El accionamiento a distancia magnética del micrométrica Sondas para<em&gt; In situ</em&gt; Mapping 3D bacterianas Biofilm Propiedades Físicas

Resumen

Este trabajo muestra una metodología original basada en el accionamiento a distancia de las partículas magnéticas sembradas en una biopelícula bacteriana y el desarrollo de las pinzas magnéticas específicas para medir in situ las propiedades mecánicas locales de la materia viva complejo construido por los microorganismos en las interfases.

Resumen

La adhesión bacteriana y el crecimiento en las interfaces conducen a la formación de estructuras tridimensionales heterogéneos llamados biopelículas. Las células que habitan en estas estructuras se mantienen juntas por interacciones físicas mediadas por una red de sustancias poliméricas extracelulares. Los biofilms bacterianos impactan muchas actividades humanas y la comprensión de sus propiedades es fundamental para un mejor control de su desarrollo - el mantenimiento o la erradicación - en función de su resultado adverso o beneficioso. En este trabajo se describe una nueva metodología con el objetivo de medir in situ las propiedades físicas locales de la biopelícula que había sido, hasta ahora, el examen sólo desde una perspectiva de material macroscópico y homogénea. El experimento descrito aquí implica la introducción de partículas magnéticas en un biofilm creciente a las semillas sondas locales que pueden ser accionados de forma remota sin molestar a las propiedades estructurales de la biopelícula. Pinzas magnéticas fueron dedicados devellado para ejercer una fuerza definida sobre cada partícula incrustado en la biopelícula. La instalación se monta en el escenario de un microscopio para permitir la grabación de imágenes con lapso de tiempo del período de partículas de arrastre. Las trayectorias de las partículas se extraen entonces de la secuencia de tracción y los parámetros viscoelásticos locales se derivan de cada curva de desplazamiento de partículas, proporcionando de este modo la distribución-3D espacial de los parámetros. Obtener conocimientos sobre el perfil mecánico biofilm es esencial desde el punto de vista de un ingeniero para el control de la biopelícula, sino también desde una perspectiva fundamental para aclarar la relación entre las propiedades arquitectónicas y la biología específica de estas estructuras.

Introducción

Los biofilms bacterianos son comunidades de bacterias asociadas a superficies biológicas o artificiales ^1-3. Se forman por un mecanismo de adhesión-crecimiento, junto con la producción de matriz extracelular rica en polisacáridos que protege y estabiliza el edificio ^4,5. Estos biofilms no son simplemente conjuntos pasivos de células pegadas a las superficies, pero los sistemas biológicos complejos dinámicos organizados y. Cuando las bacterias cambian de estilo de vida planctónica biofilm, no se observan cambios en la expresión genética y la fisiología celular, así como una mayor resistencia a los antimicrobianos y el anfitrión defensas inmunológicas son en el origen de muchas infecciones persistentes y crónicas ^6. Sin embargo, el desarrollo controlado de estas estructuras que viven también ofrecen oportunidades para aplicaciones industriales y ambientales, como la biorremediación de sitios de desechos peligrosos, bio-filtración de agua industrial o la formación de bio-barreras para proteger el suelo y el agua subterránea de contamiación.

Aunque cada vez se describen las características moleculares específicas para modo biofilm de la vida, los mecanismos que impulsan el desarrollo de la comunidad y persistencia siguen siendo poco claras. Uso de los recientes avances en las mediciones a microescala usando electroquímica de barrido o microscopía de fluorescencia, estas organizaciones vivos han sido demostrado que presentan una considerable estructural, química y la heterogeneidad biológica ^7. Sin embargo, hasta ahora, la mecánica de biopelícula se han examinado principalmente macroscópicamente. Por ejemplo, la observación de serpentinas biofilm deformación debida a las variaciones en las tasas de flujo de fluido ^8,9, compresión uniaxial de piezas de biopelícula elevación de medio de agar o cultiva en cubierta se desliza ^10,11, cizallamiento de biopelícula obtenida de el medio ambiente y después se transfirió a un paralelo reómetro de placas ^12,13, la espectroscopia de fuerza atómica utilizando una cuenta de vidrio y recubierto con una biopelícula bacteriana unida a un cantilever de AFM ¹⁴ o un micr dedicadoocantilever método para la medición de la resistencia a la tracción de los fragmentos de biofilm separados ^15,16 se han aplicado durante los diez últimos años, el suministro de información útil sobre la naturaleza viscoelástica del material ^17. Sin embargo, parece probable que la información sobre las propiedades mecánicas de biopelícula in situ se pierde cuando se retira el material de su entorno nativo, que era a menudo el caso en estos enfoques. Por otra parte, el tratamiento de la biopelícula como un material homogéneo no encuentra información sobre la posible distribución de las propiedades físicas de la comunidad. Por lo tanto, las implicaciones exactas de la mecánica de la estructura en la formación de biopelículas y rasgos biológicos tales como los patrones de expresión de genes o gradientes químicos casi no se pueden reconocer. Para avanzar hacia una descripción microscópica de las propiedades físicas del biofilm, se requieren nuevas herramientas dedicadas.

Este documento detalla un enfoque original concebido para lograrmedición de los parámetros mecánicos locales in situ, sin alterar la biopelícula y permitiendo dibujo de la distribución espacial de las propiedades del material a microescala y luego la heterogeneidad mecánica. El principio del experimento se basa en el dopaje de un biofilm creciente con micropartículas magnéticas seguido de su carga remota utilizando pinzas magnéticas en la biopelícula madura. El desplazamiento de partículas bajo la aplicación de fuerza magnética controlada fotografiado bajo el microscopio permite la derivación de parámetros viscoelástico local, cada partícula que informa sobre su propio entorno local. A partir de estos datos, el perfil mecánico 3D de la biopelícula se puede extraer, revelando condición dependencias espaciales y ambientales. Todo el experimento se muestra aquí en una E. biofilm coli hecha por una cepa genéticamente modificada que lleva un plásmido F-como desreprimida. Los resultados se detallan en un trabajo reciente ¹⁸ proporcionan una visión única del interior de la mecánica de biopelículas intactas.

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Protocolo

1. Cultura de las bacterias y Suspensión Preparación

1. Elige una colonia recién crecido de una placa de agar Lisogenia caldo (LB), inocular en 5 ml de medio LB líquido que contiene 100 μ g / ml ampicilina y 7,5 μ g / ml de tetraciclina y se incuba durante 5-6 horas a 37 ° C en una plataforma de agitación.
2. A continuación, añadir 100 μ l de cultivo bacteriano en 5 ml de medio mínimo (M63B1) suplementado con 0,4% de glucosa y las mismas concentraciones de antibióticos. Incubar este cultivo durante la noche recién diluido a 37 ° C en una plataforma de agitación.
3. Después de 16 horas de incubación, se añaden 100 l de la cultura de la noche a 5 ml M63B1, 0,4% de glucosa. Mantenga el tubo a 37 ° C para la plataforma de agitación hasta un 0,5 OD se alcanza. La suspensión es entonces listo para la inyección en el canal experimento para la formación de biopelículas.

2. Preparación de Partículas Magnéticas

1. Tomar 10 partículas magnéticas mu l -2,8 μ m de diámetro - de las existencias y lavarlos 3 veces en medio mínimo de 190 l con la ayuda de un soporte de muestras magnético.
2. Ajustar la concentración de partículas de 5 x 10 ⁶ cuentas / ml. Típicamente 50 l de la solución de bolas lavado se mezclan con un más 950 μ l de M63B1 con 0,4% de glucosa.

3. Preparación Channel y Crecimiento Biofilm

1. Canal de montaje
   1. Corte dos cuadrados (800 μ m de lado) capilares de vidrio borosilicato de 10 cm de largo para obtener piezas de dos 8 cm de largo.
   2. Pegue las dos piezas capilares sobre dos láminas de vidrio - reducir a la mitad primera - 2 cm de distancia con 1 cm de saliente en cada extremo como en la figura 1, utilizando un pegamento de cianoacrilato de acción rápida (los llamados super-pegamento).
   3. Autoclave toda la configuración y la tubería necesaria requerida para su posterior conexión de canal.
   4. Reúna todos los materiales estériles bajouna campana de flujo laminar: i) el canal montado y la trampa 1, ii) los tubos y conectores, iii) las dos trampas de burbujas - el filtro de burbujas utilizados comúnmente para fijar goteo de lactar (trampa de los niños 1) y la trampa de burbujas casero como 4 cm de largo tubo de mayor diámetro (trampa 2), iv) las abrazaderas, v) 30 ml jeringas llenas de M63B1, 0,4% de glucosa, y vi) la botella de residuos.
   5. Conecte toda la instalación con conectores Luer Lock o cruces en el siguiente orden: 50 ml M63B1 jeringa controlada por la bomba de jeringa, filtro burbuja pediátrica, trampa de burbujas casero, capilar (Figura 1, panel B), y el tubo a la botella de residuos. A continuación, llenar la instalación con M63B1 estéril, 0,4% de glucosa, encender la bomba de jeringa a una velocidad de aproximadamente 10 ml / h, por encima de las tasas de experimentación. Rastrear con cuidado y eliminar todas las burbujas en el circuito.
   6. El flujo del medio a través del sistema durante 10-15 minutos; al mismo tiempo la mezcla 1 ml de la suspensión de bacterias a una DO de 0,5 a partir de la sección1.3 con 1 ml de la solución de bolas se lavó preparado en la Sección 2.2.
   7. Adjuntar (pero no cierre) abrazaderas para el tubo en dos posiciones: antes y después de los capilares. Cambie el flujo fuera.
   8. Introducir la mezcla bacteriana en perlas en el capilar después de la casa hecha la trampa de burbujas con una jeringa de 1 ml, teniendo cuidado de sostener los extremos del tubo para evitar la entrada de aire. Vuelva a conectar el tubo y cierre las abrazaderas.
   9. Repita el mismo procedimiento para el segundo capilar y se les presentarán todas las cámaras de aire para las burbujas.
   10. Transferir el aparato al microscopio y déjelo reposar durante 15-20 minutos para permitir que las bacterias para asentarse y unirse a la superficie de los capilares. Instalar el capilar en la platina del microscopio con el contenedor de residuos a un nivel ligeramente superior. Coloque la bomba de jeringa en el mostrador junto al microscopio. Elevar la trampa de burbujas antes de que el capilar ligeramente más alto que el plano capilar para capturar burbujas.
2. Biofilm Growth
   1. Ajustar la velocidad de flujo en la bomba de jeringa e iniciar el flujo, la biopelícula ahora desarrollar en la superficie capilar durante el período requerido - generalmente 24 o 48 horas en estos experimentos.
   2. Centrarse en el plano inferior capilar e iniciar la grabación de lapso de tiempo de las imágenes de la muestra - por lo general una frecuencia de adquisición de 2 images / min informará adecuadamente el crecimiento de biopelículas. Esta monitores de vídeo biofilm crecimiento post-control (ver extractos en Videos 1, 2 y 3).

4. Pinzas Magnéticas de instalación

1. Atornillar las pinzas magnéticas en micromanipuladores XYZ controlados manualmente y atornillar los micromanipuladores en la platina del microscopio para ajustar la posición de las pinzas relativamente al capilar. Colocar las pinzas como en la Figura 2 para asegurar el gradiente de campo magnético apropiada se genera en la zona de observación.
2. Conecte las pinzas to el generador de funciones a través de la etapa de potencia para generar un período de 40 segundos de tiempo hecha de 24 segundos de la señal cero y 16 segundos de 4 A de corriente continua con un gatillo enviado al campo claro obturador luz después de 20 segundos para la sincronización de la señal que proporciona una secuencia de eventos como en la Figura 3.
   Nota: Estas dos operaciones se pueden conseguir en cualquier momento entre la instalación y la medición capilar principio. Ver experimentar boceto resumen en la figura 4.

5. Arrastramiento Curve Adquisición

1. Utilice el control de movimiento XY de la platina del microscopio para traer el borde del polo magnético de la izquierda y el borde izquierdo del capilar en el mismo campo de observación. Tome el origen del referencial análisis en la intersección de x e y ejes definidos por el borde del capilar y el borde de la pieza polar, respectivamente (véase la Figura 2).
2. Ajuste la posición vertical del capilar mediante enfoque fino cperilla ontrol de la posición microscopio. Típicamente, la primera examinado plano se encuentra entre 4 a 7 μ m por encima de la parte inferior capilar. Vídeo 1 corresponde al campo XY que tiene su esquina superior izquierda en el origen de la referencia espacial.
3. Activar la secuencia de 40 segundos de eventos descritos en la sección 4.2 y en la Figura 3 por el cambio en el generador de corriente y, al mismo tiempo, accionar manualmente la secuencia de adquisición de la imagen de vídeo 1.
4. Mueva el capilar para el campo derecho vecino por un 250 μ m traducción de la platina del microscopio, a la izquierda y operar como en la sección 5.3 para generar vídeo 2 de la rebanada de 2 y así sucesivamente para obtener los videos requeridos. Típicamente 3 a 4 campos de 250 x 250 μ m ² se recogen a lo largo del eje x antes de cambiar el plano y repitiendo las mismas operaciones para el nuevo plano.

6. Calibración Fuerza

1. Preparar una solución de glicerol mezclando 39,8 g de glicerol con 190 μ l de agua bidestilada y 10 l de partículas magnéticas en un 2 x 10 ⁹ partículas / ml y llenar un canal experimental con esta mezcla y colocarlo en la platina del microscopio como se describe para la muestra de biopelículas.
2. Después de instalar las pinzas magnéticas, como se indica en la sección 4, aplicar la fuerza magnética, como se indica en el punto 5.4 y hacer que las imágenes de lapso de tiempo para extraer cada velocidad de una partícula (v) y su posición en el capilar para obtener el archivo de calibración. Este archivo debe contener la fuerza aplicada en función de su posición en la zona de análisis del capilar de acuerdo con la ley de Stokes, F = 6πRηv (R: radio de la partícula).

7. Análisis

1. Utilice un software de "partícula rastreador" para obtener los archivos de texto con las posiciones de las partículas en cada marco para todas las pilas de imágenes adquiridas, como se indica en la sección 5. Usíng la imagen frecuencia de adquisición pila, calcular el desplazamiento de las partículas como una función de tiempo (por ejemplo, Figura 5 y de vídeo 4).
2. Usando el archivo de calibración de fuerza, convertir las curvas de desplazamiento a curvas de cumplimiento (cumplimiento total del material - j (t) - como una función del tiempo) de acuerdo con la fórmula cumplimiento:
   
   que da la relación entre la deformación del material y la tensión aplicada para una partícula sonda de radio R incrustado en un medio viscoelástico incompresible, homogéneo según lo establecido previamente por Schnurr y compañeros de trabajo ^19.
3. Ajustar las curvas de deformación por fluencia para el modelo general Burgers para materiales viscoelásticos y derivar los parámetros viscoelásticos, J _0, J _1, η _0, η ₁ para cada partícula ( Figura 6), según la fórmula de Burgers:
   
   Nota: Este análisis fenomenológico se ha empleado previamente para una amplia gama de materiales, incluyendo materiales biológicos tales como las biopelículas para interpretar los datos de reología macroscópicas ^20-22.

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Resultados

Un análisis típico proporcionará la distribución espacial de los parámetros viscoelásticos en la escala de micras en una biopelícula que viven sin molestar a su disposición original. Los resultados típicos se muestran en la Figura 7, donde los valores de J ₀ - se dan como una función del eje z a lo largo de la profundidad y de la eje y a lo largo de una dimensión lateral de la biopelícula - el cumplimiento elástica. Cada punto corresponde a una perla que el análisis de la curva ...

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Discusión

Esta partícula magnética de la siembra y tirando experimento habilitado en la cartografía 3D in situ de los parámetros viscoelásticos de un biofilm creciente en su estado original. Este enfoque reveló la heterogeneidad mecánica de la E. coli biofilm crecido aquí y dio pistas para señalar los componentes de biopelículas que soportan las propiedades físicas del biofilm, lo que sugiere fuertemente una implicación fundamental de la matriz extracelular y con mayor precisión su grado de...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline.
Table 2: Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3 mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	Standard medium used to grow bacteria.
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum medium used to grow bacteria.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose.
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth.
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH - particle tracker plugin