Contextuales y complementada el condicionamiento del miedo de prueba utilizando un sistema de análisis de vídeo en ratones

Resumen

En este artículo se presenta un protocolo para un temor prueba contextual y complementada acondicionado mediante un sistema de análisis de vídeo para evaluar el aprendizaje del miedo y la memoria en ratones.

Resumen

La prueba de acondicionamiento miedo contextual y con claves es una de las pruebas de comportamiento que evalúa la capacidad de los ratones para aprender y recordar una asociación entre las señales ambientales y experiencias aversivas. En esta prueba, los ratones se colocan en una cámara de acondicionamiento y se dan recortes de un estímulo condicionado (una señal auditiva) y un estímulo no condicionado aversivo (una descarga en las patas eléctrica). Después de un tiempo de retardo, los ratones son expuestos a la misma cámara de acondicionamiento y una cámara en forma diferente con la presentación de la señal auditiva. Congelación comportamiento durante la prueba se mide como un índice de la memoria del miedo. Para analizar el comportamiento de forma automática, se ha desarrollado un sistema de análisis de vídeo utilizando el programa de software de aplicación ImageFZ, que está disponible como descarga gratuita en http://www.mouse-phenotype.org/. En este caso, para mostrar los detalles de nuestro protocolo, demostramos nuestro procedimiento para el contexto y con claves de prueba acondicionado miedo en ratones C57BL/6J usando el sist ImageFZem. Además, hemos validado nuestro protocolo y el rendimiento del sistema de análisis de vídeo mediante la comparación de tiempo de congelación medida por el sistema ImageFZ o un sistema de medición de equipo basado en Photobeam con que anotado por un observador humano. Como se muestra en nuestros resultados representativos, los datos obtenidos por ImageFZ fueron similares a los analizados por un observador humano, lo que indica que el análisis de comportamiento utilizando el sistema de ImageFZ es altamente fiable. El presente artículo película proporciona información detallada sobre los procedimientos de prueba y promover la comprensión de la situación experimental.

Introducción

La prueba de acondicionamiento miedo contextual y con claves es el paradigma conductual se utiliza para evaluar el miedo asociativo aprendizaje y la memoria en roedores ^1-3. Esta prueba ha sido ampliamente utilizada para comprender los mecanismos neurobiológicos del aprendizaje y la memoria en el miedo transgénicos y knock-out ratones ^1,4-16. Comportamiento de congelación, que se define como la inmovilidad completa, con la excepción de la respiración, es una respuesta común a situaciones de miedo. En este paradigma de comportamiento, después los animales son expuestos a un emparejamiento de una señal auditiva con una descarga en las patas eléctrica, que responden al estímulo produce miedo por mostrar un comportamiento de congelación, que se mide como un índice de aprendizaje asociativo miedo y la memoria. Esta prueba requiere equipo menos elaborado, menos esfuerzo físico por parte del investigador, y mucho menos tiempo de entrenamiento para los ratones que otras tareas de aprendizaje y memoria, sino que por lo general requiere aproximadamente 5-10 min / día por ratón durante 2 días. Aunque el procedimiento de la prueba es simple y requiere poco tiempo para llevar a cabo, el investigador debe observar cuidadosamente y medir el comportamiento del ratón, por lo que varios sistemas de medición automáticos se han desarrollado para llevar a cabo el análisis del comportamiento ^17-20. Nuestro sistema de vídeo-análisis, que hemos desarrollado con el programa de software ImageFZ, nos permite analizar fácilmente el comportamiento de congelación y producir resultados de alta fiabilidad. En este artículo se proporciona información detallada sobre los procedimientos de pruebas y se describe cómo utilizar el programa de software ImageFZ.

Protocolo

Todos los experimentos deben realizarse de acuerdo con la orientación y los protocolos establecidos por los Comités de Cuidado de Animales y el empleo locales.

1. Aparato Marco

1. El aparato para la prueba de acondicionado y el contexto es una cámara cuadrada con un suelo de rejilla electrificable, una fuente de sonido, y un generador de choque calibrado. Se utilizan varios tamaños de la cámara, con dimensiones que varían de 54 cm x 27 cm x 30 cm de ²¹ a 25 cm x 35 cm x 30 cm ^22. En este protocolo, el aparato consiste en una cámara cuadrada de acrílico (33 cm x 25 cm x 28 cm; transparente en las paredes delantera y trasera, de color blanco en las paredes laterales) con rejillas de metal (0,2 cm de diámetro, espaciados 0,5 cm de separación) cubiertos por una tapa de acrílico transparente (Figura 1A). Es necesario colocar la cámara en un piso de acrílico blanco (Figura 1B) para analizar el comportamiento de los ratones marrón negro, agutí o diluir, ya que un sistema de análisis de imagen con el queprograma mageFZ software (disponible para su descarga gratuita, consulte la Tabla de materiales / reactivos) que distingue a un sujeto oscuro de un fondo blanco de cada imagen de vídeo capturado en. Ratones albinos también se pueden probar usando rejillas de metal negro y un piso de acrílico negro (Figura 1B). Diodo emisor de luz (LED) se unen al techo por encima del aparato. El suelo de rejilla se ilumina a 100 lux por las luces LED. Un altavoz conectado a un generador de ruido blanco / tono (Figura 1C) se monta en un techo 5 cm por encima de la tapa para presentar una señal auditiva (un ruido blanco, 55 dB) como un estímulo condicionado (CS). Las rejillas están conectados a un generador de descargas (Figura 1C) para entregar un choque eléctrico eléctrico como el estímulo incondicionado (EE.UU.). La cámara de ensayo se coloca en una habitación a prueba de sonido (170 cm x 210 cm x 200 cm) (Figura 1D) para minimizar el ruido externo durante las pruebas. Esta condición también evita que los ratones a los que actualmente no están siendo sometidos a unprobar de escuchar una señal auditiva o la vocalización de los ratones de prueba.
2. El aparato para la prueba de cued se compone de una cámara que tiene propiedades diferentes de la cámara de acondicionamiento, proporcionando un nuevo contexto. Es imperativo para cambiar las señales sensoriales tanto como sea posible de modo que el ratón percibe la novela contexto como no relacionada con la cámara de acondicionamiento. En general, se utiliza una caja en forma diferente o una cámara triangular. Además, diferentes de iluminación y / o señales olfativas también se proporcionan al ratón. En este protocolo, el aparato es una cámara triangular de acrílico (33 cm x 29 cm x 32 cm; blancas en cada pared lateral) con un piso plano de color blanco para los ratones marrón negro, agutí o diluir o un piso negro piso en albino ratones, cubierto con una tapa de acrílico transparente (Figura 1E). Luces LED están unidos al techo por encima del aparato. El nivel de iluminación de la pista se ha fijado en 30 lux. Un altavoz está montado en el techo 5 cm por encima de la tapa para prESENT una señal auditiva que es la misma que se proporciona a los ratones en el momento de acondicionado. La cámara triangular se encuentra en una sala insonorizada diferente de la habitación en la que se llevan a cabo el acondicionamiento y la prueba de contexto.
3. Cada cámara está equipada con una carga montada en el techo Coupled Device (CCD) se conecta a un ordenador con Windows a través de cuatro divisor de vídeo y USB dispositivo de captura de imágenes para monitorear el comportamiento del ratón, y las imágenes de los aparatos y el ratón son capturados y analizados por el programa de software de aplicación ImageFZ (ver Protocolo 6). Los generadores de ruido blanco y descarga en las patas son controlados automáticamente por el programa de software ImageFZ, la hora de inicio y la duración del ruido blanco y descarga en las patas deben estar escritos en un archivo de texto (ver un archivo de texto de ejemplo "simple-aire 'se muestra en el video de la detalles sobre cómo los parámetros se escriben en el archivo), que se lee en la aplicación.
4. Antes de cada prueba se inicia, las paredes de acrílicoy pisos se limpian con una toalla empapada en agua hipocloroso super (pH 6-7), y las rejillas se limpiaron con etanol al 70% para evitar un sesgo basado en señales olfativas. Las rejillas se limpiaron con etanol en vez de agua hipocloroso súper para asegurar que las rejillas no disminuyen su conductividad eléctrica debido a la oxidación.

2. Preparación de los animales

1. Por lo general, de dos a cuatro ratones son alojados por jaula en una sala de espera con temperatura controlada (23 ± 2 ° C) con un 12 hr luz / oscuridad ciclo (por ejemplo, luces encendidas a las 7:00 AM).
2. En este protocolo, para reducir las posibles influencias de transporte jaula en el comportamiento y para adaptar los ratones para el medio ambiente experimental, las jaulas que contienen los ratones se transfieren desde el local de confinamiento en una sala de espera a prueba de sonido adyacente a una sala de pruebas a prueba de sonido, al menos, 30 min antes del comienzo de cada prueba.
3. Todos los experimentos (Figura 2A) se debe realizar durante los speríodo de tiempo ame a la luz o la fase oscura de cada día para minimizar las variaciones de comportamiento obtenidos de ensayos realizados en diferentes momentos ^23,24. En este protocolo, todos los experimentos se llevan a cabo entre 1 hora después del inicio de la fase de luz y 1 hora antes del inicio de la fase de oscuridad (8:00 AM a 6:00 PM en la fase de la luz). Si sólo hay un aparato está disponible, los ratones de cada genotipo se deben probar en un orden alternado para reducir los efectos potenciales del tiempo experimental y el orden de las pruebas de los sujetos en el rendimiento conductual. ImageFZ puede controlar un máximo de 4 aparatos. Prueba de 4 ratones al mismo tiempo mediante el uso de 4 aparatos en un orden alternado permite al investigador para ahorrar tiempo y reduce los posibles efectos de los parámetros experimentales sobre el comportamiento del ratón.

3. Acondicionamiento

1. Los ratones se colocan en la cámara de acondicionamiento, y los ratones son típicamente les permite explorar libremente la cámara para 120 seg. A partir de entonces, la aucue ditory, como un ruido blanco, el tono y clicker auditivo, se presenta como un CS durante 30 segundos, y una descarga en las patas 0,1-0,8 mA es dada a los ratones como los EE.UU. durante los últimos 2 segundos del sonido. La presentación del pelado EC-EI se repite para fortalecer la asociación. Los ratones se dejaron en la cámara durante un período de tiempo después de la última presentación para establecer aún más la asociación entre el contexto de la cámara y la experiencia aversiva. En este protocolo, después de 120 segundos de la exploración libre, una señal auditiva (ruido blanco, 55 dB) se presenta durante 30 segundos, y una descarga en las patas 0,3 mA se entrega de forma continua durante los últimos 2 segundos del ruido blanco. Después de 90 segundos, la pareja formada por la señal auditiva con la descarga en las patas se le da a los temas de nuevo. La presentación de CS-US repite tres veces por sesión (120, 240, y 360 segundos después del comienzo de la acondicionado) (Figura 2B). Después de la descarga en las patas final, los ratones se dejan reposar en las cámaras para 90 seg.
2. Antes de que comience la sesión de acondicionamiento, ejecute el programa de software de aplicación ImageFZ, seleccione el menú de plug-in 'FZ FZ acondicionado y línea (4 cámaras)', y establecer los valores de los parámetros paso a paso de la siguiente manera.
   1. Paso 1: Identificación de Proyectos. Especifique la carpeta donde desea almacenar los archivos de datos.
   2. Paso 2: Nombre de la sesión. Escriba cualquier palabra, por ejemplo, la fecha experimental, en la caja 'Sesión' y seleccione un archivo de texto de referencia en el que el tiempo de inicio y la duración del ruido blanco y descarga en las patas se escriben, en la caja 'Referencia'. Un archivo de texto de ejemplo se muestra en el video.
   3. Paso 3: Configuración de parámetros. Introduzca los valores de los parámetros en cada cuadro de la siguiente manera.
      1. Tarifa (cuadros / s): velocidad de cuadro de adquisición de imágenes, por ejemplo, 1 cuadro / seg.
      2. Duración (seg): en el caso de acondicionamiento, la duración total es de 480 seg.
      3. Duración Bin (seg): por ejemplo, 60 seg; Los datos se analizan en cada bloquede 60 seg.
      4. Tamaño Asunto - min (píxeles): ImageFZ detecta un ratón y el ruido como las partículas de negro (algunas masas de píxeles) en un fondo blanco en cada imagen. Cuando el área de la partícula de negro (píxeles) es menor que el "tamaño de Asunto - min (píxeles) 'valor (por ejemplo, 100 píxeles), las partículas se consideran como ruido y se excluyen del análisis de imagen.
      5. Asunto tamaño - max (píxeles): cuando los tamaños de las partículas negras son más que el tamaño del "tamaño Asunto - max (pixels)« valor, las partículas quedan excluidos del análisis.
      6. Tamaño de caja - ancho / altura (cm): dimensión de la cámara, es decir, 33 cm de ancho y 25 cm de alto.
      7. Congelación criterio (píxeles): por ejemplo, 30 píxeles, vea los detalles en el Protocolo 6.
      8. Congelación duración - min (seg): por ejemplo, 2 segundos, y cuando no se detecta ningún movimiento del ratón por sólo menos de 2 segundos, su comportamiento no se cuenta como "congelamiento";.
      9. Tasa Shock (cuadros / s): ver los detalles en el Protocolo 6.
   4. Paso 4: Tema ID. Introduzca la identificación del sujeto.
   5. Paso 5: Configuración de la cámara. Permite controlar el brillo y el contraste de la imagen capturada.
   6. Paso 6: Configuraciones de umbral. Ajuste los valores de umbral para detectar un ratón negro en forma de píxeles negros en un fondo blanco en cada imagen y para juzgar el comportamiento del ratón como "congelación" o "no-congelación" (ver los detalles en el Protocolo n º 6). Para analizar un ratón albino, haga clic en la casilla 'modo de inversión', y ajustar los valores de umbral adecuadamente.
   7. Paso 7: Configurar la jaula de campo. Especifique el campo de cada cámara que desea capturar. Después de hacer clic en el botón de rectángulo en la caja de herramientas, dibujar un rectángulo alrededor del piso de la cámara en la ventana de la imagen en vivo. A continuación, seleccione el número de cámara y haga clic en el botón 'Set'. Por último, haga clic en el botón ''.
3. Después de los ajustes de los parámetros se establecen, una prueba preparatoria debe administrarse utilizando ratones de práctica (ratones no utilizados como sujetos) antes de la primera prueba del día para determinar si el sistema de análisis de imagen y blancas generadores de ruido / choque funcionan sin problemas.
4. Mover una jaula que contiene los ratones de la práctica a la sala de ensayo insonorizada de la sala de espera adyacente, y coloque cada ratón en la cámara de acondicionamiento. Inmediatamente después de la colocación de los ratones de la cámara, haga clic en el botón de inicio de ImageFZ. El software de aplicación se presentarán señales auditivas y / o estímulo eléctrico plantar eléctricas a los ratones en el orden que se especifica en un archivo de referencia.
5. Una vez transcurrido 480 segundos, volver a los ratones a su jaula y volver a la jaula para la plataforma en la sala de espera.
6. Limpie las cámaras con cuidado. A continuación, haga clic en el botón "Análisis Next ', y repita los pasos 3.2.4-3.6 para los ratones de prueba.
7. Tiendas ImageFZ viven y trazar imágenes en formato TIFF. El programa permite a losnos permiten realizar un análisis fuera de línea para volver a analizar las imágenes utilizando los valores de parámetros modificados. Si usted realiza un análisis fuera de línea, seleccione el plug-in del menú 'Fear acondicionado y FZ Desconectado "y seleccione la carpeta de datos que desea volver a analizar. A partir de entonces, de entrada los valores de los parámetros de nuevo y haga clic en el botón ''.

4. Prueba Contexto

1. Después de la sesión de condicionamiento se ha completado, los ratones se devuelven a la misma cámara de acondicionamiento y marcados para la congelación de comportamiento para medir el miedo contextual acondicionado (prueba de contexto). Un intervalo de retardo entre el acondicionado y la prueba de contexto se ha establecido en general, a las 24 h. En este protocolo, para evaluar la memoria reciente y la memoria remota (medido por el test de 1 día y más de 28 días después del acondicionamiento, respectivamente) ^25, los ratones se sometieron a la prueba de contexto, aproximadamente 24 horas y 30 días después de la sesión de condicionamiento. Los ratones se colocan en la conditioning cámara y se les permite explorar libremente la cámara durante 300 segundos y sin EC y el EI presentaciones (Figura 2C).
2. Ejecute el programa de software ImageFZ y establecer los valores de los parámetros del software de aplicación de la misma manera que en el condicionamiento (véase la sección 3.2.3), sin embargo, modificar el tiempo de duración de esta prueba a 300 segundos y seleccione un archivo de texto de referencia para la prueba de contexto . Después de cambiar la configuración, una prueba preparatoria debe administrarse utilizando ratones de práctica para comprobar el sistema ImageFZ.
3. Coloque cada ratón en la cámara de acondicionamiento y haga clic en el botón de inicio. Una vez transcurrido 300 segundos, devolver los ratones en su jaula, y dejar la jaula en reposo hasta que comience la prueba con claves.
4. Limpie las cámaras. A continuación, haga clic en el botón "Análisis Next ', y repita los pasos 4.3 hasta 4.4 en los ratones de prueba.

5. Prueba con claves

1. Prueba con claves se lleva a cabo en el mismo día de la prueba de contexto o en el día siguiente.En esta prueba, los ratones se colocan en otra cámara de pruebas con propiedades muy diferentes, proporcionando un nuevo contexto que no está relacionada con la cámara de acondicionamiento durante 3 min. Al final de la primera 3 min, la señal auditiva que se presenta en el momento de acondicionado se da a los ratones durante 3 min en la novela entorno de contexto. En este protocolo, se realiza la prueba con claves de unas pocas horas después de la prueba de contexto. Los ratones se les permite explorar la cámara triangular para 360 seg. En los primeros 3 minutos, ni un CS ni EE.UU. se presenta, ya partir de entonces, un CS (a 55 dB de ruido blanco) se presenta para la última 3 min.
2. Ejecutar el programa de software ImageFZ y establecer los valores de los parámetros de la misma manera como en el acondicionamiento, excepto modificar el tiempo de duración de la prueba a 360 seg y seleccione un archivo de texto de referencia para la prueba con claves. Después de ajustar la configuración, una prueba preparatoria debe administrarse utilizando ratones de práctica para comprobar el sistema ImageFZ.
3. Coloque cada ratón en la cámara de forma triangular y haga clic en el iniciobotón. Una vez transcurrido 360 segundos, volver a los ratones a su jaula y devuelva la caja al estante de la sala de espera.
4. Limpie las cámaras. A continuación, haga clic en el botón "Análisis Siguiente" y repita los pasos 5.3 a 5.4 en los ratones de prueba.
5. A fin de probar la memoria remota, repita los Protocolos 4-5 alrededor de 30 días después de la sesión de condicionamiento (Figura 2A).

6. Análisis de Imagen

1. Lleve a cabo la adquisición y análisis de datos de forma automática utilizando ImageFZ. Este programa de software de aplicación se basa en el programa de dominio público ImageJ (desarrollado por Wayne Rasband en los Institutos Nacionales de Salud y disponible en http://rsb.info.nih.gov/ij/), modificado por Tsuyoshi Miyakawa (software de aplicación ImageFZ , disponible para su descarga gratuita, ver Tabla de materiales / reactivos).
2. Para todos los experimentos, la captura de imágenes a una velocidad dada marco (por ejemplo, 1 fps) con ImageFZ usando un dispositivo de captura de vídeo USB, incluyendo uncámara de vídeo. Para medir la distancia recorrida a partir de las imágenes consecutivas, ajustar el valor del programa (por ejemplo, 80 píxeles), que se fija al segmento de las imágenes en una partícula negro (un ratón) y un fondo blanco los 'umbrales min. La distancia recorrida se calcula a partir de la distancia entre cada conjunto de las coordenadas XY para el centro de gravedad de la partícula en las imágenes consecutivas.
3. Para medir el comportamiento de la congelación de las imágenes consecutivas, ajuste el "umbral min (xor)« valor del programa (por ejemplo, 160 píxeles), que se fija al segmento de las imágenes en una partícula negro (ratón) y el fondo, y luego calcular la cantidad de área (pixeles) de las regiones no superpuestas entre las partículas de cada par de imágenes consecutivas. Ajuste el valor con el control deslizante de la herramienta umbral hasta que la partícula de negro en cada imagen coincide con la forma de todo el cuerpo del ratón sin incluir la cola. Si el área de la nonoverlapping región está por debajo del valor "criterio de congelación '(por ejemplo, 30 píxeles), el comportamiento es considerado como" congelamiento "(Figura 3), que generalmente se define como la ausencia total de cualquier movimiento, excepto para la respiración y el ritmo cardíaco. Cuando el área excede este valor, el comportamiento se considera que es "no-congelación '(Figura 3). El juicio debe hacerse con base en la definición de la congelación. Los ratones a veces exhiben un movimiento sutil y una inmovilidad momentánea, lo que no podría considerarse como un comportamiento de congelación que refleja el miedo. La inmovilidad que dura por un corto tiempo (por ejemplo, menos de 2 segundos), que es probablemente diferente de la manifestación del miedo, puede ser excluido del análisis estableciendo el umbral de tiempo de congelación. Para establecer el umbral de tiempo, entrada de 'congelación duración - min (segundos)' valor (por ejemplo, 2 segundos).
4. El programa ImageFZ automáticamente calculAtes la distancia recorrida (cm) y el porcentaje de congelación. Los resultados se guardan en archivos de texto, y viven y se trazan las imágenes se almacenan en formato TIFF. Para medir la distancia recorrida (cm) como un índice de sensibilidad descarga en las patas eléctrica, el programa ImageFZ también adquiere imágenes a una alta velocidad de cuadro (por ejemplo, 4 fps) durante 6 s, medida a partir de 2 segundos antes de la entrega de una descarga en las patas 2 seg hasta 2 segundos después de choque eléctrico durante el análisis en línea. Para establecer la velocidad de fotogramas para la captura de imágenes, antes, durante y después de la descarga en las patas, la entrada de un valor en el «índice de Shock (cuadros / seg) 'caja. Tras el análisis en línea, realizar análisis fuera de línea seleccionando un plug-in del menú 'FZ Choque sin conexión' para obtener los datos de la distancia recorrida.
5. Los valores de los parámetros del programa ImageFZ deben ser optimizados para generar resultados similares a los obtenidos por los observadores humanos en las pruebas preparatorias. Para la puntuación manual, el comportamiento de la congelación se mide continuamente mediante un stopwatch y un programa de eventos de grabación o un procedimiento de muestreo de tiempo instantáneo cada 3-10 segundos, durante el análisis utilizando el software ImageFZ. Dos observadores típicamente llevan a cabo la observación del comportamiento. Para ajustar los valores de los parámetros del programa ImageFZ para asegurar que los resultados del análisis de imágenes son compatibles con los de los observadores humanos, realizar un análisis en línea del programa ImageFZ, modificando el "umbral min (xor) 'y valores" criterio congelación' . Para realizar el análisis fuera de línea, seleccione el menú de plug-in 'FZ sin conexión "y la entrada de los valores de los parámetros.

7. Solución de problemas

1. ¿Cómo se puede obtener el programa ImageFZ e instalado?
   El programa ImageFZ está disponible para su descarga gratuita desde nuestro sitio web (véase la Tabla de materiales / reactivos), y se ejecuta en un equipo con Windows. Descargar la carpeta zip para ImageFZ e instalar el software en su ordenador. Consulte el archivo "readme.txt" para la INSTALACIÓNen los detalles y siga las instrucciones paso a paso.
2. ¿Por qué aparece el mensaje de error "dispositivo de captura de ajuste de error '?
   Compruebe la conexión del cable de la cámara y de la instalación del controlador del dispositivo de captura de imágenes USB. Si no hay ningún problema con la configuración, el software ImageFZ no podría funcionar con el dispositivo de captura de imágenes. Consulte el archivo "readme.txt" en relación con el dispositivo adecuado para usar con el software ImageFZ.
3. ImageFZ no puede detectar la totalidad del cuerpo del ratón como una partícula.
   Establezca el valor de "umbral min 'y / o' umbral min (xor) 'menor que el valor actual. Si ImageFZ no detecta el ratón en un lugar específico, por ejemplo, la esquina de una cámara de prueba y, a continuación, podrían existir condiciones de prueba suficientes, como un piso uniformemente iluminado o una diferencia de poco contraste entre el ratón y el fondo. Para resolver este problema, ajustar los valores de los parámetros (por ejemplo, brillo y el contraste de los valores de la imagen y de umbral en vivo) de ImageFZ, controlar el número y la posición de las luces, o utilizar un fondo blanco por un ratón negro.
4. Captura de imagen a una velocidad alta se ralentiza el ordenador durante el análisis en línea.
   Ajuste la velocidad de fotogramas a un valor inferior a la tasa actual, y realizar análisis en línea. El análisis ImageFZ, a través de adquisición de la imagen en 1 fps, es suficiente para medir con precisión la congelación, como se muestra en la sección de resultados representativo.
5. Los resultados del análisis ImageFZ no están de acuerdo con los de puntuación humano.
   Examine la imagen almacenada y archivos de resultados del juicio. Si ImageFZ sobreestima la congelación, establezca el 'criterio de congelación »a un valor menor que el valor actual, y realizar análisis fuera de línea. Si ImageFZ subestima congelación, establezca el "criterio congelamiento" a un valor superior al valor actual.
6. En optogenetical y vivo electrofisiológica e enxperimentos, el cable de fibra adherida a la cabeza del ratón interfiere con el juicio de la congelación.
   Escudo de los cables en blanco para un ratón negro y cambiar la posición y el ángulo de la cámara hasta que no se detectan los cables.
7. ¿Qué se necesita para el análisis fuera de línea?
   Cree una carpeta denominada 'Image_FZ' en el directorio raíz del programa ImageFZ. En esta carpeta, cree las subcarpetas 'Imágenes' y 'Sesiones'. Mover una imagen en escala de grises de 8 bits a la carpeta "Imágenes", y crear un archivo de texto en el que el nombre de archivo de la imagen se escribe en la carpeta 'Sesiones'. A partir de entonces, ejecutar el análisis offline ImageFZ, y siga las instrucciones del programa.

Resultados

En la prueba de condicionamiento del miedo, los experimentadores humanos utilizan para cuantificar el comportamiento de congelación a través de la observación directa de trabajo intensivo ^26-29, pero los sistemas de medición de la computadora recientemente Photobeam-basado (por ejemplo, el sistema de 'Freeze monitor') y la imagen-de análisis se han utilizado para automáticamente medir el comportamiento de congelación ^26,30-32. ImageFZ es un sistema de imagen-el análisis automatizado, que produce resultados comparables a los obtenidos a través de la observación humana, como se describe a continuación. En este caso, se compararon los resultados de la observación humana con los de análisis ImageFZ bajo diferentes parámetros: 'Tarifa (cuadros / s) "y" Freezing criterio (píxeles).' En este experimento, cinco ratones C57BL/6J macho (peso corporal medio ± SD (g), 31,4 ± 3,55, con una media ± SD tamaño del cuerpo (píxeles), 351,6 ± 62,2) fueron utilizados en 15-27 semanas de edad. La observación humana se realizó utilizando un programa de eventos de grabación (un programa de software Macintosh OS9), un evento clave de prensado que continúand durante 2 segundos o más cuando un ratón aparece un brote de ningún movimiento fue considerado "congelación". El porcentaje de congelación se calcula cada 60 segundos en cada prueba y se utiliza para los análisis de correlación. El porcentaje de congelación anotado por los 2 observadores (fiabilidad entre observadores, para el acondicionamiento, r = 0,879; prueba de contexto, r = 0,957; para la prueba con claves, r = 0.866, para todos los casos, r = 0.888) fue en promedio de generar un ser humano anotar. Se examinaron las correlaciones entre los porcentajes de congelación medidos a través de ImageFZ con cada velocidad de cuadro (es decir, 1, 2, y 4 fps) y los obtenidos a través de observaciones humanos. Como se ilustra en la Figura 4, los porcentajes calculados de congelación a través de ImageFZ (1, 2, y 4 fps) fueron altamente correlacionados con el valor promedio obtenido de las mediciones de los 2 observadores. En particular, la captura de imágenes a una velocidad más alta no siempre produce la mejor correlación. Análisis de imágenes a 1 fps generado resultados similares a los obtenidos a partir de los observadores humanos en eprueba ach. Se examinaron las correlaciones entre los porcentajes de congelación medidos a través de las observaciones humanas y utilizando ImageFZ en cada condición de los "criterio de congelación (píxeles)" (es decir, 20, 30 y 40 píxeles). Los porcentajes de congelación calculados utilizando ImageFZ en el 'criterio de congelación (píxeles) "de 20, 30 y 40 píxeles fueron, en todos los casos, altamente correlacionados con los obtenidos a través de las observaciones humanas (Figura 5). Como se muestra en la Figura 5D, cuando el criterio de congelación se establece en un valor bajo, el sutil movimiento de un ratón, que se considera ser "congelamiento" por los observadores humanos, sería considerado "no congelar 'usando ImageFZ. Por el contrario, si el criterio se establece en un valor alto, el movimiento de un ratón, calificó como "no-congelación" por los observadores humanos, se consideraría «congelación» utilizando ImageFZ (Figuras 5C, 5F y 5I). Por lo tanto, para obtener los resultados más fiables, cada parámetro del programa ImageFZ debe ser calibrado nosotrosción de los datos obtenidos a través de observaciones humanos en cada entorno de prueba.

Además, se compararon los resultados generados por un observador humano, usando un sistema basado en ordenador de haz de luz de medición (el sistema de congelación del monitor), a los obtenidos utilizando ImageFZ (véase la Figura 6). El observador humano fue cegado al grupo de tratamiento y los resultados de la puntuación ImageFZ. Para los ajustes de los parámetros del sistema de congelación del monitor, se utilizó 3 medidas del porcentaje de congelación de un sistema previamente validado ^30. En pocas palabras, el número de intervalos de 10 segundos en los que los animales requiere más de 1 o 2 segundos para cruzar la primera viga de nuevo el intervalo de (10 seg 1 seg y 10 seg 2 seg, respectivamente) y la latencia entre el comienzo de cada intervalo de 5 seg y Se midió la tercera nueva interrupción del haz dentro de este intervalo (Latency3). Los porcentajes de los intervalos en los que el ratón estaba helada o el porcentaje de la cantidad total de tiempo rEQUIRED para romper se calcularon la tercera Photobeam.

Los porcentajes de congelación medidos en cada sistema se ilustran en la Figura 6. Los grupos se compararon mediante dos vías de medidas repetidas ANOVA seguido de pruebas t (véase la Tabla 1). Los porcentajes de congelación medidos usando ImageFZ (Figura 6B) fueron más similares a los obtuvo a través de la observación humana (Figura 6A) de los datos obtenidos usando un sistema basado en Photobeam (figuras 6C-E). Los porcentajes de congelación medidos utilizando el programa ImageFZ en cada prueba fueron altamente correlacionados con los marcados a través de la observación humana (acondicionamiento, r = 0,947; prueba de contexto, r = 0,970; cued prueba, r = 0,934), mientras que las correlaciones entre los porcentajes de congelación mide utilizando el sistema de medición de equipo basado en Photobeam (10seg 1seg, 10 seg 2 seg o Latency3) y el observador humano fueron menores (acondicionamiento, r = 0.503, 0.593 y 0.761; contexto test, r = 0,772, 0,819, y 0,912) en comparación con las correlaciones entre los porcentajes de congelación medidos usando ImageFZ y la observación humana (Figuras 7A y 7B). Además, la Figura 7 revela que las diferencias entre los porcentajes obtenidos de congelación a través de la observación humana y utilizando ImageFZ en cada ratón fueron las diferencias más pequeñas. Estos resultados indicaron que los porcentajes de congelación medidos usando ImageFZ fueron similares a los obtenidos a través de la observación humana y que ImageFZ es altamente preciso en la medición de la cantidad de congelación.

Figura 1. Aparatos para el contexto y con claves de prueba condicionamiento del miedo. (A) Una cámara cuadrada de acrílico para la prueba de acondicionamiento y el contexto, ( B) rejillas de metal sobre un suelo de plástico blanco para ratones marrón negro, agutí o diluir (arriba) y las rejillas de metal negro electrificables en un piso de plástico negro para ratones blancos (abajo), las imágenes ampliadas de las redes se muestran en la derecha Panel, (C) un generador de ruido blanco / tono y un generador de shock, (D) una sala insonorizada, y (E) una cámara triangular de acrílico con un piso plano para la prueba con claves. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. Representación esquemática del protocolo. (A) Descripción general del contexto y cued prueba acondicionado miedo, (B) acondicionamiento, (C) cONTEXTO prueba, y (D) con claves de prueba. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Análisis de la imagen por el programa de software ImageFZ. Para cada par de imágenes sucesivas, la cantidad de área (píxeles) a través del cual el ratón se movía se calcula por ImageFZ. Cuando esta zona se encuentra por debajo de un cierto umbral (por ejemplo, 30 píxeles), el comportamiento es juzgado para ser «congelación». Cuando la cantidad de área igual o superior al umbral, el comportamiento es considerado como "no-congelación". Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4. Las comparaciones de los porcentajes de congelación calculados a partir de las imágenes a diferentes velocidades de cuadro utilizando ImageFZ con los medidos a través de la observación humana. Las pruebas de condicionamiento de miedo se llevaron a cabo utilizando ratones macho C57BL/6J (n = 5). Durante las pruebas, dos observadores anotaron el comportamiento de la congelación. Al mismo tiempo, se capturaron las imágenes en directo a 4 fps utilizando el programa ImageFZ. Los archivos capturados a 4 fps se recortan después de extraer los fotogramas que corresponden a las imágenes captadas a 1 fps o 2 fps. Los valores de los parámetros de la "Tarifa (cuadros / s)" se establece en 1, 2 o 4 fps, y los porcentajes de congelación en cada 60 seg bin se calcularon a partir de archivos de imagen usando ImageFZ análisis fuera de línea. Cada punto representa un porcentaje de congelación de cada bandeja de 60 seg. Se calcularon coeficientes de correlación de Pearson entre los datos obtenidos a partir de la observación humana y el análisis ImageFZ.Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 5. Los porcentajes de congelación calculados a partir de las imágenes en diferentes valores criterio de congelación utilizando ImageFZ y los medidos a través de observaciones humanos se compararon. Las pruebas de condicionamiento de miedo se llevaron a cabo utilizando ratones macho C57BL/6J (n = 5). Durante las pruebas, dos observadores registraron el comportamiento de congelación, y las imágenes en directo fueron capturados utilizando el programa ImageFZ. Los porcentajes de congelación en cada 60 seg bin se calcularon a partir de las imágenes (1 cuadro / s) a través ImageFZ análisis fuera de línea, el establecimiento de los valores de los parámetros de "criterio de congelación (píxeles) 'a 20, 30, o 40 píxeles. Cada punto representa un porcentaje de congelación de cada bandeja de 60 seg. Coeficiente de correlación de Pearsoncoeficientes entre los datos obtenidos de la observación humana y el análisis ImageFZ se calcularon en cada prueba. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 6. Los porcentajes de congelación se midieron utilizando sistemas automatizados y la observación humana en grupos no acondicionados y acondicionado de los ratones macho C57BL/6J (n = 5, cada grupo). (A) la observación humana, (B) ImageFZ, (C) Congelar sistema de monitor 1 (10seg 1seg), (D) Congelar sistema Monitor 2 (10 seg 2 seg), y (E) Congelar sistema Monitor 3 (Latency3). Grupo comparaciones se realizaron utilizando dos vías de medidas repetidas ANOVA seguido de pruebas t (uncovs acondicionado grupo nditioned grupo, *, P <0,05; †, p <0,01). Los datos obtenidos utilizando ImageFZ fueron similares a los marcados a través de la observación humana. Haz click aquí para ver la imagen más grande.

Figura 7. Se muestran la correlación y la distribución de frecuencia de las diferencias entre los porcentajes de congelación, medidos utilizando sistemas automatizados y la observación humana. (AB) Gráficos de dispersión y coeficientes de correlación de Pearson entre porcentajes de congelación obtenidos a través de sistemas automatizados y la observación humana. Los porcentajes de congelación, calculadas utilizando ImageFZ, están altamente correlacionados con los obtenidos a través de la observación humana. (CF) Ocurrencias de menos de un 10% DIFrencia entre los porcentajes de congelación obtenidos de los sistemas automatizados vs observación humana fueron mayores cuando los datos analizados utilizando ImageFZ se compararon con los analizados a través de la observación humana. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

	ANOVAs
	Condición	Tiempo	Condición x Tiempo
Día 1 (acondicionamiento)
Humano	F (1,8) = 28,53, p = 0,0007	F (7,56) = 20.79, p <0.0001	F (7,56) = 16,58, p <0,0001
ImageFZ	F (1,8) = 13,97, p = 0,0057	F (7,56) = 21.40, p <0.0001	F (7,56) = 11.69, p <0.0001
Freeze Monitor (1sec10sec)	F (1,8) = 5,16, p = 0,0528	F (7,56) = 2.39, p = 0.0329	F (7,56) = 0,72, p = 0,6572
Freeze Monitor (2sec10sec)	F (1,8) = 4,07, p = 0,0782	F (7,56) = 3,44, p = 0,0039	F (7,56) = 1.52, p = 0.1803
Freeze Monitor (Latency3)	F (1,8) = 4,44, p = 0,0682	F (7,56) = 9,94, p <0,0001	F (7,56) = 4,33, p = 0,0007
Día 2 (contexto)
Humano	F (1,8) = 42,94, p = 0,0002	F (4,32) = 1.91, p = 0.1336	F (4,32) = 1.48, p = 0.2302
ImageFZ	F (1,8) = 49,61, p = 0,0001	F (4,32) = 2,06, p = 0,1087	F (4,32) = 0,83, p = 0,5174
Freeze Monitor (1sec10sec)	F (1,8) = 20,28, p = 0,002	F (4,32) = 1,63, p = 0,1918	F (4,32) = 0,55, p = 0,6997
Freeze Monitor (2sec10sec)	F (1,8) = 40,20, p = 0,0002	F (4,32) = 2,66, p = 0,0504	F (4,32) = 1,20, p = 0,3306
Freeze Monitor (Latency3)	F (1,8) = 35,30, p = 0,0003	F (4,32) = 2,49, p = 0,0626	F (4,32) = 1,09, p = 0,3793

Tabla 1. Las comparaciones de las estadísticas.

Discusión

La prueba de acondicionamiento miedo contextual y complementada es uno de los paradigmas más utilizados para evaluar el aprendizaje y la memoria. Esta prueba es una forma de condicionamiento pavloviano en el que se hace una asociación entre un contexto y / o un estímulo condicionado (señal auditiva) y un estímulo aversivo (estímulo eléctrico plantar eléctrica). Después de incluso una sola pareja formada por el contexto / señal auditiva y descarga en las patas, los ratones muestran una congelación de larga duración cuando se enfrentan ya sea con el contexto o el taco. En esta prueba, el comportamiento de congelación se utiliza como un índice de la memoria del miedo. Los estudios farmacológicos y de lesión han puesto de manifiesto que la formación de la memoria, la consolidación, y la recuperación están regulados por varias regiones del cerebro, tales como la amígdala, el hipocampo, la corteza prefrontal y ^3,33-35. Además, los estudios de genética molecular han demostrado el papel de los genes y moléculas que participan en el aprendizaje y la memoria en estas regiones del cerebro utilizando ratones modificados genéticamente ³⁶ específicos. Por lo tanto, esta prueba es simplcorreo y útil para explorar la base neurobiológica subyacente aprendizaje miedo y la memoria. En este artículo de la película, presentamos nuestro protocolo para proporcionar experimentadores con información detallada de entender y fácil de realizar la prueba.

Comportamiento de congelación se cuantificó a través de la observación directa de los experimentadores humanos. Se espera que un experimentador bien entrenado para producir resultados fiables y estables a través de observaciones. Sin embargo, este método implica problemas potenciales, tales como las diferencias en el método de observación, sesgos del observador, y los errores de cuantificación simples, lo que dificulta la comparación directa de los resultados de los experimentadores independientes y diferentes laboratorios. Un sistema de medición de equipo basado en Photobeam automatizado también se ha utilizado ^26,30-32. Sin embargo, este sistema también presenta problemas potenciales en la medición de las conductas de congelación. Debido a la disposición de sensor, este sistema podría ser incapaz de detectar pequeños movimientos de la cabeza que Typically marcarán como "activa" a través de la observación humana. Además, temblores durante la congelación podría ser considerado como nonfreezing porque cuando se congela un animal, interrupciones intermitentes en la Photobeam se observan como consecuencia de temblor. Como método alternativo, la imagen-y el vídeo-análisis de los sistemas automatizados se han desarrollado ^17-20,37,38. Anagnostaras et al. ³⁷ describieron unos sistemas con programas de software de análisis de imágenes que tienen una buena validez y la puntuación de la congelación, así ^17,20,37-38. Sin embargo, la mayoría de estos sistemas y programas de análisis tienen que ser obtenidos de proveedores comerciales y son típicamente costosos. Hemos desarrollado el programa de software ImageFZ para el análisis del comportamiento de la congelación, y este programa se distribuye como un programa de software libre. ImageFZ detecta el ratón como un cuerpo de píxeles (una partícula) y discrimina sutil movimiento del ratón como "congelamiento" o "no-congelación" en función de la cantidad deárea de regiones que no se superponen entre las partículas de cada par de imágenes consecutivas. Como se muestra en los resultados representativos, las mediciones utilizando el programa de ImageFZ son consistentes con o más precisa que la obtenida usando otros métodos. Así, el programa ImageFZ mide automáticamente el comportamiento que los observadores humanos juzgan como la congelación utilizando criterios definidos. Además, el programa ImageFZ calcula la distancia recorrida (cm) antes, durante, y después de la exposición descarga en las patas, lo que facilita una evaluación de la sensibilidad de choque y análisis del comportamiento de congelación.

Existen diferencias metodológicas entre los laboratorios. Estas diferencias pueden resultar en dificultades en la comparación de los datos entre los laboratorios y en la reproducción de los resultados de diferentes laboratorios. Para obtener datos más estables y comparables, es necesario estandarizar el protocolo de prueba tanto como sea posible. El sistema de análisis con ImageFZ conduce a la automatización de los procedimientos de ensayo, que puede contribuir ala estandarización de protocolos utilizado a través de los laboratorios.

Varias respuestas de comportamiento deben ser considerados al analizar el comportamiento de la congelación. En primer lugar, cuando los animales se enfrentan a una situación de miedo, pueden huir en lugar de congelar ^39. Huir es una de las respuestas de miedo, y su incidencia va llevar a subestimar la memoria del miedo. En segundo lugar, la congelación puede depender de un nivel de actividad general, y el nivel de actividad en los ratones experimentales y de control necesita ser examinado. Por ejemplo, aunque los ratones que carecen del receptor de acetilcolina muscarínico M1 mostraron niveles reducidos de congelación en comparación con los ratones de tipo salvaje, diversas pruebas de comportamiento indican que los resultados se pueden atribuir a su fenotipo hiperactividad en lugar de su deterioro de la memoria ^18. ImageFZ calcula la distancia (cm) recorrida por los sujetos. Están disponibles para examinar si existen diferencias en los niveles de actividad en general entre los sujetos de los datos. Si hay una diferencia de grupo enla distancia recorrida, un posible enfoque para el problema es considerar la distancia recorrida durante la primera 2 min de la formación como la actividad de línea de base y utilizar una relación de supresión (relación de supresión = (actividad durante el ensayo) / (actividad durante la línea base + la actividad durante testing)) como un índice secundario de miedo ^17,40. Por último, una diferencia en la sensibilidad al dolor, la inducción de los cambios en la reactividad a una descarga en las patas eléctrica, en su caso, puede resultar en variaciones en el comportamiento de congelación. ImageFZ también calcula la distancia recorrida (cm) en detalle desde 2 segundos antes de una exposición de una descarga en las patas 2 segundos a 2 segundos después de su exposición (durante 6 s), que se puede utilizar como un índice de sensibilidad descarga en las patas.

Sistemas de vídeo-análisis de se han desarrollado para medir el comportamiento de congelación del albino, negro, agouti, y diluir los ratones marrones. ImageFZ utiliza una bandeja de suelo negro y negro rejillas para examinar ratones blancos (véase la Figura 1B). Las rejillas negros están hechos de especificación aliado procesado metales con recubrimiento de pintura negro y tienen una conductividad eléctrica similar a la de las rejillas de metal no recubiertos, que se utilizan típicamente para ratones negros. ImageFZ también analiza el comportamiento de congelación en ratas y otros roedores a través de ajustes de los parámetros del programa. En la versión actual de ImageFZ, el comportamiento del sujeto se registra utilizando una cámara de vídeo desde la pared superior para analizar la congelación. ImageFZ también podría ser utilizado en una configuración donde se capturan las imágenes desde el lado de la cámara. Además, la ImageFZ controla un máximo de 4 aparatos. Esta característica permite al investigador para examinar simultáneamente 4 ratones, ahorrando tiempo y reduciendo las posibles influencias de las diferencias en el tiempo de ejecución de cada sujeto y el fin de las pruebas sobre el comportamiento. Por lo tanto, ImageFZ simplifica el procedimiento de prueba y análisis del comportamiento de congelación, y este programa facilita la prueba con menos mano de obra y sin ningún tipo de formación para los experimentos conductuales.

e_content "> En el laboratorio Miyakawa, hemos evaluado más de 110 cepas de ratones genéticamente modificados y el control de ratones de tipo salvaje en la prueba de acondicionamiento miedo contextual y con claves utilizando el sistema de análisis de video para dilucidar los efectos de un determinado gen en el aprendizaje y la memoria ^41-42 Hemos obtenido un gran conjunto de datos en bruto para más de 5.000 ratones Los datos en bruto que se utilizó para los artículos de investigación publicados ^4-16 se incluyen en el "Ratón Fenotipo Database 'como una base de datos pública (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). El presente artículo película proporciona información detallada acerca de los detalles de nuestro procedimiento experimental y promueve la comprensión de la situación de prueba.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageFZ program	Developed by Tsuyoshi Miyakawa		This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7.
Conditioning chamber	O’Hara & Co., Japan	CL-3002L	For mouse.
Cued test chamber	O’Hara & Co., Japan	CLT-3002L	For mouse.
Interface	O’Hara & Co., Japan	CL-1040	The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program.
Scrambled shock generator	O’Hara & Co., Japan	SGA-2040	The shock generator can be controlled by ImageFZ program.
Shock grid tester (ammeter)	O’Hara & Co., Japan	SG-T
USB video capture device	XLR8	USB2IVOSX
Quad image splitter	Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan	400AS
Soundproof room	O’Hara & Co., Japan	CL-4210
Freeze Monitor	San Diego Instruments, Inc., CA, USA		16 x 16 photbeam array  ( 2.5 cm spacing)