Promoción de la supervivencia y la diferenciación de células madre neurales con fibrina y factor de crecimiento cócteles después de la médula espinal severa lesión

Resumen

Matrices de fibrina que contienen factores de crecimiento se utilizaron para conservar las células madre neurales injertadas en los sitios de la transección completa de la médula espinal. Células injertadas llenaron completamente la cavidad de la lesión y diferenciarse en múltiples tipos de células neuronales, incluyendo las neuronas que se extendían axones en la médula espinal de acogida a través de largas distancias.

Resumen

Las células madre neurales (NSC) pueden auto-renovarse y diferenciarse en neuronas y células gliales. NSCs trasplantados pueden reemplazar las neuronas perdidas y glía después de la lesión de la médula espinal (SCI), y pueden formar relés funcionales para volver a conectar los segmentos de la médula espinal por encima y por debajo de la lesión. Estudios previos de injerto de las células madre neurales han sido limitados por incompleta la supervivencia del injerto dentro de la cavidad de la lesión de la médula espinal. Además, el seguimiento de la supervivencia de las células del injerto, la diferenciación, y la extensión proceso no había sido optimizada. Finalmente, en estudios previos, se registraron típicamente NSC de rata en cultivo para diferenciarse en glía cuando injertado a la médula espinal lesionada, en lugar de las neuronas, a menos que el destino se debió a un tipo específico de célula. Para abordar estas cuestiones, hemos desarrollado nuevos métodos para mejorar la supervivencia, la integración y la diferenciación de NSC a sitios de incluso severa SCI. NSC estaban recién aisladas de embriones día 14 la médula espinal (E14) desde una línea transgénica de ratas Fischer 344 estable que expresa fl verdeproteína uorescente (GFP) y se incrusta dentro de una matriz de fibrina que contiene factores de crecimiento; esta formulación destinada a conservar las células injertadas en la cavidad de la lesión y apoyar la supervivencia celular. NSCs en el cóctel factor de fibrina / crecimiento se implantaron dos semanas después torácica nivel 3 (T3) completos transección de la médula espinal, lo que evita los períodos pico de la inflamación. Injertos resultantes llenan completamente la cavidad de la lesión y se diferenciaron en neuronas tanto, que se extendían los axones en el huésped de la médula espinal sobre notablemente largas distancias, y glía. Los injertos de NSCs humanos cultivados que expresan GFP produjeron resultados similares. Por lo tanto, los métodos se definen para la mejora de injerto neural de células madre, la supervivencia y el análisis de los resultados in vivo.

Introducción

Lesión de la médula espinal (SCI) a menudo daños no sólo tractos de sustancia blanca que llevan señales desde y hacia el cerebro, sino también la materia gris central, causando la pérdida segmentaria de interneuronas y las neuronas motoras. La consecuencia de la lesión medular es la pérdida de tanto la función motora y sensorial por debajo de la lesión. Desafortunadamente, el sistema nervioso central adulto (SNC) no espontáneamente a regenerar, dando como resultado déficits funcionales permanentes ^1. Por lo tanto, la reconstrucción de la lesionada médula espinal adulta y la mejora de motor, sensorial y la función autonómica es un objetivo importante de la investigación de SCI. Las células madre neurales (NSC), ya sea directamente aislada de embrionarias o adultas del SNC, son células candidatos de peso para reemplazar las neuronas perdidas y glía. Por otra parte, estas células tienen el potencial para formar nuevos enlaces funcionales para restaurar la conducción axonal a través de un ^2,3 sitio de la lesión.

Hasta la fecha, no ha habido una elucidación detallada de la anatómica, electrophysiológica y efectos en el comportamiento de la formación de relé neuronal por NSCs trasplantados después severa SCI. Hay varias razones para esto: primero, NSCs trasplantados o tejido fetal CNS sobrevivir mal cuando se injertan en grandes cavidades de la lesión. Estudios previos muestran una pérdida sustancial de células temprano, dejando grandes cavidades lesión quística vacías ^4,5. En algunos estudios, las células injertadas serían posteriormente se dividen y se llenan la cavidad de la lesión ^{de 4,5,} pero esto puede ocurrir después de un retraso de días o semanas, y posterior llenado sitio de la lesión podría no ser completa o coherente. En segundo lugar, un sistema de seguimiento eficaz que proporciona datos fiables sobre la supervivencia celular, la diferenciación / maduración, y el crecimiento de NSCs trasplantados era deficiente. La mayoría de los estudios iniciales utilizados anterógrada y retrógrada etiquetado para rastrear las proyecciones axonales de trasplantes de ^2,3. Sin embargo, estas técnicas sólo parcialmente y, a menudo proyecciones axonales poco clara etiquetados derivados de células injertadas, y métodos de trazadores son subjetivost de artefactos causados ​​por fugas de tinte más allá de las células implantadas. Otros grupos utilizan marcadores neuronales específicos humanos para etiquetar las proyecciones axonales después del trasplante de NSC fetales humanos en roedores lesionada de la médula espinal ^5,6. Sin embargo, en estos estudios, los xenoinjertos no sobrevivieron consistentemente bien. Recientemente, se utilizó la entrega viral del gen reportero GFP para etiquetar NSC cultivadas ^7,8. Sin embargo, la expresión de GFP fue a menudo incoherente y puede ser regulado a la baja ^7. Recientemente, el uso de ratones donantes transgénicas o ratas de forma estable que expresan el gen reportero, GFP, o la fosfatasa alcalina de placenta humana, ha mejorado espectacularmente el seguimiento de los trasplantados neurales células madre / progenitoras in vivo ^9,11. En tercer lugar, varios estudios indican que in vitro NSCs rata cultivadas derivadas de cualquiera embrionarias o adultas del SNC se diferencian exclusivamente en linajes gliales cuando se trasplantan en el medio de la cor espinal adulta intacta o lesionadad ^7,12,13, a pesar del hecho de que estas células madre neurales son capaces de diferenciarse en neuronas y glía tanto in vitro, lo que indica que los entornos locales pueden dictar el destino de las células madre. Alternativamente, NSC cultivadas, especialmente los derivados de SNC adulto, pueden tener propiedad intrínseca defaulty de diferenciarse en linajes gliales in vivo ^13.

Debido a las limitaciones mencionadas anteriormente, nuestro grupo ha desarrollado recientemente un nuevo protocolo para mejorar embrionario seguimiento NSC, la supervivencia y la diferenciación / maduración en el adulto con lesiones graves de la médula espinal. En pocas palabras, empezamos con una línea transgénica Fischer 344 ratas inbreed estable que expresa un gen reportero GFP que sustenta la expresión de GFP después in vivo del trasplante ^14. A continuación, se utilizó NSC recién aisladas de día embrionario 14 Fischer 344 de la médula espinal, una etapa de desarrollo que conserva el potencial de generar ambas neuronas y glía. Finalmente, inmersosNSCs recién disociadas en una matriz de fibrina que contiene factores de crecimiento ^15-17 para retener las células y distribuir uniformemente dentro de una gran cavidad de la lesión, con el objetivo de apoyar la supervivencia de las células del injerto, la diferenciación y la integración. Los injertos se colocan en sitios de T3 transección completa, dos semanas después de la lesión de la médula espinal. Estas células injertadas llenan constantemente sitios transección completa y diferenciarse en neuronas abundantes que se extendía un gran número de axones en la médula espinal de acogida a través de largas distancias ^18. Se obtuvieron resultados similares usando cultivadas injertos de células madre neurales humanas a inmunodeficientes ratas ^18.

Protocolo

Todos los animales protocolos sean aprobados por VA-San Diego Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). Directrices del NIH para el cuidado de animales de laboratorio y seguridad se siguen estrictamente. Los animales tienen acceso libre a comida y agua durante todo el estudio y se tratan de forma adecuada para reducir al mínimo el dolor y el malestar.

1. Preparación de fibrina componentes que contiene el factor de crecimiento Cocktails

1. Disolver 25 mg de fibrinógeno de rata en 0,5 ml de PBS para obtener 50 mg / ml de solución madre 2x (ver tabla de Materiales). El fibrinógeno es difícil de disolver y se debe colocar en un 37 ° C incubadora o baño de agua y se agita cada 5-10 minutos durante 1-2 horas.
2. Disolver 100 trombina rata de la ONU en 2 ml de 10 mM estéril _de CaCl2 para obtener 50 U ml 2x solución / acción.
3. Disolver los factores de crecimiento en PBS a las siguientes concentraciones para obtener una solución de 100 l existencia: 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (alta concentración de valores como la infusión intratecal in vivo ^{19); 200 g / ml: GDNF; IGF; bFGF; EGF; PDGF; aFGF; HGF (aproximadamente 1.000 veces superior a la utilizada para el cultivo de células).}
4. Disolver 25 mg MDL28170 (inhibidor de la calpaína) en 1,3 ml de DMSO para obtener 50 mM solución madre de DMSO y luego se diluye 50 veces en PBS para obtener 1 mM solución madre.
5. Mezclar 100 l de cada componente de factor de crecimiento y 100 l de MDL28170 (solución madre 1 mM) para producir 1000 l solución de factor de crecimiento de cóctel (Figura 1).
6. Mezclar 500 solución de fibrinógeno l 2x con 500 l de crecimiento factor de cóctel para obtener una solución de 25 mg / ml de fibrinógeno de trabajo que contiene factores de crecimiento y alícuota en 10 o 20 l para el almacenamiento a -70 ° C. La solución es estable durante un máximo de 12 meses a -70 ° C.
7. Del mismo modo, mezclar 500 l de trombina solución 2x ​​acción con 500 l de cóctel del factor de crecimiento para obtener la solución de trabajo 25 U / ml de trombina que contiene factores de crecimiento y alícuota en volúmenes de 10 o 20 l similares para el almacenamiento de unt -70 ° C durante un máximo de 12 meses.
8. En el día del injerto, colocar cócteles de fibrinógeno y del factor de crecimiento que contiene trombina en hielo hasta que se mezcla con las células.

2. T3 Spinal Cord transección

1. Anestesie hembra adulta Fischer 344 ratas o ratones atímicos usando métodos aceptables. Los sujetos son profundamente anestesiados, cuando la capacidad de respuesta a la cola y la pata pizca están completamente ausentes. Nota: Utilizamos típicamente 150-200 g ratas Fischer o 180-220 g ratas atímicos, y un cóctel de anestesia (2 ml / kg) de ketamina (25 mg / ml), xilazina (1,3 mg / ml) y acepromazina (0,25 mg / ml).
2. Aplicar pomada para los ojos para evitar la sequedad o lesiones de los ojos de los animales mientras están bajo anestesia.
3. Afeitar el área torácica superior y limpie la piel con Betadine.
4. Cortar la piel y el músculo con el n º 15 blade, exponer vértebra T3 usando un retractor quirúrgico, y realizar una laminectomía en T3 vértebras para exponer T3 / 4 de la médula espinal usando una gubia.
5. Hacer una lonincisión longitudinal en la duramadre de aproximadamente 2 mm de largo con una cuchilla # 11.
6. Coloque iridectomía tijeras debajo de la duramadre para cortar el lateral derecho de toda la médula espinal. Haga otro corte en el mismo lado 1,5 mm más cadually.
7. Aspirar el tejido de la médula espinal entre los dos segmentos de corte con un objeto contundente 23 G aguja conectada a vacío intensidad moderada. Utilice la verificación visual para garantizar la transección completa ventral y lateral. Esto completará una hemisección lateral.
8. Para extender la lesión a una transección de la médula espinal de ancho completo, coloque incisiones espejo en el hemicord izquierda. Intento de salir de la duramadre intacta, que no sea el primer corte, para retener la matriz de injerto / fibrina firme en el sitio de la lesión cuando se injertan dos semanas más tarde.
9. Sutura del músculo, aplique polvo antibiótico y de primera necesidad de la piel.
10. Inyectar lactato (3 ml) de Ringer, Bannamine (2,5-5 mg / kg) y ampicilina (80-100 mg / kg) (véase el cuadro Materiales) inmediatamente después de la cirugía y mairatas ntain en una incubadora caliente hasta que se restablezca la termorregulación.
11. Vacíe la vejiga e inyectar la solución de Ringer y Ampicilina dos veces al día durante dos semanas, hasta el establecimiento de la vejiga reflejo de vaciado (Figura 1B).

3. Preparación de recién disociada día embrionario 14 Médula Espinal Neural Stem Cells

1. Obtener puras de maíz transgénicos ratas F344 GFP (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) de Recursos rata y el Centro de Investigación, Universidad de Missouri.
2. Inyectar 40 mg des-Gly ^10, [D-Ala ^6]-hormona luteinizante liberadora de hormona de etilamida (LHRH) diluido en PBS a una concentración de 200 mg / ml, por vía intraperitoneal (IP) por rata hembra madura (8 semanas de edad o más) después de 2 hr -3 inducción luz para la sincronización de recogida de embriones.
3. Aparearse con un maduro GFP homocigotos o heterocigotos noche rata macho de 4 días después de la inyección.
4. Recoger los embriones en día 13,5-14,5 postcoitus(PC) en tampón HBSS frío, examinar la expresión de GFP bajo unas gafas de sol "NightSea" linterna y filtros (BLS1 - BlueStar Linterna y Modelo VG1 filtro barrera) o un microscopio de fluorescencia.
5. Diseccionar la médula espinal a cabo asépticamente de cada feto GFP-positivas y eliminar las meninges que recubren y ganglios espinales adjunto con tijeras de iridectomía y joyeros pinzas finas.
6. Recoge las médulas espinales diseccionadas en 2 ml de tampón HBSS frío en un tubo de 15 ml cornical y mantener en hielo.
7. Siga referencia # 20 de disociar de médulas espinales diseccionadas:
   1. Brevemente, añadir 2 ml de 0,25% de tripsina-EDTA al tubo que contiene de médulas espinales diseccionadas (varios cables pueden ser digeridos juntos, 1 cable puede generar suficientes células para injerto de un sujeto) y digerir a 37 ° C durante 10-12 min.
   2. Detener la reacción con tripsina por la adición de 10 ml de DMEM que contiene 10% de FBS al tubo y se centrifuga el tejido a 2.500 rpm durante 2 min.
   3. Resuspender el tejido en 2 ml de medio de co Neurobasalntaining 2% B27, y triturar el tejido de la médula espinal usando cada vez más pequeñas pipetas Pasteur pulidas al fuego.
   4. Centrifugar las células a 2500 rpm durante 2 min, se resuspende en 2 ml de medio Neurobasal conteniendo B27, y las células de filtro con un filtro de células colador de 40 micras.
8. Contar las células con un hemocitómetro y dividir las células por igual en dos tubos Eppendorf.
9. Centrifugar las células y eliminar completamente el sobrenadante (1-2 min tienen la obligación de retirar todo el sobrenadante con una punta baja de vacío) para los cócteles del factor de crecimiento no se diluirán permaneciendo sobrenadante después de la resuspensión celular.
10. Resuspender cada medio de las células en el fibrinógeno o la solución de trabajo de trombina que contiene factores de crecimiento, respectivamente, a una concentración de 250.000 células / l (recuentos sedimento celular durante aproximadamente ⅓ volumen final) y colocarlos en hielo antes del trasplante (Figura 1A). Tenga en cuenta que el fibrinógeno puede cuajar de forma espontánea cuando se mezclan con célulass antes de combinar con la trombina en el sitio de la lesión / injerto; para evitar la gelificación prematura, mezclar las células en fibrinógeno inmediatamente antes del injerto de células in vivo.

4. Trasplante

1. Reexpose el lesionado T3 / 4 de la médula espinal dos semanas después de la transección de la médula espinal.
2. 5 l de fibrinógeno células y 5 trombina células mu l podrían ser inyectadas directamente en nueve puntos de la zona de la lesión a través del tejido de la cicatriz sellado y la duramadre intacta sin volver a abrir el sitio de la lesión.
3. Utilice una aguja 27 para crear 9 agujeros en la superficie del tejido de la cicatriz y la duramadre intacta 1-2 semanas después de la lesión: 3 en el centro (uno en el punto medio y dos en los laterales, y espaciados 0,5 mm entre sí) y 3 en tanto rostral y 3 en la interfaz de caudal (aproximadamente 0,5 mm rostral o caudal al centro de la lesión).
4. Se inyecta un medio volumen de solución de células fibrinógeno en tres puntos centrales de la zona de la lesión y un volumen de moneda en 3 puntos de la interfaz rostral y aqvolumen uarter en 3 puntos de la interfaz de caudal.
5. A continuación, inyecte inmediatamente células throbmbin en los mismos lugares. La mezcla de células de fibrinógeno y trombina células en el interior del sitio de la lesión se formará el gel de fibrina para mantener las células en lugar de la lesión y los cócteles de factores de crecimiento apoyará la supervivencia de las células. Las células se inyectaron utilizando pipetas de vidrio tirados conectados a un Picospritzer (General de válvula, Inc.).
6. Trasplante de NSC humanas cultivadas ²¹ en el mismo procedimiento descrito anteriormente, y el uso de fibrina y factor de crecimiento cócteles hechos a partir de reactivos humanos.

Resultados

Etiquetado inmunohistoquímico de GFP demuestra que NSC rata injertado resuspendieron en tampón fosfato salino (PBS) (que carece de una matriz de fibrina y factores de crecimiento) sobrevivido mal en el sitio de la transección T3, sólo a la fijación de margen de la lesión / anfitrión y dejando la mayor parte del sitio de la lesión vacío sin células injertadas (Figura 2A). La supervivencia de NSC mejoró cuando se co-injertado con matrices de fibrina por sí solos, pero el injerto no llenar comp...

Discusión

Uno de los principales obstáculos para la NSC el trasplante de la médula espinal lesionada es pobre supervivencia en el centro de la lesión. Todos los huecos o cavidades en el sitio de la lesión potencialmente podrían reducir o disminuir la formación de relés neuronales funcionales entre axones supraespinales y segmentos de la médula espinal separados por debajo de la lesión. Además, la mala supervivencia de NSCs injertadas puede afectar a su integración con el tejido del huésped, y por lo tanto reducir la c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml
bFGF (human)	Sigma	F0291 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
EGF (murine)	Sigma	E1257 (0.1 mg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
BDNF (human)	Peprotech	452-02 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
NT-3 (human)	Peprotech	452-03 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
GDNF (rat)	Sigma	G1401 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
IGF-1 (mouse)	Sigma	I8779 (50 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
aFGF (human)	Sigma	F5542 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
PDGF-AA (human)	Sigma	P3076 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
HGF (human)	Sigma	H9661 (5 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
MDL28170	Sigma	M6690 (25 mg)	Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM
PBS	Millipore	BSS-1005-B	Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x
DMSO	Sigma	D2650
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Xylazine	Lloyd	0410,	2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml
Betadine	Healthpets	BET16OZ
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 ml/inj
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml
LH-RH	Sigma	L4513	200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml
HBSS	Gibco	14175-096
Trypsin	Gibco	25200056	Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 %
DMEM	Gibco	11995073
FBS	Gibco	16000044	Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 %
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
B27	Gibco	17504044	Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x
Note, use human reagents for grafts of human NSCs