Transección del nervio tibial - Un modelo normalizado para la atrofia del músculo esquelético denervación inducida en ratones

Resumen

El modelo de transección del nervio tibial es un bien tolerado, validado, y reproducible modelo de atrofia del músculo esquelético. El modelo de protocolo quirúrgico se describe y se demuestra en C57Black6 ratones.

Resumen

El modelo de transección del nervio tibial es un bien tolerado, validado, y reproducible modelo de atrofia del músculo esquelético inducida por desnervación en roedores. Aunque originalmente desarrollado y utilizado ampliamente en la rata, debido a su tamaño más grande, el nervio tibial en ratones es lo suficientemente grande que pueda ser manipulado fácilmente, ya sea con aplastamiento o transección, dejando las ramas del nervio peroneal y sural del nervio ciático intacta y preservando así sus músculos en cuestión. Por lo tanto, este modelo ofrece las ventajas de la inducción de una menor morbilidad y impedimento de la deambulación que el modelo de transección del nervio ciático y también permite a los investigadores estudiar los mecanismos biológicos fisiológicos, celulares y moleculares que regulan el proceso de la atrofia muscular en ratones diseñados genéticamente. El nervio tibial suministra el gastrocnemio, sóleo y plantar los músculos, por lo que su corte transversal permite el estudio de los músculos esqueléticos desnervado compuesto por fibras de contracción rápida de tipo II y / o de tipo I de contracción lentafibras. Aquí se demuestra el modelo de transección del nervio tibial en el C57Black6 ratón. Evaluamos la atrofia del músculo gastrocnemio, como representante de un músculo, en 1, 2, y 4 semanas después de la denervación mediante la medición de los pesos musculares y del tipo de área de la sección transversal de la fibra específica en parafina secciones histológicas immunostained para la miosina rápida contracción.

Introducción

Denervación del músculo esquelético, debido a una lesión traumática de nervios periféricos, la enfermedad o la intervención farmacológica, resulta en la pérdida inmediata de la función contráctil muscular voluntario. Muscle concomitantemente comienza a atrofiarse y esta atrofia es reversible si reinervación oportuna y de buena calidad produce ^1,2. En la ausencia de reinervación, atrofia miofibrilar progresa, y cambios biológicos irreversibles en el músculo se produce con la fibrosis muscular y muerte miofibras. Aquí se demuestra el modelo de transección del nervio tibial, un modelo de la denervación inducida por la atrofia muscular y la fibrosis en los ratones. Este modelo permite a los científicos estudiar los mecanismos biológicos fisiológicos, celulares y moleculares que subyacen a la atrofia muscular in vivo en los músculos gastrocnemio y sóleo. Aunque se han utilizado históricamente predominante en ratas, más reciente aplicación de este modelo a nocaut y las líneas de ratones transgénicos en concreto, permite a los investigadores para evaluar el papel de la, las proteínas (s) de interés en la inducción, el desarrollo y el mantenimiento, o, alternativamente, la resolución de, la atrofia muscular y la fibrosis in vivo.

El nervio tibial es un nervio periférico del motor-sensorial mixta en la extremidad posterior de roedores, y es una de las tres ramas terminales del nervio ciático. Transección del nervio tibial desnerva el gastrocnemio, sóleo y plantar (músculos y los tres músculos flexores profundos y pequeños de los pies, incluyendo tibial posterior, flexor largo de los dedos y flexor largo del dedo gordo hallicus), y es un modelo bien estandarizado y validado en ratas ^3,4 . Los músculos gastrocnemio y sóleo pueden ser fácilmente diseccionados en puntos de tiempo de serie Publicación de transección del nervio tibial, fijaron y procesaron para la evaluación de la histología muscular y morfometría de la fibra muscular, o el flash congelado para la extracción de ARN y de proteínas musculares para el propósito de estudiar, por ejemplo, las redes de señalización celular que regulan la atrofia muscular. El gamuscular strocnemius es un tipo de fibra muscular mixta (de tipo I y de tipo II, aunque predominantemente de tipo II) y el músculo sóleo se compone de una gran proporción de fibras de tipo I, proporcionando de este modo contracción muscular a la vez rápido y lento para la evaluación de ^5,6. El modelo de transección del nervio tibial es adecuado para estudiar el proceso de denervación inducida por la atrofia muscular, tanto a corto plazo (días) ⁷ y largo plazo (semanas a meses) ^4,8.

En contraste con el modelo de transección del nervio ciático (un segundo modelo de la denervación inducida por la atrofia muscular comúnmente utilizado en roedores), la transección del nervio tibial induce una menor morbilidad en el animal, por lo que es un modelo más atractivo. Transección del nervio ciático desnerva todos los músculos de la pierna (debajo de la rodilla) y el pie, mermando la capacidad del animal para caminar ^2, mientras que la transección del nervio tibial deja las ramas del nervio peroneo y sural del nervio ciático intacto, conservando asísus músculos en cuestión y territorios sensoriales. El ratón es incapaz de flexión plantar o invertir el pie, pero es capaz de deambular fácilmente y el peso lleva igualmente en ambas extremidades traseras, disminuyendo así significativamente la morbilidad del modelo. Estudios de análisis de la marcha que evalúan los patrones de caminar se han realizado en ratas después de lesiones del nervio tibial y ciático y demostrar que la huella y la carga de peso se conserva mejor con una lesión tibial ^9,10. Además, en el modelo de transección del nervio tibial, el nervio peroneo puede ser movilizado en un punto de tiempo más tarde y se transfiere como una fuente de reinervación retardada, si el diseño del estudio requiere ^3. En contraste, la reinervación retardada en el modelo de transección del nervio ciático hace necesario el uso de un injerto de nervio al déficit nervio ciático, muy significativamente el aumento de la dificultad técnica del modelo y la limitación de su uso para cirujanos expertos.

Mientras que el modelo de transección del nervio tibial requires familiaridad del operador con la técnica quirúrgica estéril en cirugía animal, tanto el nervio tibial y los músculos de la pantorrilla que inerva son fácilmente accesibles e identificables para la manipulación, de manera que las personas que no son cirujanos, o una amplia experiencia con la cirugía animal, pueden dominar fácilmente este modelo .

Protocolo

Antes de utilizar este modelo, los investigadores deben haber recibido la aprobación para el protocolo quirúrgico del uso de los animales de su institución órgano de gobierno. El modelo es aprobado por la Junta de Ética de la Investigación, Hamilton Health Sciences Corporation, la Universidad McMaster (AUP # 10/04/24) y se lleva a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones formuladas por el Consejo Canadiense de los Animales.

1. Ratón Preparación

1. Pesar el ratón. Inducir la anestesia con isoflurano al 5% o 2% de halotano. El circuito utilizado debe garantizar compactación adecuada de la anestesia para proteger el cirujano. Después de 2-3 minutos la respiración del animal se ralentizará. Asegúrese de que el reflejo de parpadeo está ausente y pellizcar los espacios interdigitales de la pata para confirmar la anestesia quirúrgica (es decir, no hay respuesta por el ratón). Aplicar lubricante oftálmica al ojo, para evitar el secado de la córnea durante la cirugía.
2. Shave la cara lateral del muslo y la nalga del ciáticoapuntarse a la rodilla y desinfectar con proviodine. Afeitar mantendrá el sitio de la incisión libre de pelo para asegurar una adecuada visualización del campo quirúrgico y para minimizar la interferencia con la disección del nervio y la transección. La escotadura ciática, que es superior y posterior en el fémur, se puede identificar mediante la palpación.

2. Procedimiento Operativo

1. Reducir por inhalación isoflurano al 2% (halotano 1%) y colocar el ratón sobre un lado (el lado destinado a la cirugía hacia arriba), con un microscopio operativo o disección. Alternativamente, la cirugía se puede realizar con lupas quirúrgicas desde ampliación 3.5X es satisfactoria para un adulto (20-25 g) del ratón.
2. Ponte los guantes estériles. Identificar la escotadura ciática por palpación. El uso de un escalpelo, incisión de la piel de la cara lateral del muslo de la escotadura ciática a la rodilla (aproximadamente 1 cm).
3. Suavemente separa la piel. Identificar el músculo bíceps femoral, que es el músculo superficial plana de la cara lateral del musloinmediatamente debajo de la piel. Con unas tijeras finas, dividir el músculo bíceps femoral a lo largo de las fibras musculares y mantenga abierto con un retractor de primavera para exponer el nervio ciático y sus ramas.
4. Identificar el nervio ciático inmediatamente la profundidad del músculo bíceps femoral. Puede ser identificado por su color blanco brillante característico y es de aproximadamente 0,8 mm de diámetro. Se extiende desde la escotadura ciática a la rodilla, se ramifican en los nervios tibiales, peroneo y sural a nivel de la fosa poplítea.
5. Separar suavemente el tibial de las ramas del nervio peroneo y sural con fórceps ultrafinas y primavera tijeras microdissecting. El nervio tibial es la rama más grande y suele ser central. Es importante no aplastar el nervio mientras que separa las ramas. Sosteniendo el nervio sólo en la capa adventicial exterior con las pinzas ultrafinas, y mantener la holgura del nervio (no enseñados), evitará aplastamiento del nervio y la lesión por tracción.
6. Para obtener información completa y duradera denervatien, cortar el nervio tibial con microdissecting tijeras como distalmente como sea posible, evitando cuidadosamente los vasos poplíteos. Alternativamente, para la denervación temporal con reinervación completa esperada en 2-4 semanas, el nervio tibial puede simplemente ser aplastado con fórceps ultrafinas de 15 segundos en lugar de seccionado. (Nervios periféricos vuelven a crecer después de la lesión y se reinervar músculo deseado.)
7. Si se requiere la denervación completa, suturar el extremo del nervio tibial cortado transversalmente a la superficie anterior del músculo bíceps femoral con nylon 10-0 y volver a aproximar el bíceps femoral con Vicryl 5-0 para evitar aberrante de re-inervación de los gastrocnemio y músculos sóleo.
8. Cierre la piel con una sutura de Vicryl 5-0 correr.

3. Cuidado operativo del poste

1. Apague la anestesia inhalatoria, pero mantener el flujo de oxígeno. Administrar buprinorphine (o sustituto) analgésico por vía subcutánea.
2. Transferir el ratón a una jaula limpia sinropa de cama, mientras que despierta de la anestesia. Mantener en una manta de calentamiento dentro de la jaula y bajo observación directa hasta deambular.
3. Transferencia y la casa en la jaula inferior suave (no cable) con amplia ropa de cama blanda.
4. Inspeccionar la extremidad operativa diaria para la condición de la herida quirúrgica y el pie para el desarrollo de las úlceras por decúbito talón o las pruebas de la masticación. Los problemas menores pueden ser tratados con antibióticos o antisépticos tópicos como proviodine. Indicadores de punto final que requieren la eutanasia de animales son la pérdida de peso, la evidencia de autocuidado deficiente (piel rizada) y postura encorvada. Además, los animales con mayor apertura de la herida o úlceras que no se curan en 1-2 semanas con antibióticos tópicos o parece tener dolor deberán ser sacrificados.

4. Gastrocnemius Denervado y cosecha del músculo sóleo

1. En el punto de tiempo después de la operación deseada, pesar el ratón y el sacrificio con sobredosis de CO _2.
2. Shave el aspecto medial de tanto laoperativa y las piernas de control contralateral y limpio con alcohol. Coloque el ratón en un microscopio operativo o disección, o alternativamente usar lupas quirúrgicas para la ampliación de visualización.
3. En la extremidad operativa, una incisión en la piel pierna medial con un bisturí desde el tobillo hasta la rodilla y circunferencialmente alrededor del tobillo. Tire suavemente la piel con pinzas fuera del músculo y proximalmente hacia el muslo. Esto expone a todos los músculos de la pierna. Identificar el músculo gastrocnemio, que es el músculo de la pantorrilla que se extiende desde la rodilla hasta el tobillo en la cara posterior de la pierna y se encuentra inmediatamente debajo de la piel. Identificar la inserción distal del músculo bíceps femoral, proximal al músculo gastrocnemio en la cara medial de la rodilla. En su inserción distal del bíceps femoral aparece delgada y transparente y se superpone a la porción más proximal del gastrocnemio. Con unas tijeras y disección extremo romo, separar suavemente la inserción distal del bíceps femoral del gasmúsculo gastrocnemio.
4. En su inserción distal en el calcáneo, el músculo gastrocnemio se estrecha en el tendón de Aquiles. Identificar el tendón de Aquiles, que aparece blanco y musculoso. Sostenga el tendón de Aquiles con unas pinzas, teniendo cuidado de no agarrar ni triture los músculos gemelos, y dividir el tendón de Aquiles de la inserción del calcáneo con unas tijeras.
5. Sin soltar el tendón, levante suavemente el músculo gemelo (rojo claro) fuera el sóleo profundas (más rojo), a partir de la inserción distal a su origen en la rodilla (el sóleo se pueden cosechar por separado).
6. Diseccionar el gastrocnemio de la pierna dividiendo el origen de los gastrocnemio de los chondyles fémur medial y lateral con unas tijeras. Tracción muy suave en el músculo facilita este proceso. Tenga cuidado de no aplastar el músculo.
7. Los sóleo ahora serán claramente visibles, inmediatamente debajo del sitio de los gastrocnemio. Levante el sóleo de su inserción en el tendón de Aquiles de su oigin en la pantorrilla posterior. Si el sóleo se eleva inadvertidamente con el gastrocnemio, suavemente separarlo de la muestra cosechada. El gastrocnemio (rojo claro) y sóleo (rojo oscuro) siguen siendo fácilmente identificables en la muestra recolectada, debido a sus diferencias de color.
8. Pesar los músculos por separado en una balanza de precisión.
9. Dividir los músculos verticalmente, un medio para la congelación en nitrógeno líquido a presión (para su posterior proteínas y / o extracción de ARN), y un medio para la histología (es decir, evaluación morfométrica, inmunohistología) que se fijan ya sea en 10% de formalina, o la fijación congelados en isopentano enfriado con nitrógeno líquido , si lo deseas.
10. Repita desde el paso 4.3 en el control, no operado, de lado a cosechar gemelo de control y los músculos sóleo.

Resultados

Transección del nervio tibial desnerva el gastrocnemio, sóleo y plantar los músculos de la pantorrilla. Aquí se evalúa el desarrollo de la atrofia en los músculos gemelos, como un músculo representativo. Músculo gastrocnemio fue cosechada de 2-3 meses de edad C57Black 6 ratones (Jackson Laboratories) denervado para 1, 2, o 4 semanas. Pesos musculares disminuyen progresivamente (Figura 1), al igual que el área de sección transversal de las fibras de tipo II musculares de contracción ráp...

Discusión

El modelo de transección del nervio tibial de la atrofia del músculo esquelético denervación inducida es un modelo comúnmente empleado y bien validado en ratas. Hemos adaptado este modelo para su uso en los ratones, lo que permite al investigador para tomar ventaja de la existencia de ratones modificados genéticamente y estudiar el proceso de la atrofia muscular in vivo en ausencia de proteínas cruciales para la regulación de la masa muscular ^7,8. Los músculos gemelos y sóleo, tanto desnerv...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
10-0 Nylon suture	Ethicon	2850G
5-0 Vicryl suture	Ethicon	J553G
Equipment
Spring microdissecting scissors	Fine Surgical Tools	15021-15
Ultra fine forceps	Fine Surgical Tools	11370-40
Non locking micro needle holder (driver)	Fine Surgical Tools	12076-12
Spring retractor	Fine Surgical Tools	17000-02