Evaluación previa a la clínica de inhibidores de tirosina cinasa para el tratamiento de la leucemia aguda

Resumen

Los receptores tirosina quinasas se expresan ectópica en muchos tipos de cáncer y han sido identificados como dianas terapéuticas en leucemia aguda. Este manuscrito describe una estrategia eficiente para la evaluación pre-clínica de inhibidores de tirosina quinasa para el tratamiento de la leucemia aguda.

Resumen

Los receptores de tirosina quinasas han sido implicados en el desarrollo y progresión de muchos tipos de cáncer, incluyendo tanto la leucemia y tumores sólidos, y son dianas terapéuticas druggable atractivos. Aquí se describe una estrategia de cuatro pasos eficiente para la evaluación pre-clínica de los inhibidores de tirosina quinasa (TKIs) en el tratamiento de la leucemia aguda. Inicialmente, el análisis de transferencia Western se usa para confirmar la inhibición de destino en células de leucemia cultivadas. La actividad funcional se evaluó después usando ensayos clonogénicos en metilcelulosa o cultivos de agar blando. Compuestos experimentales que demuestran la actividad en ensayos de cultivo de células se evaluaron in vivo utilizando ratones NOD-SCID-gamma (GSN) los ratones trasplantados ortotópicamente con líneas celulares de leucemia humana. In vivo estudios farmacodinámicos iniciales evaluar la inhibición de destino en blastos leucémicos aisladas de la médula ósea. Este enfoque se utiliza para determinar la dosis y pauta de administración requerida para la inhibición eficaz objetivode iones. Estudios posteriores Evaluar la eficacia de la TKIs en vivo utilizando luciferasa que expresan las células de leucemia, permitiendo de este modo para la supervisión bioluminiscente no invasiva de la carga de la leucemia y la evaluación de la respuesta terapéutica in vivo usando un sistema de imágenes de bioluminiscencia en. Esta estrategia ha sido eficaz para la evaluación de TKIs in vitro e in vivo y puede ser aplicado para la identificación de agentes dirigidos molecularmente con potencial terapéutico o para la comparación directa y la priorización de múltiples compuestos.

Introducción

La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es la neoplasia maligna más frecuente en los niños ^1,2. La tasa de supervivencia general de los casos de LLA pediátrica de linaje B (B-ALL) es de aproximadamente 85%, pero los subtipos biológicos específicos, entre ellos T-LLA de linaje (LLA-T), que el pronóstico sigue siendo pobre, incluso con protocolos terapéuticos actuales. El tratamiento posterior de la LLA recidivante sigue siendo un desafío ^3. Aunque la mayoría de los pacientes adultos con leucemia aguda lograr una remisión con quimioterapia por adelantado, muchos pacientes todavía sufren recaídas ^4. Regímenes quimioterapéuticos actuales en el tratamiento de la leucemia aguda son conocidos por causar efectos secundarios a corto y largo plazo de toxicidad asociada. Por lo tanto, las terapias menos tóxicas que atacan específicamente las células cancerosas con un efecto mínimo sobre los tejidos normales son muy necesarios. En los últimos años, se ha puesto énfasis en el desarrollo de la novela, agentes molecularmente orientados con especificidad para las células cancerosas, a menudo utilizando la química iterativapara generar múltiples compuestos activos que luego deben ser comparadas y priorizaron ^5. Este manuscrito describe una estrategia eficiente para la evaluación preclínica de ITC para el tratamiento de la leucemia aguda, que puede ser utilizado para la evaluación de un único compuesto o para la comparación directa de múltiples compuestos con el fin de facilitar el desarrollo de fármacos.

El método presentado aquí consta de cuatro pasos. En primer lugar la bioquímica (1) y anti-leucemia (2) las actividades de los compuesto (s) se evalúan en cultivo celular, a continuación, la inhibición de la diana se confirma en modelos animales (3), y, finalmente, la eficacia terapéutica de la TKI (s) se determina en modelos de xenoinjerto de leucemia ortotópico (4). Para estos estudios, es importante elegir líneas celulares pertinentes, que son representantes de los subtipos biológicos más comunes. Las líneas celulares se deben seleccionar, que tanto, expresan la diana de interés y carecen de la diana de interés, para investigar si los efectos biológicos están medIATED por la inhibición de la diana. Esto es particularmente relevante para el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas, que tienen fuera de objetivo efectos que pueden ser importantes para la actividad anti-tumoral. También es necesario escoger una línea celular que es dependiente de la diana para los efectos funcionales, tales como la proliferación o la supervivencia. Estudios de validación de destino preliminares (fuera del alcance de este artículo) utilizando la interferencia de ARN u otros medios específicos para inhibir el objetivo se pueden utilizar para identificar líneas de células dependiente de la diana. También es deseable elegir líneas celulares que pueden formar xenoinjertos murinos, de tal manera que los resultados del cultivo celular puede ser más directamente traducido a experimentos in vivo.

Para la evaluación de la actividad bioquímica mediada por TKIs en células de leucemia, una disminución en la fosforilación del receptor se puede utilizar como un indicador de inhibición de destino. Ensayos de análisis de transferencia de Western o ELISA se pueden emplear, dependiendo de la disponibilidad y la especificidad de los anticuerpos.Si los anticuerpos con especificidad suficiente para el objetivo están disponibles, ensayos de ELISA son preferibles ya que son más cuantitativa y eficiente. En los casos en que los anticuerpos con especificidad suficiente para ELISA no están disponibles, el análisis de transferencia Western puede ser necesario. En este caso, la inmunoprecipitación de una gran cantidad de lisado puede ser útil para la detección de objetivos que están en baja abundancia. Este enfoque es particularmente relevante para la medición de fosfo-proteínas, que pueden tener una vida media corta para permitir cambios rápidos en la señalización en respuesta a los estímulos ambientales. Algunas proteínas fosforiladas son extremadamente lábil, muy probablemente como resultado de la formación de complejos con fosfatasas. Para la detección robusto y consistente de estas proteínas fosforiladas, también puede ser posible para el tratamiento de las células con pervanadato, un inhibidor de la fosfatasa de la proteína tirosina irreversibles ^6, para estabilizar el fosfato proteína antes de la preparación de lisados ​​de células enteras.

Adeterminar si la actividad bioquímica resulta en efectos anti-tumorales, procesos biológicos dependiente de la diana se pueden monitorizar en experimentos basados ​​en células. Para las líneas celulares de leucemia, actividad anti-leucemia mediada por TKIs se puede evaluar usando ensayos de formación de colonias realizadas en metilcelulosa o agar blando ^7. Agar blando puede ser preferible, ya que es un medio sólido que es más susceptible a la manipulación, si es necesario un tratamiento repetido con un TKI. Mientras que muchas líneas celulares de leucemia aguda myloid (LMA) formarán colonias en agar blando, la mayoría de todas las líneas celulares solo se forman colonias en metilcelulosa, que es un medio semi-sólido. Aunque es posible para refrescar medio y / o TKIs en cultivos de metilcelulosa, sólo pequeños volúmenes se pueden utilizar y con frecuencia limitada. Del mismo modo, es más difícil para teñir colonias sin interrumpir en metilcelulosa. Los estudios preliminares deben definir la capacidad de líneas de células apropiadas para formar colonias en metilcelulosa y / o agar blando y Tque la densidad óptima de células en cultivo tales que las colonias no se solapan y en número suficiente para obtener datos estadísticamente relevantes (normalmente 50-200 colonias por placa de 35 mm).

Mientras que los ensayos in vitro son robustos y rentables, y tienen menos consecuencias éticas que los experimentos con animales enteros, el avance de los compuestos terapéuticos requiere prueba de eficacia y seguridad en modelos animales. Para los estudios in vivo, las líneas celulares de leucemia aguda humanos pueden ser trasplantadas en ortotópicamente NOD.Cg-Prkdc ^SCID I l2rg ^tm1Wjl / SZJ (GSN) ratones y TKIs se pueden administrar fácilmente por inyección o una sonda nasogástrica. Algunas líneas celulares pueden requerir la exposición de ratones sin garantía soberana a una dosis baja de línea celular dependiente de la radiación con el fin de xenoinjertos de establecer, y en este caso los ratones no pueden tolerar la alimentación oral forzada sin un período de recuperación de 5 a 10 días después de la irradiación. Este manuscrito describe la generación de B-ALL y T-ALL xenoinjertos utilizandolíneas celulares específicos (697 y Jurkat) como ejemplos, pero pueden establecerse xenoinjertos en ratones GSN utilizando una amplia variedad de líneas celulares. En el caso de que otras líneas celulares son más aplicables, el requisito para la irradiación, el número óptimo de células a trasplante, y el momento de aparición de la enfermedad y la progresión se debe determinar experimentalmente. Idealmente, estos modelos tendrán penetrancia completa (cada animal trasplantado desarrolla la leucemia), la cinética consistentes (leucemia progresa de manera similar en todos los animales), y una ventana de tratamiento razonable (idealmente 20-30 días entre el inicio del tratamiento y la eliminación del estudio debido a la enfermedad) . El número de células trasplantadas se puede aumentar para mejorar la penetración y la consistencia cinética o disminuye para mejorar la ventana de tratamiento si es necesario.

Para determinar si TKIs median la inhibición diana in vivo, las muestras se obtuvieron de ratones con xenoinjertos de leucemia después del tratamiento con ITC o sólo vehículo. Idealmente, la una dosisd programa de administración para estos experimentos se guían por los estudios farmacocinéticos, que a menudo pueden ser realizados por laboratorios comerciales y están fuera del alcance de este artículo. Si se dispone de datos farmacocinéticos, la concentración de compuesto requerida para la inhibición eficaz objetivo en cultivo de células y la concentración máxima en suero después de una única dosis de TKI se puede utilizar para definir una dosis de partida para los estudios en animales. Los estudios farmacocinéticos también pueden informar al momento de la recolección de la muestra después del tratamiento para los estudios farmacodinámicos y la vía de administración. La inhibición de la diana puede evaluarse en cualquier órgano afectado, pero los tejidos que se recolectan y procesan con mayor facilidad son preferibles. Líneas celulares de leucemia más agudos establecen en el hígado, médula ósea, bazo, sangre periférica, y el sistema nervioso central, aunque los órganos específicos afectados y el grado de injerto en estos órganos varía entre modelos. El protocolo presentado aquí evalúa fosfinhibición o-proteína en la médula ósea utilizando análisis de transferencia de Western, pero órganos sólidos pueden ser más fáciles de cosechar constantemente y requieren un procesamiento mínimo o nada de antes de la congelación, lo que permite menos oportunidad para la degradación de fosfo-proteínas durante la recogida y procesamiento de la muestra. La inmunohistoquímica también se puede utilizar para evaluar tumores sólidos o órganos afectados por la leucemia.

Finalmente, la eficacia terapéutica de la TKI (s) se determina en modelos de xenoinjerto de leucemia ortotópico. Para estos estudios, el momento de inicio del tratamiento puede variar, de modo que la enfermedad está más o menos establecido. El tratamiento puede comenzar inmediatamente después del trasplante para los estudios iniciales y luego se retrasó en estudios posteriores hasta que se detecta la carga de morbilidad significativa para aproximarse más a un modelo de tratamiento de diagnóstico. Idealmente, estos modelos animales también tienen la capacidad para la medición no invasiva de la carga de morbilidad. Hemos optimizado los métodos de introducción de la lucifer luciérnagaASE gen en líneas celulares de leucemia utilizando partículas similares a virus, lo que permite el análisis no invasivo, longitudinal de inicio de la enfermedad y la progresión y la evaluación de la carga de la enfermedad en la médula ósea y los órganos sólidos. Fundamental para este enfoque es el uso de líneas celulares de luciferasa-etiquetados monoclonales para evitar la variabilidad en el desarrollo de la leucemia que expresan luciferasa asociado con el uso de líneas celulares policlonales y no está relacionado con el tratamiento con un TKI ^8.

Tomados en conjunto, estos pasos se pueden utilizar para la evaluación de una sola TKI o para la comparación directa y la clasificación de múltiples TKIs. Mientras que los protocolos presentados aquí se centran en el desarrollo de TKIs, estos métodos se pueden adaptar a otros objetivos y consideraciones para el desarrollo del ensayo se describen. Por lo tanto, esta estrategia puede ser más ampliamente aplicable a la evaluación pre-clínica de agentes dirigidos molecularmente para el tratamiento de la leucemia aguda.

Protocolo

Todos los experimentos con animales siguen las normas reglamentarias aprobadas por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Colorado. El protocolo fue aprobado demostrado por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Colorado.

1. Fosfato proteína Western Blot

1. Preparación de lisados
   1. Líneas celulares que expresan la cultura de la tirosina quinasa del receptor de interés. Las células de la cosecha y la placa de 3-5 x 10 ⁶ células / muestra en el medio de cultivo de 400 l en un 48 pocillos placa de cultivo de tejidos. Incubar a 37 ° C en 5% de CO ₂ durante 2-3 h.
   2. Añadir 100 l de solución de 5x TKI en medio de cultivo y se incuba durante 60 min.
   3. Preparar tampón de lisis con 50 mM de HEPES (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, 10% (v / v) de glicerol, 1% (v / v) de Triton X-100, y los inhibidores de la proteasa. Si los cultivos no serán tratados con pervanadato antes de la cosecha, añadir inhibidores de la fosfatasa (orthova de sodio 1 mMnadate y 0,1 mM de molibdato de sodio) al tampón de lisis.
   4. Preparar pervanadato (PV) solución de inhibidor de la fosfatasa inmediatamente antes de su uso. Prepare una solución de 0,3% de peróxido de hidrógeno (PRECAUCIÓN) en frío-buffer fosfato salino (PBS) en un tubo oscuro en el hielo (1:100 dilución de una solución madre al 30%). Hervir una alícuota de 0,2 M ortovanadato de sodio (OV, PRECAUCIÓN) solución madre durante 5 min. Diluir 1:10 en PBS para hacer una solución 20 mM de VO a temperatura ambiente (RT). Mezcle de peróxido de hidrógeno 0,3% y 20 mM de VO 1:01 y se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min.
   5. Diluir PV en medio completo (60 l PV + 940 l medio). Añadir 100 l de diluirse PV / pocillo. Se incuba a 37 ° C en 5% de CO ₂ durante 3 minutos y luego coloque la placa sobre hielo.
   6. Recoger las células en tubos de microcentrífuga fríos a 2.500 rpm durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 120 l de tampón de lisis. Incubar en hielo durante 15 min. Aclarar el lisado en una microfuga en frío a 6000 rpm durante 3 min. Traslado supernatant a un tubo frío fresco. Almacenar a -80 ° C.
2. La inmunoprecipitación
   1. Decantar proteína G Sepharose bolas en microcentrífuga a 1000 rpm durante 1 min. Aspirar el sobrenadante y lavar los granos 2X con 1 ml de PBS frío. Añadir un volumen igual de PBS para hacer una suspensión al 50%. Añadir anticuerpo primario y 20 l 50% de proteína G bolas a cada muestra. Incubar durante 2 horas - O / N a 4 ° C en un rotador.
   2. Pulso por bolas en una microcentrífuga frío a 9.000 rpm. Aspirar el sobrenadante y lavar los granos 2X con 150 l de tampón de lisis frío. Gira en microfuga en frío a 1000 rpm durante 1 min. Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en 20 l de 2X SDS Sample Buffer con 2-mercaptoetanol (PRECAUCIÓN). Utilizar inmediatamente o almacenar a -80 ° C.
   3. Muestras Hervir durante 5 minutos y se ejecutan en un gel-tris glicina SDS-PAGE. Transferencia de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa y detectar fosfato proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western.
   4. Enjuague blot con agua y luego incubar en 2% de SDS, 62,5 mM de Tris (pH 6,8), 0.1 M β-mercaptoetanol (PRECAUCIÓN) durante 30 min a 50 ° C. Enjuague 2x con agua y lavar para 60-90 min en 5-6 cambios de TBS-T para eliminar la solución decapante.
   5. Detectar total de proteínas por Western blot.

2. Ensayo Methylcellulose

1. Alícuota de 4 ml de metilcelulosa medio de base humana en 50 ml tubos cónicos con un gran calibre aguja estéril extremo romo. (Nota:. Metilcelulosa puede ser en alícuotas y se almacenó a -20 º C. Descongelar a temperatura ambiente O / N antes de su uso)
2. Añadir 500 l de 10x de TKI o vehículo en el medio de crecimiento a 4 ml de metilcelulosa y la mezcla de vórtice durante 10 segundos.
3. Cosecha y celdas de conteo. Preparar una suspensión de células en medio de crecimiento en una concentración, que es 10 veces mayor que la concentración final de células. Añadir suspensión de células 500 l a la mezcla de metilcelulosa. Vortex durante 10 segundos y dejar reposar durante 10 minutos para eliminar las burbujas.
4. Elaborar 4 ml de mezcla de metilcelulosa con una jeringa de 5 ml y larg estérile parió aguja punta roma. Evite la elaboración de burbujas. Dispensar 1 ml de la mezcla de metilcelulosa en el centro de tres 35 mm placas de cultivo de tejidos. Agitar los platos hasta que el fondo está completamente cubierto con metilcelulosa.
5. Para cada placa de metilcelulosa, preparar una placa de cultivo de tejido estéril de 10 cm con dos de 35 mm de tejido placas adicionales cultura llena de agua estéril para asegurar un ambiente húmedo. Culturas Coloque en agua con camisa incubadora a 37 ° C en 5% de _CO2 durante 10 a 14 días.
6. Recuento de las colonias después de 1-2 semanas. Las colonias deben ser más de 20 células y no se superponen. Las colonias pueden ser contadas usando un microscopio invertido equipado con una platina de microscopio con una rejilla o utilizando un contador automático de colonias. Los cambios en el tamaño de la colonia o la morfología en respuesta al tratamiento con ITC también deben ser evaluados. Para mejorar la detección por el contador de colonias, las colonias de manchas mediante la adición de 60-100 l de (3 - (4,5-Dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro de Sollución (MTT, 5 mg / ml en _H2O, se almacena a -20 ° C, proteger de la luz, PRECAUCIÓN) gota a gota sobre la superficie de cada placa e incubar durante 8 horas a 37 ° C en 5% de CO _2.

3. Ensayo en agar blando

1. Preparar 1% de agar noble para la capa inferior, el 0,7% de agar noble de la capa superior y medio de crecimiento de 2x. Equilibre medio de crecimiento de 2x en un 42 ° C baño de agua. Calor 1% y 0,7% de agar noble en un horno de microondas (aproximadamente 1 min/100 ml) y equilibrar en un baño de agua de 42 ° C. Mezcle partes iguales de un 1% de agar y medio 2x y por separado 0,7% de agar y medio 2x en 50 ml cónicas. Plan de 10 ml de la mezcla de la placa de agar blando / seis pocillos para cada capa.
2. Etiqueta de 6 placas de cultivo de tejidos. Llene cada pocillo con 1,5 ml de 1% de mezcla de agar blando. Evite burbujas durante la siembra. Placas secas con tapas fuera de campana estéril durante 30 minutos.
3. Contar las células. Preparar una suspensión de células en medio de crecimiento en una concentración, que es 500x más alto que el concentrati final de célulasen. Añadir suspensión de células a 0,7% mezcla de agar, mezclar bien y dispensar 1,5 ml de la mezcla de células de agar en la parte superior de la capa de agar 1%. Deje que la capa superior se solidifique durante 30 min.
4. Preparar el medio de cultivo que contiene 1x TKI o control del vehículo. Añadir 2 ml de medio con la concentración deseada de TKI en la parte superior de la capa de agar superior.
5. Incubar los cultivos durante 10 días a 37 ° C en 5% de CO _2. Retire y sustituya el medio superponiendo cada 3 días.
6. Cuando las colonias son visibles a simple vista, medio aspirado de superposición y añadir 200 l de solución de azul nitro-tetrazolio (1 mg / ml de NBT en H ₂ O, se almacenan a 4 ° C, proteger de la luz, PRECAUCIÓN). Volver a la incubadora durante 24-48 horas. Mover a 4 ° C durante al menos 2 horas antes del recuento. Placas teñidas pueden almacenarse a 4 ° C durante un mes. Recuento de las colonias utilizando un microscopio o un contador de colonias automático.

4. Evaluación de la inhibición fosfato proteína in vivo

1. Recoger cells crecimiento en fase logarítmica por centrifugación en una centrífuga de mesa a 1.500 rpm durante 5 min. Lavar las células una vez con PBS estéril y resuspender en PBS a una concentración apropiada (típicamente 1-5 x 10 ⁷ células / ml). Trasplante de células en un volumen de 100 l en 6-12 semanas de edad ratones GSN por inyección intravenosa en la vena de la cola usando una jeringa de insulina 28 g. Colocar el animal en una inmovilización, calentar la cola en un vaso de agua tibia para dilatar las venas, y limpie la cola con un hisopo de clorhexidina antes de la inyección. Después de la inyección, aplique presión en el sitio de la inyección con una gasa estéril hasta que el sangrado se detenga. Trasplante de al menos 3 animales / grupo. Mantener los ratones en agua que contiene 1 mg / ml de sulfato de gentamicina.
2. Catorce días después del trasplante, el tratamiento de los animales con TKI o sólo vehículo y muestras de la cosecha para el análisis de la inhibición de destino. Pesar animales y tratar con una dosis adecuada (mg / kg de peso corporal) de ITC o vehículo. Administrar el tratamiento en un volumen de 5 ml / kg de peso corporal por vía intraperitoneal (ip) inyección o 10 ml / kg de peso corporal por sonda oral. Para la inyección ip, restringir el ratón de forma manual y se inyecta en el cuadrante inferior derecho del abdomen mediante una aguja de 29. Para una sonda nasogástrica, restringir el ratón manualmente y mantener al animal en posición vertical. Colocar el tubo de sonda en la boca sobre la lengua y en la parte posterior de la boca. Aplique ligera presión para pasar el tubo a través del esófago hasta el estómago. Presione el émbolo de la jeringa para administrar el tratamiento. Si el émbolo no deprime fácilmente la aguja de sonda debe ser retirado y colocado de nuevo. Preparar formulaciones TKI inmediatamente antes de su uso.
3. Si se desea el tratamiento con pervanadato, preparar la solución PV 20 min antes de la cosecha como se describió anteriormente (etapa 1.1.4) y se diluye en medio con 1 mM de MgCl ² y 100 U / ml de DNasa (120 l PV + 880 l de medio). Nota: PV es estable durante al menos 1 hora después de la dilución.
4. Sacrificio de animales por el CO ₂ narcosis en la aptiempo (s) apropiada post-tratamiento. Diseccionar fémures quitando pieles, piel y músculo de la pierna entera para que los huesos están completamente expuestos. Retire los fémures por el recorte con tijeras de disección justo debajo de la articulación de la cadera y de nuevo por encima de la articulación de la rodilla. Transferencia a una placa de Petri y la médula ósea a ras con 1 ml de PBS frío o solución PV diluido mediante una jeringa y una aguja 27. Si el tratamiento con PV, se incuban a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min.
5. Preparar lisados ​​y analizar los niveles de fosfo-proteínas y total de proteínas como se indica anteriormente (pasos 1.1.6-1.2.5).
6. Cuantificar relativa fosfato proteína y los niveles totales de proteínas de cada muestra utilizando densitometría. Calcular relativa phospho-protein/total-protein al valor medio phospho-protein/total-protein para los animales tratados con el vehículo.

5. Evaluación de la actividad anti-leucemia de ITC en todos los modelos de xenoinjertos

1. Si es necesario, exponer ratones a 200 cGy de radiación en un irradiador RS-2000 un día PRIOr para trasplante. Los ratones trasplantados con líneas celulares de leucemia, como se describe anteriormente (paso 4.1). Trasplante de al menos 6 ratones por grupo. Identificar ratones mediante punch oreja. Alternativamente, un marcador negro se puede utilizar para identificar los ratones con marcas de control en sus colas. Agregar a enriquecimiento jaulas para reducir el potencial de agresión compañero de jaula durante el estudio.
2. Tratar a los ratones con un TKI o el vehículo sólo se ha descrito anteriormente (paso 4.2). Supervisar el estado de salud de los ratones diariamente a través de la exploración física y la determinación del peso. Síntomas esperados de la leucemia (reducido nivel de actividad, pérdida de peso, parálisis de las extremidades posteriores, y las infecciones de los ojos). La pérdida de peso superior al 10% y un 15% por lo general se asocia con la muerte del ratón dentro de dos días, y suele ser un criterio indirecto de la muerte, de acuerdo con los requisitos estándar IACUC.
3. Monitorear el injerto y el desarrollo de la leucemia a través de un sistema in vivo imágenes de bioluminiscencia en hasta 2 veces por semana. Preparar una solución madre 200X-D luciferina (30 mg / ml) en Steriagua le. Mezclar suavemente por inversión hasta D-luciferina se haya disuelto completamente. Utilizar inmediatamente o alícuota y congelar a -20 ° C. Antes de la formación de imágenes in vivo usando un sistema de imágenes de bioluminiscencia en, descongelar las partes alícuotas de D-luciferina a TA y se diluye 1:02 en PBS a una concentración final de 15 mg / ml y esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,2 micras.
4. Se anestesia a los ratones antes de formación de imágenes con 1,5% de isoflurano inhalado en oxígeno. Monitorear la anestesia suficiente, que se caracteriza por la relajación muscular, pérdida de movimiento y pérdida de la respuesta a la estimulación del dedo del pie-pinch.
5. Inmediatamente antes de formación de imágenes, administrar 150 mg / kg de peso corporal de D-luciferina mediante inyección IP (10 l de 15 mg / ml de luciferina / g de peso corporal).
6. Utilice un sistema de imágenes de bioluminiscencia in vivo para capturar 2 serie de imágenes secuenciales con 30, 60 y 90 exposiciones sec y una imagen final con una exposición de 120 seg. Después de las imágenes, vuelva ratones para jaulas y supervisar la recuperación de la anestesia. Dependiendo de laintensidad de bioluminiscencia, tiempos de exposición pueden ser variadas. Tiempos de exposición óptima, deben ser predeterminados para un determinado modelo y de mantener la coherencia de tal manera que las intensidades de señal para los puntos de tiempo individuales son comparables a través de todo el estudio.
7. Determinar la intensidad de la bioluminiscencia para cada ratón utilizando viva imagen 3.2 de adquisición y análisis de software. Determinar valores de flujo total medido en fotones / segundo por regiones de interés (ROI) de tamaño idéntico sobre cada ratón dibujo.
8. Sacrificio ratones por exposición de CO ₂ y dislocación cervical si moribundo, exhibiendo la parálisis, en el caso de la pérdida de peso mayor que 15%, o al final del estudio. Diseccionar ratones y anote observaciones (por ejemplo, la ampliación del bazo, el hígado o los ganglios linfáticos, palidez de la médula ósea). Diseccionar fémures y la médula ósea a nivel con PBS frío utilizando una aguja de 27.
9. Recoger las células en una microcentrífuga a 2500 rpm durante 5 min. Resuspender las células en PBS que contenía 2% de FBS y se incuba durante 5 min a TA.Recoger las células y tinción con 20 mg / ml de DAPI (diclorhidrato de 4,6-diamidino-2-fenilindol, 1:1.000) y FITC-conjugado α-hCD45 (1:100) o IgG de ratón anticuerpo de control de isotipo ₁ (1:100) . Evaluar el injerto leucemia mediante citometría de flujo. Puerta en la población viable (DAPI negativo) y determinar el porcentaje de células CD45 + (blastos% de médula ósea).

Resultados

Los ensayos presentados aquí evaluar los efectos bioquímicos y funcionales mediados por TKIs y se pueden utilizar para clasificar nuevos compuestos basados ​​en el grado de inhibición de la diana in vitro e in vivo, la reducción de la formación de colonias, y el retraso en la leucemia en ratones trasplantados con GSN luciferasa- etiquetados células de leucemia.

Se utilizó análisis por inmunotransferencia para determinar la inhibición de la forma fosforilada act...

Discusión

Este manuscrito describe una estrategia eficaz para la evaluación de inhibidores de tirosina quinasa nuevos en el tratamiento de la leucemia aguda. Usando este enfoque, las actividades bioquímicas y anti-leucemia se evalúan primero en ensayos basados ​​en células in vitro y luego en modelos de xenoinjerto in vivo. El análisis por inmunotransferencia se utilizó con éxito para demostrar la inhibición de la tirosina quinasa diana en células de leucemia después del tratamiento con TKIs y para...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Hydrogen Peroxide	MP Biomedicals	#02194057	GHS05, GHS07, H302-H318
Sodium Orthovanadate	Sigma	#S6508	GHS07, H302+ H312+H332
2-Mercaptoethanol	Sigma	#M7522	GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410
ColonyGel Human Base Medium	ReachBio	#1101
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)	Sigma	#M5655	GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341
Difco Noble Agar	BD Biosciences	#214883
Nitrotetrazolium Blue Chloride	Sigma	#N6639	GHS07, H302
D-Luciferin Firefly, Potassium Salt	PerkinElmer	#122796
4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride	Sigma	#D9542
FITC CD45	BD Bioscience	#347463
FITC Mouse IgG1 Isotype control	BD Bioscience	#51-35404X-2
Gentamycin Sulfate	Sparhawk	#NDC58005-633-04
Protease Inhibitors	Roche	#11836153001
DNase	Sigma	#D4263
Protein G Beads	Invitrogen	#10-1242
Isofluran	VETONE	#NDC13985-030-60
			Equipment
Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm	Nunclon	#D7804-500EA
Cell culture dishes, diam. 100 mm x  H 20 mm	Nunclon	#D8429-1CS
6-well plates	BD Bioscience	#353046
14 gauge x 4 inch blunt-end needles	Cadence science	#7956
5 ml syringe with luer-lok	BD Bioscience	#309646
GelCount automated colony counter	Oxford Optronix
In vivo bioluminescence imaging system	PerkinElmer	#IVIS200
Scout pro portable balances, scale	Ohaus	#SP202
Broome style rodent restrainer	Plas-labs	#551-BSRR
Ear punch, punch diameter: 2 mm	FST	#24210-02
Chlorhexidine swabs, Prevantics	PDI	#B10800
Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2	Monoject	#8881500042
Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile	Instech	#FTP-20-38
1 mL Luer-Lok disposable syringe	BD Bioscience	#309628
Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle	BD Bioscience	#329465
Extra fine bonn scissors	FST	#14084-08
Student fine scissors	FST	#91460-11
Moria ultra fine forceps	FST	#11370-40
Extra fine graefe forceps	FST	#11150-10
Scalpel handle	FST	#10003-12
Scalpel blades	FST	#10011-00