Aplastar a fondo los cristales en el subwell (bandeja de 96 pocillos) o cubreobjetos (bandeja de 24 pocillos) gotas, usando la sonda de vidrio preparado en la sección 2.1, se muestran los resultados bajo un microscopio. Pequeños cristales pueden tardar varios minutos para aplastar a fondo. Este paso permite que el experimentador para comprobar que los cristales son fáciles de aplastar y por lo tanto no están reticulados, y también que no son cristales de sal. Los cristales de sal producen un chasquido característico que se puede escuchar y sentir cuando son aplastados. Si los cristales son duras y difíciles de triturar intento de obtener y utilizar el material más fresco.
6. Retire 5 l de la solución de reserva desde el tubo de bolas de semillas y transfer al equivalente sub-well (sentado experimento de la gota) o cubreobjetos (colgando experimento de la gota) que contiene el material cristalino para ser cosechado. Pipetear este líquido hacia arriba y abajo 5-6 veces para resuspender como gran parte de los contenidos de sub-así o cubreobjetos como sea posible. Volver a la suspensión en el tubo de bolas de semillas y repita este paso dos veces más, asegurarse que el material cristalino como mucho se cosecha posible.
7. El vórtice grano de la semilla durante dos minutos, deteniéndose cada 30 segundos para enfriar el tubo en hielo.
8. Hacer una serie de dilución, la dilución de la solución de stock de semillas en depósito por un factor de 4 a 10 en cada etapa. Típicamente, demasiados cristales se obtienen cuando se utiliza un stock de semillas sin diluir, a fin de utilizar las reservas de semillas diluidas para controlar el número de cristales por pocillo. En la primera ronda de RMM, es importante no para diluir la solución madre de semillas, ya que a mayor concentración de semillas se pueden obtener los más golpes de cristalización.
9. Si no es para ser usado inmediatamentetamente, transferir el stock de semillas de suspensión y el stock de semillas diluida a un -20 ° C o -80 ° C congelador para el almacenamiento. Para evitar los ciclos de congelación-descongelación, lo que puede reducir la eficacia de las acciones de la semilla, almacene este material en pequeñas alícuotas de volumen, es decir, 10 a 20 l. Una vez congeladas, las reservas de semillas pueden mantenerse de forma indefinida hasta que se necesite.

3. Establecimiento de cristalización bandejas

1. Dependiendo de la disponibilidad de instalaciones de cristalización y las preferencias del experimentador, el cribado de cristalización Rmms se puede realizar utilizando cualquiera de las bandejas de 24 pocillos empleando el método de difusión de vapor de gota colgante, o bandejas de 96 pocillos usando el método de difusión de vapor de gota sentado. Bandejas de cristalización para Rmms se pueden establecer ya sea a mano, utilizando un dispensador de manejo de líquidos robótico, o una combinación de los dos.
2. Un experimento típico de RMM configurar manualmente comprenderá, 1,0 l solución de proteína, condiciones de cristalización 1,0 l, y0,5 l de semillas. Un experimento típico creado usando un robot de cristalización comprenderá, solución de proteína de 0,3 l, 0,2 l condiciones de cristalización, y 0,1 l de semillas.
3. Para llevar a cabo el cribado Rmms en 24-así colgando bandejas de gota, en primer lugar, utilizando una pipeta manual, transferir 300 l de cada condición de una pantalla de condiciones de cristalización de 96 pocillos en 10 ml de formato de un solo tubo en cada pocillo de 4 x 24 pocillos cristalización engrasados bandejas.
   1. Transferencia de 1 l de cada condición de cristalización a partir de cada 300 l depósito sobre la superficie de un cubreobjetos de plástico correspondiente a partir del cual se han eliminado ambas tiras de respaldo de protección delanteros y traseros.
   2. A los 1 l de cada condición de cristalización añadir 1 l de solución de proteína, seguido de 0,5 l de cristales de siembra de valores. Invertir cada cubreobjetos de tal manera que la gota de líquido se enfrenta y la posición por encima de la adecuada bien hacia abajo.
   3. Presione hacia abajo sobre el cubreobjetos, comprimiendo el sealing grasa y la formación de un sello seguro. Una vez que todas las gotas 96 se establecen, la bandeja debe ser transferido a una incubadora o sala a temperatura constante, por lo general en el rango de 4-18 º C para el almacenamiento.
4. Para llevar a cabo el cribado Rmms en 96-así sentado bandejas gota en primer lugar, transfieren 20-50 l de cada condición de una pantalla de condiciones de cristalización de 96 pocillos en formato de bloque así profundamente en cada pocillo correspondiente de la bandeja de cristalización. Esta etapa de transferencia puede llevarse a cabo utilizando ya sea un robot de cristalización, o por transferencia manual usando una pipeta de 8 canales.
   1. Soluciones de reserva de depósito de transferencia, proteínas y semillas a las gotas a mano o con un robot utilizando los volúmenes que se detallan en el apartado 3.1. Algunos robots de cristalización disponibles comercialmente no entren en contacto de dosificación, y la semilla rendimiento Stock transferencia utilizando un sistema de este tipo puede dar lugar a la obstrucción de dispensar consejo o tubos asociados. El orden de dispensación es variable: algunos robots dispensan todas las soluciones de forma simultánea. Siesto no es posible, prescindir de proteínas en primer lugar, a continuación, embalse, luego sembrar valores.
   2. Si un contacto de dispensación robot no es de transmisión disponible en las semillas usando una jeringa de vidrio de bajo volumen con una aguja roma. Enjuague la aguja haciéndola pasar a través de la solución de reserva a continuación dispensar la población de semillas en cada gota.
   3. Sellar la bandeja utilizando lámina adhesiva transparente y transferir a una incubadora o sala de temperatura constante para su almacenamiento.

4. Inspección de cristalización Bandejas

1. Visualizar todos los experimentos de cristalización utilizando un microscopio binocular o un sistema de imágenes de cristal. El ex general ofrece al usuario un mayor control sobre la profundidad de vista y el grado de ampliación que el segundo, pero es más lento.
2. Inspeccione cada sub-well/coverslip en secuencia y grabar cualquier evidencia de la formación de cristales. Los experimentos deben ser inspeccionados una vez cada 24 horas durante 5 días tras el establecimiento y lan, posteriormente, una vez cada 7 días para un máximo de 4 semanas.
3. Múltiples ciclos de RMM se requieren a menudo antes de que se producen cristales de calidad de difracción óptima.

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Resultados

(A) Ejemplo de un experimento Rmms

Para demostrar la eficacia del cribado Rmms aplicamos este método para la cristalización de huevo de gallina lisozima (HEWL) y el hígado de bovino catalasa (BLC). Tanto estas enzimas son eminentemente cristalizable y están estructuralmente objetivos ^{15, 16} bien caracterizados. Como tal ambos proporcionan excelentes sujetos de prueba con los que ilustrar la mayor tasa de éxito cristalización alcanzable con RMM. Experimentos de cristalización s...

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Discusión

En este trabajo se ha descrito un método general para la detección de la cristalización de proteínas RMM. Hemos demostrado el uso de dos proteínas de prueba una mejora significativa en la tasa de éxito de cristalización usando este método. El análisis de difracción usando radiación de sincrotrón de un subconjunto de cristales generados usando Rmms y métodos no Rmms reveló poca variación en la calidad de difracción entre cristales crecidos usando cualquiera de los métodos, aunque los autores anteriores h...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% purity
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% purity
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	For screens established by robot
Crystal Ph–nix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	For screens established by hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	For screens established by hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	For screens established by hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0