Single-plantas, Microcosmos estériles para nodulación y el crecimiento de la planta de la legumbre<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Con el Rhizobial Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Resumen

Crecimiento de las plantas de Medicago truncatula en simbiosis con las bacterias que fijan el nitrógeno Sinorhizobium meliloti, en microcosmos estériles individuales a partir de placas estándar de laboratorio permite el examen frecuente de sistemas de raíces y nódulos sin comprometer la esterilidad. Las plantas pueden ser mantenidas en estas cámaras de crecimiento de hasta 9 semanas.

Resumen

Rizobios forman nódulos simbióticos, que fijan el nitrógeno en las raíces de plantas leguminosas huésped compatibles. Uno de los sistemas modelo más bien desarrollados para el estudio de estas interacciones es la planta Medicago truncatula cv. Jemalong A17 y la bacteria rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021. Proyección de imagen repetida de raíces de las plantas y de puntuación de fenotipos simbióticas requiere métodos que son no destructivos para plantas o bacterias. Los fenotipos simbióticas de alguna planta y los mutantes de bacterias se hacen evidentes después de períodos relativamente cortos de crecimiento, y no requieren de la observación a largo plazo de la interacción huésped / simbionte. Sin embargo, las diferencias sutiles en la eficiencia y la senescencia nódulo fenotipos simbióticas que no son aparentes en las primeras etapas del proceso de nodulación requieren períodos de crecimiento relativamente largos antes de que puedan ser marcados. Varios métodos han sido desarrollados para el crecimiento y la observación de este par huésped / simbionte a largo plazo.Sin embargo, muchos de estos métodos requieren riego repetida, lo que aumenta la posibilidad de contaminación por otros microbios. Otros métodos requieren un espacio relativamente grande para el crecimiento de un gran número de plantas. El método descrito aquí, el crecimiento simbiótica de M. truncatula / S. meliloti, en microcosmos de una sola planta estéril, tiene varias ventajas. Las plantas en estos microcosmos tienen humedad y los nutrientes suficientes para garantizar que el riego no se requiere para hasta 9 semanas, evitando la contaminación cruzada durante el riego. Esto permite que los fenotipos que se deben cuantificar que pueden perderse en los sistemas de crecimiento a corto plazo, tales como retrasos sutiles en el desarrollo de nódulos y la senescencia nódulo temprano. Además, las raíces y nódulos en el microcosmos se ven fácilmente a través de la tapa de la placa, por lo que no se requiere up-enraizamiento de las plantas para la observación.

Introducción

La interacción entre la planta huésped leguminosa Medicago truncatula A17 y la bacteria rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021 es uno de los sistemas modelo más manejables para el estudio del desarrollo de nódulos de la raíz y la simbiosis fijadora de nitrógeno. Los genomas de ambos socios simbióticas se han secuenciado ^1,2 y tanto la planta y bacteria son susceptibles de ^3,4 manipulación genética. El análisis de los fenotipos de ambas plantas y mutantes bacterianas requiere la capacidad de observar las etapas del desarrollo de nódulos y para cuantificar la productividad simbiótica con el tiempo. Aquí se describe un método para la observación del desarrollo de nódulos de la raíz de M. truncatula cv. Jemalong A17 inoculados con S. meliloti 1021 dentro de microcosmos individuales hechas de estándar, redondo 100 mm de diámetro, 15 mm placas de laboratorio profundas (Figura 1A). El rodaje está expuesto y crece a través de un portal de muescas en el lado de la placa (FigurES 1B, 1C, y 1E). Las raíces están contenidos dentro de los microcosmos y mantenerse estéril, al tiempo que permite la observación a través de la tapa de la placa (Figura 1D). Desde el rodaje es accesible, su crecimiento no está limitado y se puede medir a intervalos periódicos sin comprometer la esterilidad de la raíz. El método de creación de microcosmos-de la placa con muescas fue desarrollado originalmente por Leigh, et ​​al. ⁵ para el cultivo de plantas de alfalfa, pero no fue ampliamente adoptado a pesar de sus muchas ventajas sobre otros métodos. Una variación de este método también fue desarrollado para el análisis de la interacción entre raíces de las plantas y las micorrizas ^6. Ahora hemos adaptado y optimizado este método para el crecimiento de M. plantas truncatula. Las ventajas de este protocolo más utilizado más comúnmente métodos se describen a continuación.

Hay varios métodos que están actualmente en uso amplio para los estudios de nodulación de M. truncatula inoculaciónLated con S. meliloti ^7. El método más comúnmente utilizado para la preparación a gran escala de las raíces noduladas es el crecimiento en cajones aeropónicos ^7. En este método, las plantas se suspenden en un recipiente grande y las raíces se aireó con una mezcla de S. meliloti y solución nutriente ^7. Este método es práctico si sólo un genotipo de S. meliloti es hacerse la prueba. Ya que requiere la aerosolización de altas concentraciones de bacterias, hay una alta probabilidad de contaminación cruzada entre cajones inoculados con diferentes cepas bacterianas. Otro método que se utiliza a menudo para preparar grandes cantidades de plantas inoculadas es el crecimiento en las tinas o recipientes de perlita, vermiculita, arena o arcilla calcinada que se infunde con solución nutritiva y se inoculó con S. meliloti ^7. Este método requiere el uso de bañeras o macetas abiertas, y requiere de riego y la reposición de la solución de nutrientes. Otra desventaja de macetas es que las plantasdebe ser eliminado de esta matriz de partículas para el examen de las raíces y nódulos. Otro inconveniente de este método es que se requiere una gran área de espacio de la incubadora cuando muchos diferente S. genotipos meliloti se han de comparar, debido a una olla separada debe ser utilizado para cada genotipo bacteriano. El "tarro Leonard" es una variación de este método ^8,9. Un tarro de Leonard se compone de dos vasos esterilizados apiladas una encima de la otra y conectadas por una mecha. El medio de crecimiento se coloca en el recipiente inferior y arrastrado a través de la mecha por acción capilar en una matriz de crecimiento de perlita, vermiculita, arena o arcilla calcinada en el recipiente superior. La plántula (s) se colocan en la matriz de crecimiento y se inoculó con S. meliloti. Este método no requiere de riego, pero el examen de las raíces y nódulos requiere que la plántula se retira de la matriz de crecimiento de partículas.

Hay varios métodos que permiten la fácil exploración de roots. Uno de ellos es la "bolsa de crecimiento" de plástico transparente ^7. Una desventaja de este método es que se requiere el riego frecuente ya que sólo ≤ 10 ml de medio líquido es óptima para el cultivo de M. truncatula en bolsas de ^7. Experimentos bolsa también se limitan generalmente a ~ 2 semanas ^7, debido a la ruptura de la mecha de papel dentro de la bolsa. Otros dos métodos que se utilizan comúnmente son similares a nuestro método en el que las plantas se cultivan en agar y las raíces son visibles, pero estos métodos también tienen desventajas que nuestro procedimiento evita. En estos métodos, las plantas están completamente contenidos dentro de 24.5 cm x 24.5 cm de placas de agar sellados alrededor de la parte superior con cinta quirúrgica porosa o cultivadas en tubos de agar inclinado con tapón con tapones de algodón o tapas de plástico ^7. Ambos de estos métodos permiten fácil examen de las raíces y se puede mantener estéril. Sin embargo, los tubos inclinados de agar se crecen generalmente con sólo 20 ml de agar de medio ⁷ y requieren de riego y de nutrientes de unaddition para el crecimiento a largo plazo de las plantas. Las plantas que crecen dentro de los 24.5 cm x 24.5 cm de agar microcosmos placas tienen humedad y nutrientes para el crecimiento a largo plazo suficiente, pero el rodaje creciendo rápidamente se convierte constreñidos dentro del microcosmos placa cerrada y el gas etileno pueden acumularse inhibición de la nodulación ^7. En el procedimiento que se describe aquí, la sesión se expone y crece libremente fuera del microcosmos que contiene ~ 70 ml de los medios de comunicación, lo que permite el crecimiento a largo plazo.

El procedimiento descrito aquí puede ser útil no sólo para el estudio de la nodulación de plantas leguminosas, pero también para el estudio de los fenotipos de las raíces de otras plantas de tamaño medio. La diferencia entre estos microcosmos y una planta de policarbonato de cultivo de tejidos tarro tradicional es que las raíces en los microcosmos de la placa descritas aquí crecen en la superficie vertical del agar en lugar de hacia abajo en una capa horizontal de agar en la parte inferior de la jarra. Esto permite que la raíz que se despegó de la superficie de agar con un mínimo de dAmage a pelos de la raíz y una adhesión mínima de agar a la superficie de la raíz, lo que facilita el examen de los pelos radicales por microscopía.

Protocolo

Realizar los pasos se recomienda 1, 2, 4, y 6 en una campana de flujo laminar estéril.

1. Preparación de M. truncatula A17 plántulas

Nota: M. truncatula A17 semillas utilizadas en estos estudios se producen bajo condiciones de invernadero se enfría a ~ 22 ° C, o en una sala de crecimiento de la planta se mantiene a 22-26 ° C con ~ 150-400 mmol / m ^-2 s ^-1 luz.

1. Vierta placas de germinación de semillas: Utilice 100 mm placas cuadradas (15 mm de profundidad) y se vierte en autoclave 1.1 a 1.2% w / v purificado agar ¹⁰ a una profundidad de 3-5 mm. Cada placa se utiliza para germinar ~ 0.25-0.5 g de semillas (equivalente a 63-125 semillas / placa).
   Nota: Es importante utilizar células de cultivo probados, agar purificado planta para todos los platos descritos en este protocolo. El proveedor y la información del número de catálogo para el agar se listan en la Tabla de Reactivos y equipos específicos.
2. Escarifique / esterilizar el M. truncatula A17 semillas: Pesar las semillas suficientes para el número deseado de plántulas. (M. truncatula A17 semillas son ~ 4 mg cada uno) Coloque las semillas en frascos estériles de 125 ml con cubiertas de papel de aluminio estériles (0,25-0,5 g de semillas / matraz, lo que es de ~ 63-125 semillas) y la pipeta 20 ml de concentrado (96%) H ₂ SO ₄ a lo largo de los lados del matraz.
   Nota: escarificación ácida esteriliza las semillas. También, pipeteando el ácido a lo largo de los lados del matraz, que se vuelva a esterilizar el interior del matraz de que haya entrado en contacto con las semillas no esterilizadas.
3. Romper los grumos de semilla con una pipeta de vidrio estéril. Agitar cada matraz con frecuencia para 10-12 min. Las pequeñas, hoyos marrones se harán visibles en las semillas. Estos son pequeños agujeros en la capa de ¹¹ semillas.
   Nota: Use protección para los ojos y guantes cuando se trabaja con H ₂ SO ₄ concentrado.
4. Retire H ₂ SO ₄ y enjuagar las semillas: Cuando al menos el 10% de las semillas tienen pequeños hoyos marrones, o 12 minutos han pasado, el que seaes lo primero, eliminar todo el ácido de los frascos con una pipeta de vidrio estéril. (Lugar ácido residual en un vaso de precipitados de 1-2 l que contiene al menos 300 ml de agua del grifo. Esto diluir el ácido y evitar el sobrecalentamiento.) Incline el matraz para recoger el ácido que queda en la curva del matraz y el uso de una pequeña pipeta de vidrio a eliminar todo el ácido restante. Si el ácido residual permanece, es el que reacciona con el agua de enjuague, calentar las semillas y los matará.
   1. Enjuague semillas vertiendo rápidamente 100 ml de agua ultrapura estéril en cada matraz. El exceso de volumen de agua va a diluir el ácido y evitar daños sobrecalentamiento y la semilla durante la reacción del ácido con el agua. Verter el agua y la llama-esterilizar el labio del matraz.
   2. Enjuague semillas 8-10x con 50 ml de agua ultrapura estéril. Agitar el matraz durante cada enjuague. El matraz se debe considerar estéril en este punto y el labio del matraz se debe flameado antes de cada enjuague.
5. Deje que las semillas se empapan durante la noche: Después de laúltimo aclarado, verter 50 ml de agua ultrapura estéril en cada frasco, vuelva a colocar la cubierta de aluminio estéril en cada frasco y a 4 ° C en la oscuridad durante la noche.
6. Coloque las semillas en un plato de germinación: Después de dejar que las semillas se empapan durante la noche, verter el agua, lavar 2 veces con ~ 25 ml de agua ultrapura, a continuación, añadir 20 ml de agua ultrapura estéril, remolino para volver a suspender las semillas y las vierte sobre una placa de agar germinación 1.1 a 1.2% a partir de paso 1.1. Si las semillas se mantienen en el matraz, añadir más agua y se vierte de nuevo. Distribuya las semillas de cada matraz a una placa (63 a 125 semillas / placa).
   1. Agite la placa para distribuir las semillas. Las semillas deben ser distribuidos de manera uniforme en una banda de 4-5 cm en un extremo de la placa. Este será el "top" de la placa. El "fondo" de 5-6 cm debe mantenerse libre de las semillas (Figura 2A).
   2. Extraiga el agua con una pipeta estéril. Inclinar la placa en un ángulo de 45 ° para que la fuga de agua restante a la parte inferior de la placa. Vuelva a colocar la tapa en el tilplaca ted y protegerlo de la luz. Las placas se debe permitir que drene 10-20 min. (Figura 2B).
7. Configure la germinación: Retire toda el agua que se ha acumulado en la parte inferior de la placa inclinada con una pipeta estéril.
   1. Vuelva a colocar la tapa y selle la placa con parafilm. Use guantes y mantenga estéril (Figura 2 C).
   2. Pila de las placas de germinación y luego girar a todos ellos en un ángulo de 90 °. Las semillas serán tirados en la superficie vertical del agar. Semillas totalmente embebidas deben adherirse fácilmente al agar. Las raíces crecen hacia abajo (Figura 2D).
   3. Enrolle la pila de placas de germinación en papel de aluminio para bloquear la luz y mantener a 25 º C durante 3 días.

Nota: Si germinación ingresos por menos de 3 días, las raíces pueden ser demasiado corto para alcanzar el agar en microcosmos. Si la germinación procede más de 4 días antes de la transferencia a las placas de microcosmos, la supervivencia de las plántulas seser pobre. Si M. ecotipos truncatula o mutantes con tasas de germinación más lentas se han de comparar, el ecotipo lentamente-germinación se debe permitir a germinar más de 3 días.

2. Preparación de Microcosmos por placa

1. Preparar medio ¹² (véase la Tabla 1 para la composición), permitiendo ~ 70 ml de medio de Jensen para cada microcosmos. Preparar en jarras o frascos que sean convenientes para vertido rápido (no más de 1 a 2 litros por lanzador) y dejar una barra de agitación magnética en la jarra durante la esterilización en autoclave.
   1. Después de medio se ha enfriado hasta ~ 55-65 ° C, se han añadido suplementos, y el pH se ha comprobado (ver Tabla 1), se vierte en ronda de diámetro 100 mm, 15 mm platos hondos. Las placas se deben verter ~ 0,9-1 cm de profundidad (~ 70 ml / placa).
   2. Los componentes del medio de Jensen pueden formar un precipitado turbio, por lo que es importante devolver la jarra a la placa de agitación magnética periódicamente para evitar que los componentes se sedimente. Los precipitados pueden ser vispatible en la placa después de que se solidifican, y no afectan el rendimiento siempre y cuando se distribuyen de manera uniforme entre las placas.
   3. Pila de placas durante la colada para evitar la formación de condensación en las tapas de placas.
2. Después de placas de Jensen han solidificado, muescas en ambas placas y tapas con una espátula de pesaje que se ha doblado en forma de U ⁵ (Figura 3A). Calentar la curvatura de la espátula con un quemador hasta rojos calientes, muesca 5-6 platos y luego calentar de nuevo. Cuando la tapa con muescas se coloca en la placa con muescas, esto creará un portal de ovalada a través del cual el rodaje de la plántula crecerá (Figura 3B). Si las placas con muescas se van a almacenar, envuelva individualmente con una película de parafina ..

3. Preparación de Sinorhizobium meliloti Culturas

Dos días antes de la inoculación de las plantas, inicie culturas de todos los S. meliloti cepas para ser inoculados en plántulas. Cultures deben ser cultivadas en LBMC (Luria-Bertani [Miller]) medio ¹³ suplementado con 2,5 mM MgSO _4, 2,5 mM CaCl _2, y los antibióticos apropiados (medio TY también funciona bien). Tan poco como 2-3 ml de cada cultivo serán suficientes.

1. Crecer a 30 ° C con agitación durante 2 días hasta que las células son densos.
2. Para la mayoría de las inoculaciones de plantas, la fase de crecimiento de la S. meliloti no es crítica. Por lo general, a finales de registro o se utilizan células en fase estacionaria temprana.

4. Maquetación de M. truncatula plántulas en Microcosmos individuales

1. Después de 3 días, abra una placa de germinación (preparado en el paso 1) y la inundación de inmediato con agua ultrapura estéril. Dip fórceps en etanol y brevemente la llama de esterilizar. Utilice pinzas estériles para empujar suavemente las puntas de las raíces de todas las plantas bajo el agua para evitar que se sequen. Las raíces variar de 2-6 cm de largo. La mayoría será de 3-4 cm. Seleccione plántulas con raíces rectas y no obviadefectos.
2. Compruebe las tapas de los microcosmos medianas del Jensen para la acumulación de condensación. Flick de la tapa para quitar la condensación o sustituirla por una nueva tapa con muesca. Si hay un exceso de condensación en la tapa, la raíz de plántulas puede adherirse a la tapa y luego se seca mueren después de la condensación.
3. Usando las pinzas, pick suavemente una planta de semillero de la placa de la germinación de los cotiledones y se echó la raíz en un medio microcosmos de un Jensen. Asegúrese de que la punta de la raíz está en contacto con el agar.
4. Retire con cuidado la cubierta de la semilla si todavía está presente. Las cubiertas de las semillas deben estar sueltos después de la inmersión en agua durante 5-10 min. Suavemente se burlan de la cubierta de la semilla con las pinzas hasta que cede el paso, y deseche. Los cotiledones y aproximadamente 0,5 cm de rodaje deben sobresalir fuera de la U-muesca en la placa (Figura 4). Vuelva a colocar cuidadosamente la tapa de la placa con el U-muesca de la tapa sobre la planta de semillero, la creación de un portal para la plántula (Figura 4B).Establecer placas de lado en pilas horizontales hasta que todas las plantas de semillero se han colocado en el microcosmos.
5. Utilice todas las plántulas de cada placa de germinación que mirar viables y tienen una raíz recta. (Si es posible, deje un plato de plántulas sin abrir a utilizar como sustitutos de plántulas marchitas justo antes de la inoculación.)
6. Después de exponer todas las plántulas, les permite sentarse en el microcosmos de la Jensen horizontal mientras que el S. Se están preparando suspensiones de inóculo meliloti.

5. Preparación de S. meliloti inóculo Suspensiones

1. Compruebe S. meliloti culturas periódicamente después de la inoculación para asegurarse de que están creciendo. Después de un crecimiento de 2 días, el OD ₆₀₀ debe estar entre 2 y 4.
2. Pipetear 0,5 ml de cada cultivo en un tubo estéril de 1,5 ml y centrifugar para sedimentar. Aspirar el sobrenadante.
3. Lavar las células dos veces en cualquiera de 0,85% de agua estéril ultrapura NaCl o estéril. Resuspender las células en 0,5 ml de 0,85% Stesacar de quicio NaCl o agua ultrapura.
4. Medir el diámetro exterior ₆₀₀ de una dilución 1/10 de resuspendieron S. meliloti culturas desde el paso 5.3. En base a esta lectura, hacer una suspensión de cada cultura en agua ultrapura estéril a OD ₆₀₀ = 0,05. Si la densidad celular es demasiado alta, la nodulación puede ser inhibida. Hacer lo suficiente de la suspensión diluida de manera que 100 l pueden ser inoculadas en cada plántula. La turbidez del OD ₆₀₀ = 0,05 suspensión debe ser apenas perceptible a simple vista.

6. Inoculación y Sellado de Microcosmos

1. Inmediatamente antes de que comiencen las inoculaciones, compruebe plántulas marchitas que no han sobrevivido a la transferencia al microcosmos medianas del Jensen. Vuelva a colocar los plantones con plantas frescas de placas de germinación.
2. Abra cada microcosmos e inocular 100 l de la S. apropiada meliloti suspensión sobre la raíz de plántulas. Vuelva a colocar la tapa y dejar de lado en stac horizontalks de 6-10 microcosmos. Para cada S. cepa meliloti a comparar, inocular al menos 15 plantas. Para las cepas que tienen sutiles diferencias en la productividad simbiótica, inocular 30-35 plantas. Deje por lo menos 10 plantas sin inocular como control negativo. Se inoculan las plantas con 30-35 S. meliloti 1021 u otra cepa de tipo salvaje apropiada para servir como control positivo.
3. Después de la S. suspensión meliloti ha tenido tiempo para adsorberse sobre la superficie de la raíz y el líquido de suspensión ha empapado en el agar (al menos 20 min.), envolver cada placa individualmente con película de parafina. Las placas deben ser envueltos hasta el borde mismo de la categoría, pero la película de parafina no deben bloquear el crecimiento de las plántulas (Figura 4C).
4. En el momento de envolver, hacer una comprobación final para las raíces adheridas al interior de la tapa de placa. Para quitar las raíces adheridas de la tapa, coloque la placa plana en el banco y puntear o chasquear la tapa para golpear la raíz hacia abajo sobre el agar dorface.
5. Alinee los portales de plántulas de cada pila de 6-10 platos. Coloque la pila en un ángulo de 90 º con las plantas de semillero apuntando hacia arriba (Figura 4D). La adherencia de la película de parafina sostendrá las placas en su lugar el tiempo suficiente para envolver toda la pila de papel de aluminio, dejando una franja de 1-2 cm desenvuelto cuando las plántulas emergen (Figura 4E). La lámina protege las raíces de la luz.
6. Coloque las pilas de papel de aluminio envuelto en una cámara de crecimiento con luz o cámara de crecimiento a 21-25 ° C, humedad relativa de 60-70% y 100-175 mmol / m ^-2 s ^-1 luz sobre un oscuro ciclo de 16 horas de luz / 8 h ( Figura 1A). Bajo estas condiciones de crecimiento, la incubación prolongada a niveles de luz mayor que 200 mol / m ^-2 s ^-1 puede tener un efecto perjudicial sobre el crecimiento de la planta.

7. El examen de los sistemas de raíces y cuantificación de fenotipos simbióticos

Las plantas pueden ser mantenidos enmicrocosmos de hasta 9 semanas.

1. Número de nódulos se puede cuantificar en una serie de puntos de tiempo por desenvolver la hoja de cada pila y contando nódulos. El desarrollo de nódulos en plantas inoculadas con S. meliloti 1021 tipo salvaje son evidentes por 10 a 14 días después de la inoculación.
2. La productividad simbióticos también se puede medir en cada punto de tiempo mediante la medición de la longitud de la rama emergente.
3. Cuantificación final de la productividad simbiótica se realiza generalmente a las 7 semanas después de la inoculación y desconecta el rodaje y la medición del peso fresco de la rama. Este paso puede realizarse tan tarde como 9 semanas si se desea crecimiento a más largo.

Resultados

La preparación e inoculación de estos microcosmos placa es relativamente simple en comparación con la mayoría de los otros métodos descritos en la Introducción. El uso de estos microcosmos también permite el crecimiento de plantas prolongado (hasta 9 semanas) sin riego o la suplementación de nutrientes, el mantenimiento de la esterilidad de la raíz, a la vez fácil exploración de las raíces y la protección de las raíces de la luz, el crecimiento sin restricciones de planta con brotes, fácil acceso a la ses...

Discusión

Hay varios pasos del protocolo que son críticos para el éxito: 1) La necesidad de utilizar, planta de cultivo celular purificada probado agar no se puede exagerar. Esto no es crítico para las plántulas de alfalfa, pero es crítico para el crecimiento de M. truncatula A17. 2) Es importante para germinar las plantas de semillero en placas de agar verticales como se describe en el Paso 1. La técnica ampliamente utilizada de la germinación de plántulas en una superficie horizontal invertida en un plato hondo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar purified, plant cell culture-tested	Sigma	A7921