MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina

Resumen

En este artículo se describe un protocolo de hibridación in situ optimizado para la detección colorimétrica de expresión de microARN en secciones de riñón fijas con formalina.

Resumen

En este artículo se describe un método para la detección colorimétrica de miRNA en el riñón a través de la hibridación in situ con digoxigenina etiquetados sondas de microARN. Este protocolo, desarrollado originalmente por Kloosterman y colegas por un amplio uso con sondas Exiqon miARN ^1, se ha modificado para superar los desafíos inherentes en el análisis de miRNA en los tejidos renales. Estos incluyen temas como la identificación de la estructura y la fuerza para eliminar la sonda residual y anticuerpos. El uso de relativamente delgada, de 5 mm de espesor, las secciones de tejido se admiten para la visualización clara de las estructuras del riñón, mientras que una señal de la sonda fuerte fue retenido en las células. Además, se han optimizado las condiciones de concentración de la sonda y de incubación para facilitar la visualización de expresión de microARN con bajo fondo y la señal no específica. Aquí, el protocolo optimizado se describe, que cubre la recogida inicial del tejido y la preparación a través del montaje de diapositivas al final del procedimiento. El Compon básicaNTS de este protocolo pueden ser alterados para su aplicación a otros tejidos y modelos de cultivo celular.

Introducción

MicroARN son pequeños (aproximadamente 22 nucleótidos de largo) RNAs no codificantes que se producen de manera endógena. Por lo general, funcionan para suprimir la expresión de la proteína a través de la represión de traducción o degradación de ARNm. miRNAs se unen a los objetivos de mRNA con complementariedad incompleta, por lo que es posible que un solo miARN para suprimir múltiples objetivos.

Entender cuáles son los tipos y estructuras celulares expresan miRNAs es una parte importante de la comprensión de los mecanismos por los que las alteraciones en la expresión de miRNA influencia celular y fenotipos de tejidos. Mientras que los métodos como la secuenciación de los genes miARN, qPCR y transferencia de Northern se pueden utilizar para la detección de miRNAs en tejidos enteros, este enfoque no permite determinar qué tipo de célula específica que llegaron desde el interior de un determinado tejido. La disección de los componentes celulares y estructurales antes del análisis utilizando estos métodos puede ser muy difícil y las condiciones necesarias para lograr aislamientos adecuados puede conducir a alterations en la expresión o la degradación de los ARN de genes. microARN hibridación in situ es un método utilizado para visualizar la ubicación de microARN y los niveles de expresión en los tejidos. Esta técnica es especialmente valiosa en los tejidos compuestos de estructuras heterogéneas, tales como el riñón.

Los microARNs se ha demostrado que desempeñan un papel regulador en ^2,3 el desarrollo del riñón y de la fisiología ^4. alteraciones de expresión de microARN también se han demostrado estar involucrados con la patología renal, como la fibrosis ^5-10, nefropatía diabética ^7, carcinoma renal ^11,12, y la lesión renal aguda ^13. En nuestra investigación, hemos encontrado que la optimización de micro ARN hibridación in situ para los tejidos del riñón era valiosa para determinar las ubicaciones estructurales exactas de los genes miARN expresión tanto en la salud y la enfermedad ^14. Determinación de la expresión tubular y celular de diferentes microRNAs es importante porque su regulación de TArgets pueden depender de las funciones celulares. En estados de enfermedad también es importante para determinar cómo las alteraciones en la expresión de los genes miARN pueden ser función impactando.

El objetivo del método descrito aquí era construir en las metodologías existentes ISH desarrollados por Kloosterman et al. ^15, otros investigadores ^16,17, y los sugeridos por Exiqon ¹ y optimizar el método para tejidos renales fijos formalina. Hemos utilizado con éxito este método para identificar las diferencias regionales en distintas renal expresión de microARN miR-382 con obstrucción ureteral unilateral ^18. Este enfoque se puede utilizar con otros tejidos, así, con la optimización adicional.

Protocolo

1. Secciones de tejido de riñón

1. Fijado en formol (10%) secciones de riñón incluidas en parafina se cortan en portaobjetos de microscopio con un espesor de 5 mm usando una Microm HM 355 S. Los portaobjetos se pueden almacenar durante varios meses antes del análisis.

2. Preparación de la Solución

1. Preparar 1 l de 1x PBS en _ddH2O en un frasco con tapa de rosca autoclavable. Llene otra botella con 1 l de ddH ₂ O. Añadir 1 ml de DEPC a cada botella, tapar y agitar enérgicamente. Deje que las soluciones de reposar toda la noche a temperatura ambiente para destruir RNAsas y luego en autoclave. Añadir 400 ml de Tween-20 a 1 l de PBS 1x para hacer PBS-T.
2. Preparar tampón de proteinasa K (50 mMTris-HCl, pH 8,0 y 1 mM de _CaCl2 en agua tratada con DEPC).
3. Preparar una solución de 0,2% de glicina en PBS-T.

3. Preparación de Tejido

1. Preparar un gran volumen de tampón de hibridación (50-100 ml) compuesta de 50% de formamida, 5x SSC, 0,1% de Tween, 9,2mM de ácido cítrico para el ajuste a pH 6, 50 mg / ml de heparina, y 500 mg / ml de ARN de levadura en DEPC tratado ddH ₂ O. Divida en alícuotas de 1 ml y se almacena a -80 º C.
2. Retire la parafina del tejido lavando 3 veces en xileno fresco durante 5 minutos cada uno.
3. Rehidratan las secciones de tejido por 5 min incubaciones en concentraciones decrecientes de etanol (100%, 75%, 50%, y 25%) en ddH ₂ O.
4. Tratar las diapositivas con DEPC suficiente para cubrir completamente las secciones de tejido (aproximadamente 0,4-0,5 ml) durante 1 min. Hacer que los tejidos seguro no se sequen.
5. Enjuagar los portaobjetos en DEPC tratados PBS-T dos veces por 5 min, recogiendo el DEPC contiene residuos para su eliminación adecuada. Todos los reactivos deben ser DEPC tratados para eliminar RNAsas partir de este momento.
6. Precalentar la proteinasa K tampón y agregar proteinasa K a una concentración final de 10 mg / ml. Cubrir las secciones de tejido con solución de proteinasa K y se incuba a 37 º C durante 5 min.
7. Quite rápidamente las proteinassolución de e K y añadir 0,2% de glicina en PBS-T durante 30 segundos.
8. Enjuague las diapositivas en DEPC tratados PBS-T dos veces durante 30 segundos cada uno.
9. Fijar secciones recién hecho paraformaldehído al 4% durante 10 min.

4. Hibridación

1. Añadir 50 l de tampón de hibridación (50% formamida, 5x SSC, 0,1% de Tween, ácido cítrico 9,2 mM para el ajuste a pH 6, 50 mg / ml de heparina, 500 g / ml de ARN de levadura) por sección de tejido y cubrir con RNasa HybriSlips libres cortar justo más grande que las secciones de tejido.
2. Secciones Prehybridize en horno de hibridación de humedad controlada durante 2 horas a temperatura de hibridación determinado para el 3 'de la sonda marcada con digoxigenina (generalmente ADN Tm de la sonda -21 ° C, (es decir, 54 ° C durante miR-382, sonda de ADN Tm = 75 º C ), utilizando toallitas de laboratorio de tejido empapado en 50% formamide/50% SSC 5x para mantener la cámara de humidificado.
3. Diluir la sonda miRNA, control positivo (U6, ARN pequeño nuclear) y control negativo (revueltossecuencia) a 40 nM en tampón de hibridación (75 l de tampón se necesita por sección).
4. Calentar la sonda en tampón de hibridación a 65 º C durante 5 min.
5. Retirar los portaobjetos de horno de hibridación y retirar los cubreobjetos y exceso de tampón de hibridación de prehibridación.
6. Añadir 75 l de sonda que contiene tampón por sección de tejido, directamente al tejido. Cubra el tejido con HybriSlips lo suficientemente grandes para cubrir las secciones de tejido.
7. Mantener el nivel soporte de diapositivas, vuelva al horno de hibridación para la incubación durante la noche a temperatura desde el paso 4.2 (aproximadamente 16 horas).

5. Rigurosidad de lavado

1. Añadir 200 l 2x SSC, se calienta a la temperatura de hibridación, justo por debajo de uno de los bordes de los cubreobjetos para ayudar a liberar el cubreobjetos del tejido. Quite el cubreobjetos por la inclinación de la diapositiva.
2. Lavar los portaobjetos en 200 l de formamida al 50%, 50% SSC 2x a 3x de temperatura de hibridación durante 30 min cada uno.
3. Enjuaguelas diapositivas 5x en PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min cada uno en un agitador orbital a baja velocidad.

6. Detección

1. Incubar diapositiva en tampón de bloqueo (2% de suero de caballo o cabra, 2 mg / ml de BSA en PBS-T) durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital a baja velocidad.
2. Diluir fragmentos anti-DIG-AP Fab en tampón de bloqueo a 1:100. Añadir 100 l por sección de tejido y cubrir con HybriSlips corte lo suficientemente grande como para cubrir la sección.
3. Incubar anticuerpo en una cámara humidificada a 4 ° C durante la noche (aproximadamente 16 horas).
4. Se lavan los portas en PBS-T 7x, durante 5 min cada uno en agitación a baja velocidad.
5. Lavar los portaobjetos en tampón de AP (100 mM Tris HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl _2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) 3x, durante 5 min cada uno.
6. Añadir la solución de NBT / BCIP de tampón AP (200 μl/10 ml de tampón)
7. Añadir 400-500 ml de solución de NBT / BCIP diluida a cada diapositiva para cubrir completamente todas las secciones de tejido. Desarrollar en un lugar oscuro, nivel, Humidifcámara de IED durante 4-5 horas.

7. Diapositivas de montaje

1. Deshidratar secciones en concentraciones crecientes de etanol (25%, 50%, 75%, 100%) durante 5 min cada uno.
2. Incubar en 5x de xileno con el fin de borrar secciones.
3. Monte desliza en medio de montaje Permount y secar toda la noche.

Resultados

Las zonas de una sección de tejido que se convierten secó a cabo durante las hibridaciones, las incubaciones o etapas de lavado, generalmente, terminan tinción más oscura durante el desarrollo de NBT / BCIP. Figura 1 muestra una parte de una sección del riñón en la que el HybriSlip deslizó fuera del borde de el tejido, permitiendo que se convierta parcialmente deshidratado. A pesar de la rehidratación y la cobertura en los pasos restantes, la señal en la porción deshidratada es artificialment...

Discusión

El objetivo de este artículo es describir un protocolo de miRNA de hibridación in situ que funciona bien en los tejidos renales fijas con formalina. Si bien la elaboración de este protocolo se han identificado varias fuentes importantes de artefactos de tinción. Una cuidadosa atención a estos puntos puede ayudar a evitar artefactos de tinción y aumentar la probabilidad de una exitosa carrera ISH.

Una de las causas más evitables de artefactos de tinción puede ocurrir cuando l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
PBS	Gibco	70011044
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	D5758
Tween-20	Sigma	P1379
Xylenes	Sigma	534056
Ethanol	Ultra Pure	200CSPTP
Tris-HCl	Life Technologies	15506-017
CaCl2	Sigma	C2536
Glycine	J.T. Baker	4059-00
Citric Acid	Sigma	C2404
Formamide	Sigma	F9037
20x SSC Buffer	Life Technologies	15557-044
Heparin	SAGENT	25021-400-30
Yeast RNA	Life Technologies	AM7118
MgCl2	Sigma	M8266-1004
NaCl	J.T. Baker	4058-01
Proteinase K	Fermentas	EO0491
3’ DIG- miRNA probe	Exiqon	miR dependent-05
3’ DIG- Scrambled miR probe	Exiqon	99004-05
3’ DIG- U6 miR probe	Exiqon	99002-05
Anti-Digoxigenin-Ab Fab	Roche	11093274910
NBT/BCIP	Roche	11681451001
Permount	Fisher	SP15-500
Coverslips	Fisher	Fit to tissue size
Microtom HM 355 S	Thermo Scientific	23-900-672
In-slide Out Hybridization Oven	Boekel	241000
Aluminum Tray Assembly	Boekel	C2403973
Stainless Steel Rack Insert	Boekel	C2403754