Biosensores radiométricos que miden el estado redox mitocondrial y ATP en las células vivas de levadura

Resumen

Se describe el uso de dos, biosensores ratiometric codificados genéticamente, que se basan en la GFP, para vigilar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en la resolución subcelular en células de levadura vivas.

Resumen

Las mitocondrias tienen papeles en muchos procesos celulares, de metabolismo de la energía y la homeostasis del calcio para el control de la vida celular y la muerte celular programada. Estos procesos afectan y se ven afectados por el estado redox y de la producción de ATP por las mitocondrias. Aquí, se describe el uso de dos, biosensores codificados genéticamente radiométricos que pueden detectar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en la resolución subcelular en células de levadura viva. Estado redox mitocondrial se mide usando sensible a redox Proteína Fluorescente Verde (roGFP) que está dirigido a la matriz mitocondrial. Mito-roGFP contiene cisteínas en las posiciones 147 y 204 de la GFP, que se someten a la oxidación y reducción reversible y dependiente del entorno, que a su vez altera el espectro de excitación de la proteína. MitGO-ATeam es una transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) sonda en la que la subunidad ε del F _o F _1-ATP sintasa se ​​intercala entre donante y aceptor de FRET fluoproteínas rescent. La unión de ATP a los resultados de la subunidad ε en cambios de conformación en la proteína que traen el donante de FRET y aceptor en estrecha proximidad y permiten la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia del donante al aceptor.

Introducción

Las mitocondrias son organelas esenciales para la producción de ATP, la biosíntesis de aminoácidos, ácidos grasos, hemo, clusters hierro-azufre y pirimidinas. Las mitocondrias también juegan un papel fundamental en la homeostasis del calcio, y en la regulación de la apoptosis. ¹ El aumento de enlaces evidencia mitocondrias a envejecimiento y relacionada con la edad las enfermedades incluyendo la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, y enfermedad de Huntington. ² Si bien las personas viven toda su vida con las mutaciones en las proteínas mitocondriales que están asociados con enfermedades neurodegenerativas, los síntomas de la enfermedad se producen sólo más tarde en la vida. Esto indica que los cambios se producen en las mitocondrias con la edad que permiten patología de la enfermedad a emerger. En efecto, fitness mitocondrial se correlaciona con la salud en general y la longevidad celular en levaduras y células de mamífero. ^3.4 Aquí se describe cómo utilizar biosensores fluorescentes genéticamente codificados, radiométricos para evaluar dos aspectos críticos de Mitochondria en células de levadura que viven: los niveles de ATP y el estado redox.

La función mitocondrial en la movilización de energía aeróbica está bien establecida. Estado redox mitocondrial es un producto de la reducción y las especies oxidantes en el orgánulo, incluyendo NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, glutatión / disulfuro de glutatión (GSH / GSSG) y especies reactivas de oxígeno (ROS). Desacoplar las mitocondrias o hipoxia afecta a la actividad respiratoria mitocondrial y altera la relación de NAD ⁺ a NADH en el orgánulo. ROS, que están producidos a partir de la transferencia de electrones ineficiente entre los complejos de la cadena de transporte de electrones en la membrana mitocondrial interna, así como de la desaminación de aminas a través de la monoamina oxidasa en la membrana mitocondrial externa ^5, daños en lípidos, proteínas, y ácidos nucleicos y tienen ha relacionado con el envejecimiento y enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad ^6,7,8. ROS también juegan un papel en la transducción de señal en mitochondria, a través de la oxidación de GSH. Por ejemplo, el NADH deshidrogenasa no sólo contribuye a la producción de ROS pero también está regulado a través de interacciones con la piscina glutatión ^9,10. α-cetoglutarato deshidrogenasa y aconitasa, componentes del ciclo del TCA, muestran una actividad reducida en ambientes oxidantes ^11,12.

En efecto, la regulación redox-dependiente de la actividad de la aconitasa se ​​conserva desde las bacterias hasta los mamíferos ^13,14. Por lo tanto, el control de la los niveles de ATP de las mitocondrias y del estado redox es crucial para la comprensión de su función y el papel en la patología de la enfermedad.

Métodos bioquímicos se han utilizado para evaluar el estado redox o los niveles de ATP de las células enteras o mitocondrias aisladas. Ampliamente métodos utilizados para evaluar el estado redox de las células enteras o las mitocondrias aisladas se basan en la medición de los niveles del par redox GSH / GSSG ^15. El sistema luciferina-luciferasa se utiliza comúnmente para medir mitocondrialLos niveles de ATP en cualquiera de las células enteras permeabilizadas o las mitocondrias aisladas. ^{16,17,18,19,20} En este ensayo, la luciferasa se ​​une a ATP y cataliza la oxidación y de quimioluminiscencia de luciferina. ²¹ La intensidad de la luz emitida es proporcional a la cantidad de ATP en la mezcla de reacción. ²²

Estos métodos han revelado la información fundamental sobre la función mitocondrial, incluyendo el hallazgo de que los pacientes con enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, tienen niveles anormalmente bajos de ATP. ²³ Sin embargo, no se puede utilizar la imagen de vida, las células intactas. Por otra parte, los métodos basados ​​en el análisis de células enteras proporcionan un promedio de estado redox o los niveles de ATP en todos los compartimentos de la célula. Medidas en orgánulos aislados son potencialmente problemático porque los niveles de ATP estado o redox mitocondrial pueden cambiar durante el fraccionamiento subcelular. Por último, estudios recientes de nuestro laboratorio y otros indican que losmitocondrias dentro de las células individuales son heterogéneos en función, que a su vez afecta a la vida útil de las células madre y la hija. ³ Por lo tanto, hay una necesidad de medir los niveles de ATP mitocondrial y el estado redox en las células vivas con la resolución subcelular.

Los biosensores para la función mitocondrial aquí descritos están basados ​​en las buenas prácticas agrarias. GFP sensible a redox (roGFP) ^24,25 es una variante de GFP en el que se añaden expuestos en la superficie cisteínas de la molécula. roGFP, como GFP de tipo salvaje, tiene dos picos de excitación (400 nm a ~ y ~ 480 nm) y un pico de emisión a ~ 510 nm. La oxidación de los residuos de cisteína en los resultados roGFP en un aumento de la excitación a ~ 400 nm. Reducción de las cisteínas favorece excitación a ~ 480 nm. Por lo tanto, la relación de 510 nm de emisión tras la excitación de roGFP a 480 nm y 400 nm revela la cantidad relativa de reducido y oxidado roGFP, que refleja el estado redox del medio ambiente del fluoróforo.

Dos versiones de roGFP son ampliamente utilizados: roGFP1 y roGFP2. Ambos contienen las mismas inserciones de cisteína. roGFP1 se basa en GFP de tipo salvaje y roGFP2 se basa en S65T de GFP, que tiene de excitación más eficiente a 480 nm de excitación y menos eficiente a 400 nm en comparación con wtGFP ^24. roGFP1 es menos sensible al pH que roGFP2 y su rango dinámico se extiende aún más en la gama reducida. Por lo tanto, roGFP1 puede ser más útil para el seguimiento de los compartimentos más reductores tales como mitocondrias o el citosol, y compartimentos con pH variable, como los endosomas. roGFP2 ofrece la señal más brillante y, en algunos estudios, un mayor rango dinámico que roGFP1 ^24,26. Los estudios en Arabidopsis thaliana indican que el tiempo requerido para la respuesta a los cambios en el estado redox es similar para ambos sensores (t ½ para la oxidación, 65 y 95 segundos y t ½ para la reducción, 272 y 206 segundos, para roGFP1 y roGFP2, respectivamente). ²⁶

MitGO-ATeam2 es mínimamente invasivo y confiablesensor que mide de ATP mitocondrial en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam es una transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) sonda que consiste en la subunidad ε del F _o F _1-ATP sintasa intercalada entre FRET donante y aceptor proteínas fluorescentes (GFP y la proteína fluorescente de color naranja (OFP), respectivamente). ²⁷ La unión de ATP a los resultados de la subunidad ε en los cambios conformacionales en la proteína que traen el donante de FRET en estrecha proximidad con el aceptor y permiten la transferencia de energía del donante al aceptor. Hay dos variantes de GO-ATeam, GO-GO-ATeam1 y ATeam2. GO-ATeam2 tiene una mayor afinidad por MgATP de GO-ATeam1, por lo que es más adecuado para la medición de la típicamente inferior [ATP] en comparación con las mitocondrias al citosol. ²⁷

Para sondear estado redox mitocondrial, se construyó una proteína de fusión (mito-roGFP1) que consiste en roGFP1 fusionado a la secuencia líder de una ATP9ND expresa a partir de un centrómero basado en (bajo número de copias) plásmido de expresión de levadura bajo el control del fuerte deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GPD) promotor (p416GPD, Addgene). Se utilizó roGFP1 para sondear el estado redox de las mitocondrias en el contexto del envejecimiento del modelo hongo Saccharomyces cerevisiae. Encontramos que roGFP1 puede detectar cambios en el estado redox mitocondrial que se producen durante el envejecimiento y en respuesta a la disponibilidad de nutrientes, pero no tiene ningún efecto perjudicial evidente en células de levadura. También vemos que la variabilidad en el estado redox de las mitocondrias dentro de las células de levadura vivas individuales, un hallazgo que pone de relieve la importancia de un biosensor con subcelular resolución espacial.

MitGO-ATeam2 es una variante de GO-ATeam2, que tiene la secuencia señal mitocondrial del citocromo c oxidasa subunidad VIII bis se inserta en el extremo amino de GO-ATeam2. ²⁷ Hemos modificado la sonda mitGO-ATeam2 (amablemente proporcionados por el laboratorio de H. Noji, Instituto of Investigación Científica e Industrial de la Universidad de Osaka, Japón) para su uso en la levadura subclonando que, a través de Xba1 y sitios HindIII, en el vector de expresión de levadura pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, EE.UU.), que es una copia de baja plásmido que contiene el promotor fuerte de GPD constitutivo. Expresamos mitGO-ATeam2 en ciernes levadura, y encontramos, por tinción de contraste con el ADN vinculante tinte DAPI, que se localiza exclusivamente en la mitocondria, donde sirve como una sonda eficaz para medir los cambios fisiológicos en los niveles de ATP mitocondrial.

roGFP y GO-ATeam son tanto codificados genéticamente. Como resultado de ello, pueden ser introducidos y mantenidos de forma estable en células intactas, y proporcionan información sobre el estado redox o los niveles de ATP en las células individuales, que viven. Por otra parte, ambos biosensores seguimiento de los cambios en el estado redox o los niveles de ATP que se producen en condiciones fisiológicas. ²⁸ Ambas sondas también son radiométrica. Como resultado de ello, las mediciones realizadas con estas sondas no se ven afectados por changes en la concentración de biosensor o iluminación de la muestra o el espesor. Por último, ambos biosensores proporcionan subcelular resolución espacial. En efecto, roGFP se ha dirigido a las mitocondrias, ER, endosomas y peroxisomas ^24, y puede detectar cambios en el estado redox de cada uno de estos orgánulos, en gran medida independientes del pH.

Protocolo

1. La transformación de células de levadura con los biosensores

1. Transformación de la cepa de levadura deseada con cojinete plásmido mito-roGFP o mitGO-ATeam2 utilizando el método de acetato de litio ^27.
2. Para confirmar la transformación con el plásmido biosensor transmitidas y para prevenir la pérdida del plásmido, seleccionar y mantener los transformantes sobre el medio completo sintético selectivo apropiado (SC-ura para Mito-roGFP, o SC-Leu para mitGo-ATeam2). Si la sonda fluorescente se ha subclonado en un plásmido diferente de los descritos aquí, usar el medio selectivo apropiado. Visualizar transformantes por microscopía de fluorescencia para confirmar que expresan el biosensor fluorescente y exhibir la morfología mitocondrial normal.

2. Crecimiento de las Células y Preparación de la Imagen

Función de la célula y la respuesta al tratamiento con fármacos son altamente dependientes de la densidad celular y la actividad metabólica. Los mejores resultados se obtienen cuando las célulasestán en división activa (fase semi-log, ~ 0,5-1 x 10 ⁷ células / ml). La forma más confiable para generar cultivos en fase logarítmica media de densidad constante es inocular a partir de una pre-cultivo en fase estacionaria.

1. Preparar un pre-cultivo en fase estacionaria: recoger una única colonia de células transformadas a partir de una placa e inocular medios líquidos selectivos (5 ml en un tubo cónico de 50 ml de fondo). Crecen a 30 ° C con agitación a 225 rpm hasta que la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD ₆₀₀₎ ha alcanzado una meseta (24-48 h).
2. Preparar un cultivo en fase logarítmica media para la observación: utilizar el volumen apropiado de pre-cultivo para inocular 5 ml de medio selectivo en un tubo cónico de 50 ml de fondo. YPD los medios de comunicación es autofluorescente y no debe ser utilizado para estos estudios. Utilice glucosa base, deserción medios sintéticos completos, (SC-Ura). Se cultivan las células a 30 ° C, agitando a 225 rpm, durante 4-16 horas, hasta que alcanzan la fase logarítmica media (~ 0.5 - 1 x 10 ⁷ células / ml). La densidad celular se puede determinarmediante la medición de OD _600; calibrar el espectrofotómetro para determinar la correcta lectura OD _600. En nuestro Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), la fase logarítmica media corresponde a un OD ₆₀₀ de 0,1 a 0,3.

Mito-roGFP1 sentidos fluctuaciones en el orgánulo en respuesta a los cambios metabólicos. Por ejemplo, en este ensayo mitocondriales cambios de estado redox cuando la levadura crecer en fuentes de carbono fermentables (por ejemplo, glucosa, como en los medios de comunicación SC) frente a las fuentes de carbono no fermentables (por ejemplo, glicerol, como en SGlyc medios de comunicación), e incluso en diferentes lotes de la misma los medios de comunicación. Por lo tanto, utilizar el mismo lote de medios de comunicación para todos los experimentos.

3. Las células están listas para la concentración (véase el paso 2.4) y las imágenes si no se realiza ningún tratamiento. Si las células están siendo tratados, incubar las células con el tratamiento adecuado y continuar con el paso siguiente.
4. Concentrado 1 ml de cultivo por centrifugación a 6000 xg durante 15 seg yla resuspensión del sedimento celular en 20 l de los medios de comunicación. Estas condiciones maximizar el número de células distinguibles en el campo de visión.
5. Aplicar 2 l de las células resuspendidas a una diapositiva. Cubrir con un cubreobjetos (N º 1.5, preferiblemente de alto rendimiento 170 ± 5 m de espesor), y sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente o valap (véase Reactivos). Para sellar con valap, fundir una pequeña cantidad en una espátula de metal por sosteniéndola sobre llama de un mechero Bunsen, luego se extendió una pequeña cantidad a lo largo de los bordes del cubreobjetos.
6. Mantener las células a 30 ° C durante la formación de imágenes. Un calentador de objetivo sobre la lente de inmersión en aceite de 100x utiliza para la imagen trabaja bien para esta aplicación. En estas condiciones, la morfología mitocondrial, estado redox y los niveles de ATP permanecen sin cambios durante la formación de imágenes durante 10-15 min.

3. Configuración de imagen

1. Configuración para imágenes mito-roGFP1 en un microscopio de fluorescencia de campo amplio
   Los pasos que aquí se adaptan a la AxioObserver.Z1 microscopio equipado con una fuente de Colibri LED de excitación, un gran campo Orca ER cámara y software de adquisición de Axiovision. Photobleaching de ambos canales y fotoconversión de oxidados mito-roGFP1 se reduce significativamente el uso de la iluminación del LED en comparación con el arco de mercurio de la lámpara de iluminación (ver más abajo).
   Para maximizar la señal y la resolución, utilice la más alta apertura numérica posible en el objetivo, y el aumento más bajo que proporciona suficiente resolución espacial. Además, para Mito-roGFP formación de imágenes, compruebe que el objetivo transmite bien a 365 nm. El 100x/1.3NA CE PlanNeofluar objetivo (Zeiss) funciona bien para esta aplicación.
   Configure el software de adquisición de capturar las especies mito-roGFP1 oxidadas y reducidas. Utilizamos las siguientes condiciones.
   1. Configure el canal para oxidar mito-roGFP utilizar excitación a 365 nm (100% de potencia LED) y un filtro de emisión adecuados para las buenas prácticas agrarias, como el Juego de filtros 38 HE (Zeiss), con el excitatio incluidon filtro elimina de la cubo. La eliminación del filtro de excitación permite excitación a 365 nm y ambos 470 nm sin la necesidad de cambiar los filtros, aumentando así el tiempo de resolución alcanzable.
   2. Configure el canal para reducir el mito-roGFP utilizar excitación a 470 nm (100% de potencia LED) y, como se mencionó anteriormente, el mismo cubo filtro de emisión utilizado para la oxidación mito-roGFP. Coloque la cámara en 1x1 agrupación para optimizar la resolución espacial.
   3. Establecer programas para adquirir pila az consta de 11 cortes con espaciado de 0,5 m, la recogida de los dos canales en cada posición de z. Este modo de adquisición es más lenta que la adquisición de cada pila z, a su vez, pero impide que los artefactos derivados de movimiento mitocondrial entre la adquisición de los canales oxidada y reducida.
   4. Image varias células para determinar un tiempo de exposición apropiado, produciendo una señal de saturación fuerte pero no. Es importante mantener la relación de tiempos de exposición para oxidado y reducido mito-roGFP1 para todos experimentos. Por ejemplo, si los tiempos de exposición para oxidado y reducido mito-roGFP1 son 300 y 100 ms, respectivamente, entonces el tiempo de exposición para oxidado mito-roGFP1 debe ser 3 veces mayor que para la reducción de mito-roGFP para todos los experimentos.
2. Configuración para imágenes mitGO-ATeam2 en un microscopio confocal espectral
   Para cuantificar los niveles de ATP utilizando mitGO-ATeam2, la fluorescencia de GFP (máximos de emisión 510 nm) debe distinguirse de la que a partir de OFP (máximo de emisión 560 nm). Hay juegos de filtros de fluorescencia que resuelven la fluorescencia emitida por estos fluoróforos. Sin embargo, nos encontramos con que un detector espectral, disponible en muchos microscopios confocal láser, que funciona mejor para esta aplicación. Un detector espectral separa la emisión de fluorescencia en muchos componentes (típicamente 32 o más) de acuerdo con la longitud de onda. Varias bandas de longitud de onda adyacentes se pueden combinar en un solo canal de la imagen. Las longitudes de onda a ser combinados se seleccionan empíricamente a fin de maximizar la señal de GFP y la OFP y evitar cruce de señal que confundir la medición de FRET. Utilice el más alto objetivo de apertura numérica disponible. Utilizamos un 100x/1.49 o 60x/1.49 lente Apo-TIRF. Usamos la Nikon A1R microscopio confocal con software Elementos NIS. Configure el software de adquisición de capturar la especie mitGO-ATeam2 ATP y con plazos ATP-independiente. Utilizamos las siguientes condiciones.
   1. Establecer pinhole de 1,0 unidades de Airy (UA), que en nuestro sistema corresponde a la resolución az de unos 0,42 m.
   2. Ajuste zoom de exploración para acercarse al límite de muestreo de Nyquist, que maximizará la información espacial en la imagen. En nuestro sistema, el tamaño del píxel es de 0,12 micras.
   3. Debido a las mitocondrias pueden moverse durante la exposición, puede ser útil para aumentar la velocidad de imagen recortando el campo a 512 x 256 píxeles. El tiempo total requerido para un cuadro de imagen en nuestro sistema es 1,0 seg, incluyendo un medio de exploración de 2 veces. Dependiendo de la resolución espacial deseada, el campo se puede recortar cada vez más ae resolución de tiempo.
   4. Excite a 488 nm, y recoger las emisiones 500-520 nm para GFP, y 550 a 580 nm para la OFP. Valores óptimos reales pueden variar con las características del sistema de formación de imágenes.
   5. La potencia del láser óptima para nuestro sistema es entre 6,0 y 6,4%. La potencia láser óptima variará para cada sistema de microscopio, pero, idealmente, ser tan bajo como sea posible y seguir produciendo una imagen interpretable. Utilice un medidor de potencia interna o externa para monitorear los cambios en la potencia del láser, que se producen normalmente con el tiempo en cualquier sistema óptico.
   6. Ajustar la ganancia del detector y la intensidad de luz de iluminación para maximizar el rango de valores de píxel detectado pero evitar la saturación de la señal, para tantas celdas como sea posible. No analizar las células que contienen más de 1% de píxeles saturados. Imagen todas las muestras utilizando el mismo objetivo, la potencia del láser, escaneo zoom, tamaño de píxel, la ganancia y offset.

4. Adquisición de imágenes

1. Localice el pla focal ne de las células de interés utilizando luz transmitida para minimizar la decoloración sonda fluorescente.
2. Después de localizar una o más células de interés, recoger una serie z-a través de toda la profundidad de una célula típica (aprox. 7 micras) utilizando un tamaño de paso de 0,5 micras.
3. Imagen otras células de interés en la diapositiva, pero sin hacer una sola imagen de diapositiva durante más de 15 min. Después de 15 min en la diapositiva, las células pierden su viabilidad.

5. Análisis

Nivel de ATP mitocondrial se determinó mediante la medición de la relación de la emisión mitGO-ATeam2 a 560 nm que a 510 nm en ²⁷ El estado redox del orgánulo se mide como el reducido a oxidado (R / S) relación de Mito-roGFP;. Es decir emisión a 510 nm tras excitación a 470 nm dividida por la emisión a 510 nm tras excitación a 365 nm. Antes de calcular la relación, restamos fondo y determinar un valor umbral para los píxeles pertenecientes a la mitocondria fluorescente.

tienda de campaña "> dominio público (por ejemplo, ImageJ ³⁰⁾ o disponible en el mercado (por ejemplo, Volocity, Perkin-Elmer) de software se puede utilizar para el análisis de Mito-roGFP1 o mitGO-ATeam2. Dependiendo del software utilizado para la adquisición de la imagen y para el análisis, las imágenes puede que necesite convertir a otro formato, como TIFF, antes de abrirlos en el software de análisis. Si las imágenes se convierten, es esencial para verificar que los valores de píxel no se cambian durante la conversión. Análisis de los datos de Mito-roGFP1, utilizando se describen los dos programas a continuación. menús de programa y opciones para elegir dentro de cada menú se resaltan en negrita y cursiva.

5.1 Análisis ImageJ

1. Abrir imágenes y cambiar el tipo de 32 bits: imagen → Tipo → 32 bits.
2. Dibuje una región de interés (ROI) en un área donde no hay células. Calcular la media de intensidad en este retorno de la inversión: Analizar → Medir.
3. Reste el fondo media calculada a partir de la pila: Proceso → Matemáticas → Resta.
4. Uso de la z-stack resta, encontrar el trozo central y el umbral de las mitocondrias: Imagen → Ajustar → Umbral y haga clic en Aplicar en la ventana Umbral. Aplicar a todas las rebanadas en la pila. Marque la casilla Establecer píxeles de fondo de NaN.
5. Crear la relación z pila: Proceso → Calculadora Image Divida la pila reducida por la pila z oxidado para el análisis mito-roGFP1. Divide la imagen 560 nm (ATP determinada) por los 510 nm imagen (ATP unido) para el análisis mitGO-ATeam2.
6. Dibuja un ROI alrededor del área de interés. Seleccione Analizar → Herramientas → ROI Manager, haga clic en Agregar para registrar el retorno de la inversión. Regiones múltiples pueden ser almacenados en el gestor. En ROI Manager, seleccionar todo ROI, a continuación, elija M→ mineral de medidas múltiples para medir todos los sectores de la pila. Exportar datos a una hoja de cálculo para su análisis.

5.2 Análisis Volocity

1. Importación de imágenes en una biblioteca Volocity y crear una secuencia de imágenes de 2 canales.
2. Dibuje una región de interés (ROI) en un área donde no hay células. Seleccione: Herramientas → Ratio.
3. Utilice Volocity para calcular el fondo: obtener de retorno de la inversión.
4. Ajuste del umbral para incluir estructuras mitocondriales.
5. Marque la opción de aplicar una LUT arco iris para el canal de relación. El canal de intensidad modulada puede producir una imagen menos ruidoso para presentación, pero no debe ser utilizado para la cuantificación de la relación de la media.
6. Seleccione la pestaña de Medición, seleccione el canal de relación y sacar un rendimiento de la inversión en la zona de interés. Mida el canal de relación, con exclusión de los valores cero. Regiones múltiples pueden ser seleccionados y medidosal mismo tiempo. Exportar datos a una hoja de cálculo para su análisis.

Resultados

Medición del estado redox mitocondrial con mito-roGFP

Aquí, mostramos que mito-roGFP1 tiene el rango dinámico para detectar cambios en el estado redox mitocondrial de totalmente oxidado a reducido en células de levadura viva, sin afectar el crecimiento de células de levadura o en la morfología mitocondrial. En primer lugar, nos encontramos con las células que expresan GFP mitocondrias-dirigida y roGFP1 crecen a tasas normales (Figura 1A). La máxima tasa de crecimiento, ...

Discusión

A continuación, se describen los métodos para utilizar mito-roGFP1 y mitGO-ATeam2 como biosensores para evaluar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en células de levadura viva. Encontramos que la expresión del plásmido transmitidas por Mito-roGFP1 o mitGO-ATeam resultados en orientación cuantitativa a las mitocondrias, sin ningún efecto evidente sobre la morfología o distribución mitocondrial o en las tasas de crecimiento celulares. ³ Mito-roGFP1 puede detectar cambios en el estado redox m...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/