Permeabilización de células adheridas Usando un gas inerte Jet

Resumen

Este protocolo describe un método para la permeabilización temporal de células adherentes utilizando un chorro de gas inerte. Esta técnica facilita la transferencia de material genético y biomoléculas en células de mamífero adherentes por la utilización de fuerzas mecánicas para romper la membrana de plasma.

Resumen

Existen diversas técnicas de transfección de células y éstas se pueden dividir tres grandes categorías: viral, químicas y mecánicas. Este protocolo describe un método mecánico para permeabilizar temporalmente las células adherentes utilizando un chorro de gas inerte que puede facilitar la transferencia de macromoléculas normalmente no permeables a las células. Creemos que esta técnica funciona impartiendo fuerzas de cizallamiento en la membrana plasmática de las células adherentes, resultando en la formación temporal de microporos. Una vez que se crean estos poros, las células son entonces permeable al material genético y otras biomoléculas. Las fuerzas mecánicas que intervienen no corren el riesgo de dañar permanentemente las células o se separe de su sustrato. No es, por lo tanto, una estrecha gama de dinámica de gases inertes donde la técnica es eficaz. Un chorro de gas inerte se ha demostrado su eficacia en la permeabilización de diversas líneas de células adherentes, incluidos HeLa, HEK293 y células endoteliales de aorta abdominal humanos. Este protocolo es apropiado para el permeabilization de células adherentes, tanto in vitro y, como hemos demostrado, in vivo, demostrando que puede ser utilizado para la investigación y, potencialmente, en futuras aplicaciones clínicas. También tiene la ventaja de permeabilización de las células de una manera espacialmente restrictiva, lo que podría llegar a ser una valiosa herramienta de investigación.

Introducción

Con la evolución de la biomedicina y la comprensión de la mecánica de células, la entrega de las biomoléculas en células se ha convertido en vital para muchos campos de investigación y las terapias médicas. Diferentes técnicas han sido desarrollados para introducir moléculas extrañas a través de la membrana plasmática y en el citosol de la célula. Estos se pueden clasificar en general ya sea como: técnicas viral, químicos o mecánicos. Técnicas virales pueden transfectar material genético, tales como ARN y ADN utilizando vectores virales ^1. Técnicas virales tienden a tener altos rendimientos en ciertas líneas celulares, sin embargo tienen la posibilidad de reacciones inmunes e inflamatorias ^2. Métodos de transfección química comunes incluyen precipitación con fosfato de calcio ^3, exotoxinas bacterianas ⁴ y ⁵ lipofección. Estas técnicas han demostrado ser eficaces, sin embargo, ciertos problemas surgen tales como toxicidad celular y no especificidad. Además, las técnicas tales como Phosphat de calcioe precipitación se han encontrado para tener eficiencias de transfección de hasta 70%, pero sólo en ciertas líneas celulares, rara vez en las células primarias ^6. Esto es de nota como el aumento de los esfuerzos de investigación se están poniendo en células primarias, especialmente en el caso de diseñar diversos tratamientos para el uso clínico y el estudio de funcionamiento de ADN.

La interrupción temporal de la membrana celular a través de estímulos mecánica es una alternativa para la introducción de moléculas extrañas en las células. Las técnicas incluyen: la microinyección de moléculas ^7, electroporación usando un campo eléctrico para romper la membrana ^8,9, sonoporación utilizando ondas de ultrasonido para romper la membrana celular ^10-12, bombardeo de partículas como se demuestra por la "pistola de genes", que dispara partículas unidas con genes en la célula ^13, y, más recientemente, la aplicación de la tensión de cizallamiento de fluido que se ha demostrado para permeabilizar temporalmente las células de mamífero ^14,15. Aunque mecánicométodos cols evitar algunos de los problemas antes mencionados, por lo general son acompañados por una menor eficiencia y configuraciones muy complejas y especializadas. Una antorcha de descarga luminiscente a presión atmosférica (APGD-t) fue desarrollado en McGill con el objetivo inicial de la funcionalización de superficies y separar las células adherentes in vitro ^16. Casualmente, se descubrió que una mancha en vivo / muerto se está utilizando de alguna manera se está tomada en por las células sin que se añade un agente de permeabilización. Además, este parecía haber ocurrido sólo en áreas restringidas de los pozos que sucedieron para que coincida con la ruta de la antorcha. Investigación de las capacidades de permeabilización de la APGD-t continuó y en los estudios de control, se encontró que el chorro de gas inerte portador del plasma sin excitación también fue capaz de permeabilizar las células. Esto contradecía la hipótesis inicial de que las especies reactivas creadas por el chorro de plasma alterado de forma temporal la función de la membrana, y sugirió que simplemente los mecánicosfuerzas de cal fueron suficientes para causar la permeabilización celular. A partir de aquí, se continuaron los estudios en nuestro laboratorio para tratar de cuantificar y caracterizar la eficiencia de la permeabilización de un chorro de gas inerte, así como cuidar a sus capacidades de transfección ^16.

A través de estos estudios, se ha encontrado que los microporos se puede hacer en forma de hecho en la membrana plasmática, y estos poros tienden a cerrar de nuevo dentro de aproximadamente 5 seg ^15. Hemos demostrado la utilidad de la técnica in vitro e in vivo en la membrana corioalantoidea de un embrión de pollo.

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Protocolo

1. Desarrollo del programa de LabVIEW

1. Un controlador de flujo másico (MKS M100B misa-Flo Controlador) está unido a la línea de gas de helio para garantizar una velocidad de flujo de gas precisa. Esta unidad es controlada por una tensión de entrada, que oscila entre 0 y 5 V. Un bucle de control en el programa LabView determina el voltaje requerido en cualquier momento dado. Interfaz entre el ordenador y el controlador de flujo de masa se lleva a cabo por un dispositivo de adquisición de datos (NI USB-6009), y una fuente de alimentación de 12 V suministra potencia al controlador de flujo másico.
2. Dos diapositivas lineal de posicionamiento se utilizan para controlar el movimiento de la placa de 6 pocillos, una para cada dirección. Cada conjunto se compone de una serie MA15-Velmex Asamblea Unislide junto con un motor paso a paso, y ambos conjuntos están controlados por un único Velmex VXM Stepping Motor Controller. El controlador permite para hacer footing manual de cada motor o acepta una cadena de comandos en serie externos, la combinación de los cuales permitir el movimiento específico patterns. Varios patrones se pueden programar en el programa LabView, que requiere que el usuario proporcione sólo la velocidad de la antorcha deseado, así como las dimensiones de ruta.

2. Preparación de Equipo

1. Abra tanto el cilindro de helio y el regulador.
2. Encienda el controlador del motor.
3. Abra el programa LabView y verificar todas las condiciones.
4. Asegúrese de que la plataforma esté centrada. Para comprobarlo, busque en cada etapa del motor y verificar que cada carro no está cerca de cualquier extremo escenario. Ya sea que el centro del programa de los carros o ajuste manualmente mediante los controles de correr en la parte frontal del controlador de motor.
5. Si esta es la primera carrera del día, se recomienda ejecutar el programa una vez y sin células, para asegurar la instalación funciona correctamente.

3. Preparación de la Altura Gas Jet boquilla capilar

1. Quite la capilaridad del soporte y cero el dial de altura.
2. Coloque la placa de 6 pocillos on la plataforma.
3. Vuelva a colocar y bajar el capilar chorro de gas a la parte inferior del pozo hasta que llega a la hoja de la cubierta. Fije el capilar en el soporte.
4. Utilización del dial de altura, levante el capilar 3 mm. Marque esta altura en la base del capilar.
5. Levante el capilar a una altura segura y luego retire la placa de 6 pocillos.

4. Celular Protocolo Permeabilización

1. Cultura línea celular adherente a la confluencia de la cubierta de cristal se desliza en una placa de 6 pocillos usando técnicas estándar de cultivo. Para las células HeLa, semillas placas de 6 pocillos con 2 x 10 ⁵ células por pocillo y se incuban durante 48 horas antes del tratamiento.
2. Preparar volumen apropiado de solución que contiene el vector deseado. Para hrGFPII-1, una concentración de 50 ng / l en 1x PBS proporciona una señal fluorescente fuerte en células HeLa 24 horas después de la transfección. Para los estudios de dextrano, se recomienda 80 mg / ml de 10 kDa de dextrano fluorescente verde. De ahora en adelante, esta solución será referido a un"La solución vector" s.
3. Retire el medio de cultivo de células de bien y enjuáguese la boca tres veces con PBS 1x.
4. Pipetear 1.370 l de solución de vector preparado en el paso 4.2 en el pozo. Esto debería dar lugar a una profundidad de líquido de aproximadamente 1,3 mm.
5. Coloque el pocillo que contiene la solución del vector en el centro de la plataforma. Baje la boquilla de chorro de gas al nivel previamente marcado que indica una altura de boquilla de 3 mm por encima de la diapositiva.
6. Establecer velocidad de flujo de helio en el programa LabView y seleccionar el patrón de movimiento deseado para ser utilizado. Seleccione "Ejecutar" cuando esté listo para comenzar el protocolo de permeabilización. Habrá un período de retraso inicial en que el controlador de flujo de masa se está preparando para dar el caudal necesario. Una vez que se ha alcanzado la velocidad de flujo apropiada, el programa LabView activará los motores paso a paso para mover el bien en el patrón de permeabilización deseada. Una vez que la plataforma se ha detenido, espere aproximadamente 30 segundos y retirar la solución del vector.Nota: permeabilización óptimo se produce cerca de una presión dinámica de 100 hasta 200 Pa a la salida de la boquilla, en función del diámetro capilar.
7. Lavar tres veces con PBS 1x.
8. Llenar bien con medios de cultivo fresco.
9. Repita los pasos 4.3 a 4.6 para el número deseado de experimentos. Nota: Asegúrese de incluir muestras de control que consisten en pozos están llenos de la solución vector sin el chorro de gas que se ejecute sobre ellos. Agregar la solución en los pocillos de control durante aproximadamente 1 min continúe en los pasos 4.5 y 4.6.
10. Si la ejecución de un experimento de transfección hrGFP, devuelva la placa de 6 pocillos a la incubadora durante 24 horas para permitir que el material transfectadas para ser transcrito por las células. Si al ejecutar un experimento de permeabilización dextrano, volver placa de 6 pocillos a la incubadora durante 15 min.

5. Imágenes de células

1. Si lo desea, inmediatamente antes de la imagen, counterstain con mancha en vivo / muerto apropiado para evaluar la muerte celular.
2. Celdas de imagen con appropmicroscopio riate para investigar la eficacia de transfección / permeabilización.

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Resultados

La permeabilización de las células HeLa con 10 kDa de dextrano fluorescente verde usando un chorro de gas helio con un capilar de diámetro interior 0,86 mm se muestra en la Figura 1. Las células fueron counterstained inmediatamente después de la permeabilización con 2 l / ml EthD-1 solución (LIVE / DEAD viabilidad / citotoxicidad Kit) para visualizar la muerte celular. Inmediatamente después de la contratinción, cubreobjetos fueron montados y la imagen. Esta figura muestra los resultados de eje...

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Discusión

Permeabilización chorro de gas inerte es una técnica útil para la transfección de células adherentes. Se proporciona la capacidad de transferir biomoléculas en células con el uso de fuerzas mecánicas, lo que elimina la necesidad de productos químicos potencialmente dañinos o vectores virales. La técnica podría potencialmente dar a los investigadores y los clínicos de una manera eficiente y relativamente sencillo para transfectar células con precisión. La selectividad de la permeabilización también es ú...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vitality hrGFPII-1	Agilent Technologies Canada	240143-57	Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells
Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable	Life Technologies Inc.	D22910	dextran for permeabilization experiments
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Life Technologies Inc.	L3224	for counterstaining of mammalian cells
Prolong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930	for mounting slides when imaging
Ultra High Purity Helium	Praxair Canada Inc.	HE 5.0UH-T
Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml	Thermo Scientific	SH30022.01	for HeLa cells
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	26140079	For DMEM media
Penicillin-Streptomycin, liquid	Invitrogen	15140-122	For DMEM media
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x			Produced in lab
			Table 1. List of required reagents
6-Well Clear TC-Treated Microplates	Corning	3506
#1 22 x 22 Coverslips	Fisher	12-542B
Glass Capillaries	World Precision Instruments		WPI Sizing Information
ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Mass-Flo Controller	MKS	M100B01314CS1BV	Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply
USB-6009 DAQ Device	National Instruments	779026-01
UniSlide Assembly with stepping motor and controller	Velmex		Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller
			Table 2. List of required equipment