Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

Resumen

Se describe aquí un método para medir directamente las chispas de calcio, las unidades elementales de la liberación de ^{Ca2 +} desde el retículo sarcoplásmico en las fibras musculares esqueléticas intactas. Este método utiliza osmótica estrés mediada por activación de Ca ^{2 +} liberación del receptor de rianodina en fibras musculares aisladas. La dinámica y la capacidad homeostática del ^{Ca2 +} intracelular de señalización pueden emplearse para evaluar la función muscular en la salud y la enfermedad.

Resumen

El mantenimiento de la homeostasis de Ca ⁺ de señalización ² es un proceso fisiológico fundamental en las células vivas. Ca ^{2 +} chispas son las unidades elementales de la Ca ^{2 +} señalización en las fibras musculares estriadas que aparecen como muy localizada Ca ^{2 +} eventos liberación mediada por el receptor de rianodina (RyR) Ca ^{2 +} en libertad canales en el retículo sarcoplásmico (SR) de la membrana. La correcta valoración de los músculos ^de Ca ^{2 +} chispas podrían proporcionar información sobre los intracelulares de Ca ^{2 +} inmuebles manipulación de los músculos estriados sanos y enfermos. Aunque Ca ^{2 +} chispas eventos se observan con frecuencia en los cardiomiocitos de descanso, rara vez se observan en reposo fibras del músculo esquelético, por lo que existe una necesidad de métodos para generar y analizar las chispas en las fibras musculares esqueléticas.

Detallada aquí es un protocolo experimental para la medición de Ca ^{2 +} chispas en digitorm brevis (FDB) fibras musculares aisladas flexores utilizando fluorescent Ca ^{2 +} indicadores y microscopía confocal de barrido láser. En este enfoque, las fibras de FDB aislados están expuestos a estrés hipoosmótica transitorio seguido de un retorno a la solución fisiológica isotónica. En estas condiciones, un robusto Ca ^{2 +} chispas respuesta se detecta adyacente a la membrana del sarcolema en las fibras musculares FDB jóvenes sanos. Alteración del Ca ^{2 +} chispas se detecta respuesta en las fibras musculares esqueléticas distróficas o de edad avanzada. Este enfoque ha demostrado recientemente que la señalización de la membrana delimitado por la participación de la diafonía entre inositol (1,4,5)-trifosfato del receptor (IP ₃ R) y RyR contribuye a Ca ^{2 +} activación chispa en el músculo esquelético. En resumen, nuestros estudios utilizando el estrés osmótico de Ca inducido por ^{2 +} chispas mostraron que esta respuesta intracelular refleja un músculo mecanismo de señalización en la fisiología y envejecimiento / estados de enfermedad, incluyendo modelos de ratón de la distrofia muscular (MDX ratones) o esclerosis lateral amiotrófica (ALS modelo).

Introducción

Intracelular de Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _i) es un mensajero secundario versátil e importante que regula múltiples funciones celulares en las células excitables como las neuronas, cardiaco, esquelético y músculo liso (para revisión ver Stutzmann y Mattson ^1). Regulado Ca ^{2 +} movilización y la diafonía entre retículo sarcoplásmico (SR) y T-túbulos (TT) membranas son reguladores fundamentales de la fisiología del músculo. Además, se han mostrado cambios en Ca ^{2 +} señalización ser un mecanismo subyacente de la disfunción contráctil en varias enfermedades musculares.

Ca ^{2 +} chispas se localizan eventos Ca ^{2 +} liberación elementales procedentes de apertura del receptor de rianodina (RyR) de canal en el retículo sarcoplásmico (SR) de la membrana ^2. En el músculo cardiaco, las chispas se producen de forma espontánea a través de la apertura del canal de RyR2 por una Ca ^{2 +} inducida por Ca ^{2 +} release (CICR) mecanismo de ^3-5. En el músculo esquelético, RyR1 está estrictamente controlado por el sensor de voltaje en la membrana de ^6,7 TT. Así Ca ^{2 +} chispas se suprimen y raramente detectado en condiciones de reposo en las fibras musculares esqueléticas intactas. Hasta hace poco, la membrana del sarcolema necesaria para ser interrumpido por diversos métodos químicos o mecánicos "desollar" para desacoplar la supresión del sensor de voltaje en RyR1 y se dejó para el Ca ^{2 +} provocar eventos a ser detectado en el músculo esquelético ^8,9. Un método descrito anteriormente requiere la permeabilización de la membrana de las fibras musculares por detergente saponina ^10.

En 2003, se descubrió que, o bien el estrés hipoosmótica transitoria o estrés hiperosmótico podrían inducir Ca ^{2 +} chispas periférica adyacente a la membrana del sarcolema de las fibras musculares intactas ^11. Este método ya ha sido modificado para estudiar el mecanismo molecular y la modulación de Ca ^{2 +} Comunicado y la dinámica ^{de 12-16.} Aquí resumimos los detalles de nuestro enfoque experimental para la inducción, la detección y el análisis de Ca ^{2 +} chispas en el músculo esquelético intacto. También presentamos nuestro programa de análisis de chispa a la medida que se puede utilizar para cuantificar las propiedades elementales de los distintos Ca ^{2 +} chispas en el músculo esquelético, por ejemplo, la frecuencia de la chispa y la amplitud (Δ f/f0, que refleja la probabilidad de apertura de los canales RyR y el Ca ^{2 +} carga en el interior del SR), el tiempo hasta el pico (tiempo de subida) y la duración (FDHM, lleno de duración en mitad de la máxima amplitud) de chispas, así como la distribución espacial de Ca ^{2 +} chispas. Además, se presenta evidencia que vincule alterado de Ca ^{2 +} chispas a los diversos estados fisiopatológicos en el músculo esquelético, como la distrofia muscular y la esclerosis lateral amiotrófica.

La ventaja de esta técnica consiste en la capacidad de medir el Ca ^{2 +} en relativamente sin dañoscélulas envejecidas, en vez de pelar las fibras musculares, lo que permite la grabación de Ca ^{2 +} chispas en condiciones más cerca fisiológica. Además, nuestro programa de diseño personalizado proporciona cálculos más precisos de las propiedades de la chispa en relación a las fibras musculares.

Protocolo

1. Configuración de estrés osmótico sistema de perfusión

La figura 1 es un protocolo esquemático de calcio chispas evaluación en las fibras musculares esqueléticas intactas.

1. Establecer un micromanipulador de tres ejes (XYZ), capaz de colocar la punta de salida del sistema de perfusión que contenga un mínimo de dos canales. Esto podría hacerse con desechable barril Luer-jeringa con adjunta tres - forma Luer - Lok llave de paso para encender y / o apagar el flujo de soluciones de perfusión. Estos canales de perfusión debe ser capaz de entregar> 1 ml / min de solución a través de una única punta de la perfusión con un> 0,2 mm de diámetro.
2. Cargar dos canales del sistema de perfusión, uno con solución isotónica de Tyrode y el otro con hipotónica solución de Tyrode.

2. Las fibras Preparación Intacto Individual Flexor digitorum brevis (FDB) musculares de ratón

1. Quite el pie de un eu ratónthanized siguiendo las directrices del NIH y IACUC utilizando unas tijeras de disección pesados ​​cortando a través de la pierna por encima de la articulación del tobillo.
2. Pin el pie en una cámara llena de disección mínima Ca ^{2 +} solución Tyrode con la superficie de la planta hacia arriba.
3. Diseccionar FDB por cortar el tendón y suavemente tirando hacia arriba del tendón para separar el músculo del tejido circundante.
4. Termine la disección cortando el tendón distal donde se bifurca en dígitos individuales en las capas profundas del músculo.
5. Transferir el músculo FDB cogiendo con pinzas a través de sus tendones para evitar daños adicionales a las fibras musculares y colocarlo en un tubo con una alícuota descongelada de colagenasa solución de digestión precalentado a 37 ° C.
6. Incubar el tubo que contiene FDB en posición vertical sobre un agitador orbital a 37 ° C durante 60-90 minutos con una velocidad de 160 rpm. Este protocolo de disociación haces musculares necesita ser examinado experimentalmente para diferentes cepas de animales, Especialmente para aquellas enfermedades / fibras mutantes vulnerables al daño de la membrana.
7. Transferir el digerido FDB en el tubo con 700 l de solución isotónica de Tyrode y se tritura suavemente para liberar las fibras dibujando el músculo varias veces a través de una serie de puntas 200 ml-micropipeta de diámetro que disminuye gradualmente a través de corte con una hoja de afeitar limpia para eliminar las puntas de 200 ml de micropipeta. Para evitar dañar las fibras en los músculos particularmente débiles de la enfermedad, asegúrese de que la punta es lo suficientemente grande como para permitir que el haz de fibras que pasan a través sin que se pegue. No fuerce el paquete a través de una abertura muy pequeña.
8. Placa a cabo las fibras FDB golpeando suavemente y resuspensión fibras FDB en el tubo y luego extrayendo 70 ml (1/10 de las fibras en total) con un ml micropipeta de corte 200 en el centro de una placa de 35 mm Delta TPG que contiene 1 ml de Isotonic solución de Tyrode para reducir la difusión a través de el plato.
9. Determinar el número de fibras individuales intactas en el dish usando un microscopio de disección. Añadir alícuotas adicionales de fibras de FDB para obtener 3-4 fibras intactas en el plato.
10. Almacene las fibras musculares aisladas adicionales a 4 ° C y el uso dentro de 6 horas.

3. Fluo-04 a.m. colorante de carga y Ca ^{2 +} Imaging (Sparks Medición)

1. Transferencia de 500 ml de solución isotónica de Tyrode plato con fibras FDB chapados en un tubo con 10 ml de Fluo-4 AM comprar (1 mM), mezclar y agregar de nuevo al plato para una final de Fluo-04 a.m. concentración de 10 mM. Alternativamente, el ácido plurónico se puede utilizar para aumentar la eficiencia de carga de colorante.
2. Cargue durante 60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
3. Lavar las fibras por dibujo con cuidado 500 ml de Fluo-4 isotónica la solución Tyrode que contenía AM-de la placa con una punta de micropipeta de 200 ml de plástico sin cortar y reemplazar con un volumen igual de solución de Tyrode fresco isotónica.
4. Repita este proceso 3 veces más.
5. Para visualizar la función mitocondrial, la transferencia de 500 ml de Isotonic Tyrode Solución de plato con fibras de FDB en un tubo con 5 ml TMRE acciones (1 mM), mezclar y agregar de nuevo al plato, para una concentración final de 50 nM.
6. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
7. Lavar las fibras dibujando cuidadosamente 500 ml de TMRE contienen solución isotónica Tyrode del plato con un ml punta de la micropipeta sin cortar 200 de plástico y sustituir con igual volumen de solución fresca Tyrode isotónica.
8. Repita este proceso 3 veces más.
9. Transferir el plato para el microscopio confocal y seleccione una fibra intacta con estrías claras y una membrana del sarcolema suave para la experimentación.
10. Coloque la punta del sistema de perfusión de 400-500 m de distancia de la fibra muscular diana y fuera del centro utilizando controles micromanipulador.
11. Comience flujo de la solución de Tyrode isotónica para asegurar la fibra FDB permanece en el lugar.
12. Registre la señal de fluorescencia de Fluo-4 AM con un objetivo de inmersión en aceite de 40X y excitar Fluo-4 AM con unaseñales de láser de argón (longitud de onda de excitación de 488 nm) y emisión récord de longitud de onda (510-580 nm). La intensidad de la señal fluorescente es proporcional al nivel relativo de la concentración intracelular de Ca ^{2 + ([Ca2 +]} _i).
13. Inducir Ca ^{2 +} transitorios por el cambio de la presión osmótica de la solución extracelular con el fin de producir estrés osmótico en fibra. Inicialmente perfundir las fibras con una solución isotónica de Tyrode (290 mOsm) (colección de línea de base durante 60 segundos) y luego con solución hipotónica de Tyrode (170 mOsM) para 100 seg para inducir inflamación. Perfundir las fibras FDB espalda con una solución isotónica Tyrode. Generalmente, sólo un choque osmótico se aplica a una fibra intacta sola en una delta TPG plato y los eventos de chispa último 10 min para la adquisición de datos.
14. Record localización espacial de Ca ^{2 +} chispas (Figura 2) utilizando una serie temporal de xy imágenes en dos dimensiones con una velocidad de barrido de 166 lps (línea por segundo, y ealine ch compuesto por 512 píxeles que resulta en 3,08 seg / frame) para cada condición de isotónica (1 min), el estrés hipotónico (100 segundos) y el estrés post-hipotónica (5 min). Señales para almacenaje de análisis fuera de línea para evaluar la distribución y frecuencia de Ca ^{2 +} chispas tras la finalización del experimento.
15. Encontrar una nueva fibra en un plato nuevo y sigue el mismo protocolo de choque osmótico para inducir Ca ^{2 +} transitorios. Utilice una línea de exploración confocal modo (xt) (512 píxeles de longitud, frecuencia de muestreo de 2 scan ms / línea para grabar Ca ^{2 +} transitorios durante un minuto (es decir, 30.000 líneas) con la línea de exploración confocal colocado directamente debajo de la membrana del sarcolema (Figura 3 ). Cambie la línea de exploración a diferentes planos focales para grabar tres series secuenciales (en intervalos de 1 min) de linescans para el análisis de la magnitud y la cinética de cada Ca ^{2 +} chispas.

4. Análisis de Datos

1. Reunir un gran número deexploración de líneas xt traza para evaluar la morfología y cinética del Ca ^{2 +} parámetros chispas individuales, es decir, la amplitud (F / F _0, donde F ₀ es el reposo Ca ^{2 +} fluorescencia), tiempo de subida, tiempo al pico, duración (FDHM , lleno de duración en media magnitud), y la anchura del espacio (FWHM, ancho a la mitad de magnitud) de las chispas grabados. Estos parámetros representan las propiedades gating básicos de RYR Ca ^{2 +} canales tales como el Ca ^{2 +} flujo (amplitud), y la cinética de activación periódica de RyRs (duración).
2. Analizar los datos de imágenes digitales con un algoritmo semiautomático a medida desarrollado que fue creado con el lenguaje de procesamiento de imágenes IDL (Interactive Data Language), como se describió anteriormente ^11,16. Debido a la cinética únicas de Ca ^{2 +} liberan en el caso de Ca ^{2 +} chispas inducidas en las fibras de FDB por estrés osmótico, es mejor combinar las funciones manuales y automatizados de Ca ^{2 +} provocar eventosla identificación y el procesamiento de estos programas de análisis de imagen personalizada a la generación ^11. Este algoritmo es muy útil cuando es necesario identificar manualmente ROI (región de interés) en algunos modelos de enfermedad muscular. Una vez que se define un retorno de la inversión, el algoritmo podría derivar automáticamente los parámetros de chispa antes mencionadas que podrían luego ser exportados a un archivo Excel. Alternativamente, el software de procesamiento de imagen disponible pública, por ejemplo SparkMaster en ImageJ, se puede utilizar para definir las propiedades cinéticas de Ca ^{2 +} chispas y su distribución espacial en el músculo esquelético ^17.

Resultados

Estudios anteriores mostraron que el estrés hipoosmótica transitoria inducida Ca periférica ^{2 +} chispas adyacente a la membrana del sarcolema en las fibras musculares intactas ^11. Figura 1 muestra las imágenes de las fibras musculares individuales intactas con la membrana del sarcolema suave y estrías claras característicos. Figura 2 muestra típica de Ca ^{2 +} chispas (como imágenes xy) se indujeron por tratamiento transitorio (100 seg) co...

Discusión

Este método de evaluación de Ca ^{2 +} chispas en el músculo esquelético intacto es una herramienta útil para la fisiología muscular y la investigación de la enfermedad. Hemos demostrado que la respuesta de Ca ^{2 +} chispa fue alterada en diferentes condiciones, incluyendo la distrofia muscular ^11, el envejecimiento ^{18, _19,} así como en la esclerosis lateral amiotrófica ^20. Nuestro reciente estudio también reveló acoplamiento funcional entre la PI

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation