La detección, la visualización y cuantificación de la generación de especies reactivas de oxígeno en un sistema modelo de la ameba

Resumen

Se adaptó un conjunto de protocolos para la medición de especies reactivas de oxígeno (ROS) que se pueden aplicar en varios modelos celulares de ameba y de mamíferos para estudios cualitativos y cuantitativos.

Resumen

Especies reactivas de oxígeno (ROS) comprenden una gama de, moléculas que contienen oxígeno reactivas y de corta duración, que se interconvertir o eliminarse ya sea catalíticamente o espontáneamente dinámicamente. Debido a los cortos ciclos de vida de la mayoría de ROS y la diversidad de sus fuentes y localizaciones subcelulares, una imagen completa se puede obtener sólo por medio de mediciones cuidadosas usando una combinación de protocolos. A continuación, presentamos un conjunto de tres protocolos diferentes utilizando OxyBurst Green (OBG) recubierto con perlas, o dihydroethidium (DHE) y Amplex UltraRed (AUR), para controlar cualitativa y cuantitativamente diferentes ROS en fagocitos profesionales como Dictyostelium. Hemos optimizado los procedimientos de revestimiento cuentas y perlas revestidas de OBG usados ​​y microscopía en vivo para visualizar dinámicamente intraphagosomal la generación de ROS en el nivel de células individuales. Se identificaron lipopolisacárido (LPS) de E. coli como un potente estimulador de la generación de ROS en Dictyostelium. Además, Dtiempo real eveloped, ensayos de mediano rendimiento utilizando DHE y AUR para medir cuantitativamente superóxido intracelular y extracelular H ₂ O ₂ de producción, respectivamente.

Introducción

Especies reactivas de oxígeno (ROS) están involucrados en una amplia variedad de procesos biológicos tales como la defensa del huésped, señalización, el desarrollo del tejido y la respuesta a la lesión, así como la hipertensión y el cáncer. La maquinaria de la oxidasa NADPH phagosomal bien estudiado se dedica a la generación de ROS rápida, conocida como la explosión oxidativa, para matar las bacterias ingeridas en los fagosomas neutrófilos ^'1. Además, la fuga de electrones como un subproducto de la cadena respiratoria mitocondrial se pensaba que ser responsable sólo de una fuente no regulada de ROS. Sin embargo, recientemente, se identificó como un importante mecanismo para contribuir a la muerte intraphagosomal de bacterias en macrófagos de ratón ^2. En los últimos años, la ameba sociales, Dictyostelium, se ha convertido en un modelo de gran alcance y popular para estudiar mecanismos celulares intrínsecas de la respuesta inmune innata. De hecho, Dictyostelium y fagocitos humanos comparten un sorprendente alto nivel de conservación en moleculamaquinarias r responsables de las bacterias de detección, inmersión y matando a ^3,4. Los homólogos de proteínas y enzimas relacionadas con la producción o la desintoxicación de ROS, tales como NADPH oxidasas, catalasas, superóxido dismutasas, se pueden encontrar en humanos y Dictyostelium. A medida que la ameba mejor estudiado, Dictyostelium presenta varias ventajas únicas sobre modelo de sistema de los mamíferos. Crecen a temperatura ambiente sin la necesidad de CO _2, con un tiempo de duplicación de 8-10 horas. Se pueden mantener fácilmente como cultivos adherentes o de suspensión. Además, gracias a su genoma haploide totalmente secuenciado y anotado, y a la manipulación genética fácil, Dictyostelium se ha convertido en un muy atractivo organismo modelo experimental.

En estudios anteriores, diversos derivados clorados y fluorados de fluoresceína (conocidos colectivamente como OxyBurst verde, OBG) que emite fluorescencia después de la oxidación por ROS, se han utilizado como un reportero de ROS. Est Cell-permeantderivados erified se utilizan para medir citoplasmática de ROS, mientras que o dextrano-derivados de células impermeable acoplados a proteínas se utilizan para medir extracelular ROS. En particular, perlas recubiertas con BSA OBG ya han sido utilizados para detectar la producción de ROS en células de mamífero phagosomal ^5. Sin embargo, el enfoque basado en el lector de microplacas sólo puede dar una curva de generación de ROS promedio de una población de células. Con el presente protocolo, mediante el uso de Dictyostelium, un fagocito profesional, y condiciones experimentales optimizadas, obtenemos la fagocitosis estable y eficiente, sin conjugar cualquier opsonina sobre las perlas. DHE se ha utilizado en diversos sistemas modelo, como los neutrófilos y los macrófagos de mamíferos, para detectar la producción de ROS ^6-9. Mientras tanto, existen algunas controversias acerca de la especificidad y sensibilidad del método de ^8,10. Como una versión mejorada de Amplex Red, la intensidad de fluorescencia de AUR es menos sensible al pH, que lo hace más adecuado para medirROS en ambientes no neutrales o ligeramente ácidos. AUR se ha aplicado recientemente en varios sistemas de mamíferos ^11,12, pero su uso en modelos no mamíferos, que muy a menudo requieren medios de crecimiento débilmente ácido, no se ha informado todavía. Además, no hay ningún protocolo publicado para medir cuantitativamente y dinámicamente la producción de ROS y la localización en la ameba social de Dictyostelium.

El objetivo del conjunto de protocolos presentado es proporcionar una solución sencilla y versátil para controlar diversos ROS y su localización, y además dar una visión de los mecanismos celulares relacionados con el ROS. Para el ensayo de OBG, se utilizó la microscopía en vivo para supervisar todo el proceso de generación de ROS phagosomal después de la absorción de perlas revestidas de OBG por células de Dictyostelium, y nos proporcionó un nuevo enfoque para estudiar el mecanismo de la muerte intraphagosomal de bacterias. Hemos optimizado DHE y AUR ensayos de mediano rendimiento en Dictyostelium, para medir superóxido intracelularIDE y H extracelular ₂ O ₂ de producción, respectivamente, mediante el uso de LPS como un estimulador potente de ROS. Tenga en cuenta que el LPS se demostró recientemente para aumentar la actividad bactericida de Dictyostelium hacia bacterias fagocitadas ^13. Además, el tratamiento con DEDTC y catalasa confirmó explícitamente que estos dos métodos de medir específicamente los diferentes tipos y localizaciones subcelulares de ROS en Dictyostelium. Por último, el ensayo de OBG se puede adaptar a cualquier célula fagocítica adherente, por opsonizantes aún más las perlas con ligandos para receptores de células fagocíticas animales. En principio, los ensayos DHE y AUR también puede ser ajustado para mediciones en cualquier celular adherente o no adherente en condiciones experimentales adecuadas.

Protocolo

1. La visualización y valoración cualitativa de ROS producción en Fagosomas

Las perlas recubiertas con OBG deben estar preparados de antemano. Los procedimientos de revestimiento cuentas y técnica de superposición de agar fueron adaptadas de referencias publicadas ^5,14.

1. Añadir 1 ml de suspensión de 3,0 micras perlas de sílice carboxilados (alrededor de 1,8 x 10 ⁹ bolas) a un tubo de 1,5 ml, se lavan las perlas 3 veces con 1 ml de PBS por vuelta rápida y vórtex.
2. Resuspender las perlas en 1 ml de PBS que contenía 25 mg / ml de cianamida (para activar las perlas de sílice carboxilados unen covalentemente a premarcan BSA), incubar en una rueda durante 15 min.
3. Lave 3 veces con 1 ml de tampón de acoplamiento (0,1 M de borato de sodio, pH 8,0) por vuelta rápida (centrifugar a toda velocidad en una mini centrífuga de sobremesa durante 5 segundos o bien se centrifuga a 2000 × g durante 1 min en una centrífuga de mesa) y vortex para eliminar el exceso de cianamida.
4. Mezclar las perlas lavadas con 500 l de coupling tampón que contiene 1 mg de OxyBurst Green (OBG) H2HFF (dihidro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, llenar el tubo con gas nitrógeno a partir de un estándar de gas-can antes de la limitación, y incubar en una rueda de 14 horas (durante la noche) a TA en la oscuridad.
5. Lavar las perlas 2X con 1 ml de tampón de enfriamiento (250 mM de glicina en PBS) para eliminar sin reaccionar OBG, y dos veces con tampón de acoplamiento para eliminar el tampón de enfriamiento rápido por vuelta rápida y agitación en vórtex.
6. Añadir 1 ml de tampón de acoplamiento que contienen 50 g de Alexa Fluor 594 éster de succinimidilo para conjugar a BSA. Llenar el tubo con nitrógeno antes de la limitación, e incubar en una rueda durante 1,5 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.
7. Lave las perlas 3 veces con 1 ml de tampón de extinción por vuelta rápida y un vórtex para detener la reacción, después se lavan las perlas 3 veces con 1 ml de PBS por vuelta rápida y vórtex.
8. Finalmente, resuspender las perlas en 1 ml de PBS con 2 l de 10% w / v de azida para el almacenamiento a largo plazo. Mida la concentration de cuentas en la suspensión con un hemocitómetro (generalmente alrededor de 1-2 x 10 ⁹ cuentas / ml), llenar el tubo con nitrógeno antes de la limitación, y se almacena a 4 ° C en la oscuridad.
9. La eficacia del recubrimiento de la fluoresceína OBG se puede probar mediante la comprobación del espectro de emisión usando excitación a 500 nm. Cuando se oxida por H ₂ O ₂ en la presencia de peroxidasa de rábano picante (HRP), la intensidad de fluorescencia de perlas oxidados, en el pico de emisión (538 nm), es 11-12x mayor que el de perlas recubiertas no oxidado.
10. Cosecha en crecimiento exponencial Dictyostelium células de una placa de Petri de 10 cm, la placa de diferentes densidades de células de 3 cm de platos con un plástico ópticamente transparente o con fondo de cristal, y crecer durante la noche. Elija los platos que son aproximadamente el 80% de confluencia para el experimento. Un protocolo detallado para el cultivo de células de Dictyostelium ha sido publicada ^15.
11. Sustituya el medio de cultivo con medio LoFlo (medio LF), incubar2 horas antes del experimento con el fin de disminuir la autofluorescencia extracelular y intraendosomal del medio de cultivo HL5C.
12. En paralelo, derretir 10 ml de 1,5% de agar Bacto en medio LF, verter el agar en una superficie plana (es decir, una placa de vidrio de 10 cm x 10 cm) con el fin de formar una capa de agar sobre 1 mm de espesor, esperar a 10-15 min se solidifique. Cortar la capa de agar en 2 cm x 2 cm cuadrados y colocar en medio de LF para su uso posterior.
13. Mientras tanto, preparar el hilado de disco o ancho microscopio de campo, ajuste la temperatura de la cámara climática a 22 ° C y ajuste la configuración para este experimento. (Ver comentarios adicionales en la discusión).
14. Después de 2 horas de incubación, aspirar el medio de LF desde el plato de 3 cm, pero la monocapa de células todavía debería estar cubierta por una película fina de medio. Diluir las perlas recubiertas con 1,5 x 10 ⁷ perlas / ml, y añadir 10 l en la capa de células.
15. Tome una hoja de agar cuadrado, drenar el exceso de líquido, pero mantener húmeda. Coloque cuidadosamente the cuadrada de agar en la parte superior de la capa de células. No mueva la plaza agar cuando se está tumbado en las células. La capa de agar se utiliza para aumentar el contacto entre los granos y las células, mejorando de este modo la absorción, y también comprime ligeramente las células, manteniéndolos mejor en el plano focal del objetivo.
16. Coloque la tapa sobre el plato, colóquelo en la platina del microscopio, y automáticamente tomar fotos en los canales rojo, verde y fase cada 1 min durante 2 horas o más.
17. Seleccione y centrarse en los eventos celulares que contienen todo el proceso de fagocitosis. Combinar los 3 canales optimizados y montar las imágenes en una película utilizando el software profesional de procesamiento de imágenes. Cuantificar intensidades de fluorescencia de cada uno de los granos seleccionados en los canales rojo y verde, y la proporción de verde / rojo reflejará la phagosomal dinámica de ROS producción de las células.

2. Cuantitativa y Medianas rendimiento Medición de la Producción intracelular superóxido

1. Recoger oNE 80% plato confluente de Dictyostelium en 10 ml de medio HL5C. Centrifugar las células de Dictyostelium a 850 xg durante 5 min, con cuidado y exceso de medio completamente aspirado. Resuspender las células en tampón de SS6.4 [sorbitol 0,12 M en tampón de Sorensen (14,69 mM KH ₂ PO ₄ y 6,27 mM de Na ₂ HPO _4), pH 6,4], contar las células y diluir hasta una densidad final de 6 x 10 ⁶ células / ml (ver comentarios adicionales en la discusión).
2. Añadir 50 l de suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos no transparente blanco (ver comentarios adicionales en la discusión).
3. Diluir DHE de stock (30 mM en DMSO) 500 veces con SS6.4, pipeta de 50 l de DHE diluido en cada pocillo usando una pipeta multicanal si es necesario. La concentración final de DHE es 30 mM. La reacción se inicia inmediatamente.
4. Los estímulos o inhibidores se pueden añadir en este punto, o en otros puntos de tiempo de acuerdo a las necesidades específicas.
5. Utilice el punto de "la lectura y # top final34; modo de un lector de microplacas de fluorescencia, con excitación de fluorescencia / emisión a 522 nm/605 nm, leer cada 2 min durante 1 h, medio batido de 5 seg / min, a 22 º C.

3. Cuantitativa y de alto rendimiento La medición de extracelular H ₂ O ₂ de producción

1. Siga los mismos pasos que se describen en el punto 2.1 y 2.2.
2. Preparar HRP diluido añadiendo 5 l de HRP de valores (100 U / ml en agua destilada) en 10 ml de SS6.4, vórtice o invertir el tubo para mezclar bien y mantener en hielo para su uso posterior. La solución de HRP diluida es a 0,05 U / ml.
3. Preparar la mezcla de reacción AUR mediante la mezcla de la población de AUR (mM AUR 10 en DMSO) y la solución de HRP diluida en tampón de SS6.4 a las concentraciones finales de 6,25 mM, y 0,005 U / ml, respectivamente. Como un ejemplo, para preparar la mezcla de reacción para 40 reacciones, mezclar 1,600 l de SS6.4 con 400 l de HRP diluido y 2,5 l de solución madre de AUR.
4. Añadir 50 l de mezcla AURtura en cada pocillo usando una pipeta multicanal si es necesario. Ahora comienza la reacción.
5. Los estímulos o inhibidores se pueden añadir en este punto, o en otros puntos de tiempo de acuerdo a las necesidades específicas.
6. Utilice el punto de modo extremo "top lectura" de un lector de placas de micro fluorescencia, con la excitación de fluorescencia / emisión a 530 nm/590 nm, leer cada 2 min durante 1 hora, medio batido 5 s / min, a 22 º C.

Resultados

La generación de ROS en los fagosomas se puede visualizar cualitativa y dinámicamente por microscopía (S1 del archivo). La fluorescencia roja emitida por Alexa Fluor 594-es insensible al pH y se mantiene constante en el medio ambiente phagosomal, mientras que la oxidación de OBG aumenta su fluorescencia en el canal verde. Los espectros de emisión de in vitro oxida y perlas recubiertas con OBG no oxidado se comparan en la Figura 1B, que muestra un aumento significativo de l...

Discusión

En comparación con los métodos descritos anteriormente, el ensayo de OBG visualiza dinámicamente el proceso de phagosomal la generación de ROS en el nivel de células individuales, en lugar de medir una señal promedio de ROS de una población de células. Tales métodos población de promediación tienden a oscurecer la información crítica causada por la fagocitosis no sincrónico. Se adaptó con éxito los ensayos DHE y AUR a Dictyostelium y optimizado los protocolos. Lo más importante es que hemos esp...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Horseradish peroxidase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
White 96 well plate	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Microplate reader	BioTek	Synergy Mx