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Resumen

Las isoenzimas de la lipooxigenasa (LOX) pueden generar los productos que pueden aumentar o disminuir la neuroinflamación y el neurodegeneration. Un estudio de la interacción gen-ambiente podría identificar efectos isoenzima-específicos de LOX. Usando el modelo 1 methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) del daño nigrostriatal en dos líneas transgénicas isozyme-deficientes de LOX permite la comparación de la contribución de isozymes de LOX en integridad y la inflamación dopaminérgicas.

Resumen

La actividad de la lipooxigenasa (LOX) se ha implicado en desordenes neurodegenerative tales como enfermedad de Alzheimer, pero sus efectos en patogenesia de la enfermedad de Parkinson (paladio) se entienden menos. Los modelos de interacción gen-ambiente tienen utilidad para desenmascarar el impacto de vías celulares específicas en la toxicidad que no se pueden observar utilizando solo un modelo de enfermedad genética o tóxica. Para evaluar si las isoenzimas distintas de LOX contribuyen selectivamente a la neurodegeneración relacionada con la EP, los ratones transgénicos(es decir, 5-LOX y 12/15-LOX deficientes) pueden ser desafiados con una toxina que imite la lesión celular y la muerte en el trastorno. Aquí describimos el uso de una neurotoxina, 1 methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), que produce una lesión nigrostriatal para aclarar las contribuciones distintas de las isoenzimas de LOX al neurodegeneration relacionado con el paladio. El uso de MPTP en ratón, y primate no humano, está bien establecido para recapitular el daño nigroestriatal en la EP. El grado de lesión MPTP-inducido es medido por el análisis de la CLAR de la dopamina y de sus metabilitos y el análisis semicuantitativo de la mancha blanca /negra occidental del striatum para la hidroxilasa de la tirosina (TH), la enzima tarifa-limitadora para la síntesis de la dopamina. Para evaluar los marcadores inflamatorios, que pueden demostrar sensibilidad isoenzima-selectiva de LOX, la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP) y el immunohistochemistry Iba-1 se realizan en las secciones del cerebro que contienen nigra del substantia, y el análisis occidental de la mancha blanca /negra de GFAP se realiza en homogenados estriados. Este enfoque experimental puede proporcionar nuevos conocimientos sobre las interacciones gen-ambiente subyacentes a la degeneración nigroestriatal y la EP.

Introducción

El uso de modelos de interacción gen-ambiente proporciona un enfoque para imitar los factores de riesgo que probablemente influyen en la enfermedad de Parkinson (EP) idiopática y ofrece la oportunidad de discernir conocimientos mecanicistas que es poco probable que se dilucidan mediante el uso de un sistema genético o tóxico solo1,2. Aquí ilustramos este punto y describimos la aplicación de la 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) modelo de ratón de la degeneración nigroestriatal3 para comprender mejor la selectividad de la actividad de la isoenzima lipooxigenasa (LOX) en la neuroinflamación y toxicidad4. Mientras que un papel de las isoenzimas LOX ha sido ampliamente evaluado en trastornos periféricos5,6, así como la enfermedad del SNC, incluyendo el accidente cerebrovascular7 y la enfermedad de Alzheimer8,9,el papel de la familia de isoenzimas en la función nigroestriatal y la degeneración relacionada con la EP no se entiende bien y justifica el estudio. La neurotoxina MPTP demuestra la degeneración preferencial del camino nigrostriatal y recapitula el agotamiento estriado de la dopamina y la pérdida dopaminérgica nigral de la célula que es la base de debilitaciones motoras en pacientes delpaladio 10. Si bien este modelo no reproduce el cuadro completo de comportamientos de EP no motora y motora y la patología corporal de Lewy franca α-sinucleína positiva, ha sido útil para dilucidar nuevas dianas mecanicistas que contribuyen al daño nigroestriatal y para las pruebas de traslación en etapa temprana, ya que es el modelo no invasivo mejor caracterizado disponible para producir de manera confiable la muerte celular nigral acompañada de pérdida de dopamina estriatal11-15. El amplio uso del ratón MPTP, con paradigmas que van desde agudo, subagudo hasta crónico16-18,ha permitido estandarizar la dosificación para dar lugar a daños nigroestriatales leves a severos19,20 con activación de diferentes mecanismos de toxicidad dependiendo del régimen de tratamiento18,21,22. En consecuencia, esto permite que se dirija una "ventana de lesión" que puede resultar en una lesión nigroestriatal mejorada o reducida dependiendo del agente terapéutico o modelo transgénico utilizado23-25.

También son esenciales para los estudios de biología traslacional y de descubrimiento las técnicas utilizadas para evaluar el daño y la evidencia que proporcionan estos métodos. Para el modelo de ratón MPTP, las métricas establecidas para evaluar las lesiones son la medición de marcadores de tono dopaminérgico estriado, incluyendo la dopamina y sus metabolitos por HPLC, y el análisis de Western blot de tirosina hidroxilasa (TH), la enzima limitadora de la tasa en la síntesis de dopamina, e indicadores de eventos degenerativos como la activación glial mediante el análisis de Western blot e inmunohistoquímica4. Aunque éstos sean procedimientos neuroquímicos, bioquímicos, e histológicos clásicos, las técnicas proporcionan lecturas críticas y reproducibles en el grado del daño dentro del camino dopaminérgico nigrostriatal, indican mecanismos de la toxicidad, y han demostrado ser herramientas valiosas en la comprensión de eventos degenerativos en el paladio.

Protocolo

Nota: Todos los procedimientos y métodos de cuidado de animales deben ser aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la institución. El estudio aquí descrito se realizó de acuerdo con las directrices establecidas por el IACUC de SRI International.

1. Adquisición y mantenimiento de ratones deficientes en LOX

  1. Compre ratones deficientes en 5-LOX o 12/15-LOX deficientes y controles respectivos de cepas y sexos a la edad de 7-8 semanas y permita varios días para la aclimatación a las instalaciones después de la llegada.
  2. Mantenga a los ratones en la vivienda del grupo en un ciclo claro-oscuro de 12 h y dé el alimento y el agua potable ad libitum.

2. Precauciones MPTP, almacenamiento, preparación, descontaminación y eliminación

Nota: Se ha demostrado que la intoxicación por MPTP por exposición intravenosa en humanos causa parkinsonismo10; Mptp es altamente lipofílico y puede cruzar fácilmente la barrera hematoencefálica26. Deben adoptarse medidas de precaución para garantizar una manipulación, desintoxicación y eliminación seguras. Su metabolismo implica múltiples pasos incluyendo la conversión a 1-metil-4-fenil-2,3-dihidropiridinio por la enzima monoaminooxidasa B (MAO-B)27. Los inhibidores de la MAO-B se pueden utilizar en caso de intoxicación humana accidental.

  1. Asegúrese de que el personal tenga el entrenamiento apropiado de la seguridad y de la dirección antes de utilizar MPTP según lo dictado por el comité de la salud y de la seguridad de la institución. Cada institución puede establecer e implementar sus propios procedimientos operativos estándar para el uso del MPTP, sobre la base de las recomendaciones ampliamente esbozadas en la literatura17,22.
  2. Antes de la preparación, póngase el equipo de protección personal (EPP) apropiado, incluidos los siguientes: bata de laboratorio desechable o traje de cuerpo completo, guantes de nitrilo doble, máscara quirúrgica, cubierta para el cabello, gafas de seguridad y fundas de zapatos desechables. El EPP adecuado debe usarse durante la preparación del MPTP, el paradigma de la inyección y 72 h después de la inyección cuando se manipulan animales y / o ropa de cama.
  3. Realice los cálculos antes de la preparación. Se deben seguir las directrices institucionales para la dosificación de volúmenes; la entrega de 100-150 μl se utiliza típicamente para ratones de 25-30 g.
    1. Para preparar una solución de MPTP de 3 mg/ml en solución salina, aplique un factor de corrección (1.211 MPTP-HCl: 1.0 MPTP base libre); la concentración de MPTP-HCl en vehículos salinos es de 3,633 mg/ml.
    2. Prepare todo el equipo, las fuentes y los reactivos necesarios para la preparación de MPTP y la descontaminación potencial del derrame antes de manejar la neurotoxina.
  4. Retire el vial de origen MPTP-HCl de la ubicación de almacenamiento adecuada.
    Nota: Mptp debe mantenerse en RT en un vial cerrado dentro de un contenedor secundario, y almacenado dentro de un gabinete bloqueado, etiquetado "MPTP".Note: MPTP should be maintained at RT in a closed vial within a secondary container, and stored within a locked cabinet, labeled "MPTP. "
    1. Cubra el área que rodea las escamas con almohadillas o toallas de papel humedecidas con una solución de lejía al 10% para reducir el riesgo de polvo derramado. Mantenga los tejidos y la solución de lejía al 10% cerca como precaución.
    2. Utilizando una balanza analítica ubicada en una campana extractora de humos, pesar 50 mg de MPTP-HCl en un vial de vidrio con contención secundaria que contiene un 10% de tejido empapado en lejía. Etiquete el vial de vidrio "MPTP" con concentración y fecha.
    3. Cierre el vial de origen y limpie el exterior con blanqueador al 10%.
  5. Añadir lentamente 13.763 ml de solución salina estéril al vial y cerrar completamente para mezclar. (La solución es 3.633mg/ml MPTP-HCl.)
    1. En la campana, esterilice cuidadosamente la solución MPTP por filtración utilizando un filtro de 0,22 μm en un vial de inyección etiquetado dentro de un recipiente secundario con 10% de tejido empapado en lejía. Limpie cualquier derrame con tejido empapado de lejía.
    2. Deseche cuidadosamente los objetos punzantes y el vial en un recipiente de riesgo biológico debidamente etiquetado. Mantenga la solución mptp en el frasco en el envase secundario con el tejido blanqueo-empapado para el transporte a la sala animal del procedimiento.
      Nota: no autoclave solución MPTP para la esterilización, ya que su vaporización es un peligro de inhalación.
  6. Devuelva el vial de origen MPTP a su contenedor secundario y colótese en el lugar de almacenamiento. Descontaminar la espátula, la escala analítica y la superficie de la campana durante 10 min utilizando blanqueador al 10%.

3. Administración de MPTP

  1. Prepare jaulas desechables con tapas perforadas microisoladoras estándar que contengan revestimientos filtrados de poliéster marcados como "MPTP" (menos parrilla de alimentos de alambre), revestimientos de jaulas desechables, pellets de alimentos pre-húmedos e hidrogel como fuente de agua. Pesar todos los animales y registrar un volumen de 3 mg/ml de MPTP en solución salina necesaria para la inyección de 15 mg/kg.
    Nota: Los metabolitos mptp son detectables en los excrementos durante 3 días después de la inyección28,29; sin embargo, los ratones excretan n-óxido MPTP, un derivado no tóxico que no atraviesa membranas debido a su hidrofilicidad30.
    1. Usando todos los EPP mencionados anteriormente y sosteniendo ratones sobre una almohadilla de absorción desechable, inyecte un vehículo salino o una solución MPTP por dosis de 15 mg/kg en la cavidad intraperitoneal (i.p.), diariamente durante 4 días con una jeringa de tuberculina desechable de calibre 26.
    2. No recapitular la jeringa después de su uso; deseche en un contenedor de objetos punzantes biopeligros MPTP dedicado y etiquetado. Mantenga un 10% de lejía y pañuelos desechados cerca para limpiar cualquier goteo accidental.
  2. Coloque los animales inyectados con MPTP en jaulas desechables, hasta 5 ratones por jaula, y amañe en estantes abiertos. No use estantes ventilados.
    1. Coloque los carteles de uso de MPTP en el estante que contiene ratones y la puerta de la habitación de la carcasa hasta 72 h después de la última inyección.
      Nota: asegúrese de que la temperatura de la habitación de la vivienda esté entre 22.2 - 24.4oC, ya que los ratones experimentan hipotermia transitoria hasta 12h después de la intoxicación por MPTP. 31
    2. Descontaminar la superficie de trabajo con lejía después de cada uso (véase el paso 2.8), desechar la solución MPTP sobrante añadiendo un volumen equivalente al 10% de lejía y desechar el contenido como residuo líquido biopeligroso.
    3. Deseche todos los EPP usados en la papelera de eliminación dedicada. Si es necesario, rocíe con blanqueador al 10% antes de deseyarlo.
  3. Revise a los animales regularmente y refresque la fuente de alimentos y agua diariamente durante el paradigma de inyección y 72 h después de la última inyección. Nota: aunque no se prevé contaminación en el área que rodea inmediatamente el exterior de la jaula, esta región se trata con la solución de lejía como precaución (como se describe en el paso 2.8). Se debe tener cuidado al manipular todos los ratones y equipos durante este período.
    1. Tres días después de la última inyección, deseche todas las jaulas y revestimientos en una bolsa de riesgo biológico debidamente etiquetada. Reanudar el uso de EPP regular y alojamiento normal para animales; retire los carteles de puertas y estantes.

4. Recolección de tejidos

  1. Eutanasiar a los animales por luxación cervical 7 días después de la última inyección de MPTP. Diseccione inmediatamente el cerebro sobre hielo usando molde cerebral pre-enfriado con ranuras de 1 mm en el plano coronal.
  2. Diseccione el estriado de una rebanada del cerebro anterior de 2 mm de espesor a nivel de la comisura anterior.
    1. Elimine las regiones corticales y subcorticales circundantes con un bisturí. Broche a presión-congele el tejido estriado de cada hemisferio en un tubo separado del microcentrifuge de 1,5 ml para el análisis neuroquímico o bioquímico.
  3. Bloquee el mesencéfalo/el cerebro posterior en el plano coronal a nivel de hipotálamo anterior y el tejido de inmersión-fijación en la solución acuosa de formaldehído al 4%.

5. Procesamiento de tejidos

  1. Proceso para la bioquímica
    1. Homogeneizar el tejido estriado de un hemisferio utilizando un disruptor celular ultrasónico en 200-μL Tris-EDTA tampón de lisis (25mM Base Tris, 1mM EDTA, 1:100 proteasa e inhibidores de la fosfatasa cócteles) para 10 pulsos a 10-12 Hz y centrifugado durante 10 min a 4oC a 1000xg.
    2. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y reconstituir el pellet en tampón de lisis de 150 μl. Las fracciones se utilizan para el análisis bioquímico por SDS-PAGE y Western blotting.
      Nota: use tampón que contenga inhibidores de la proteasa y la fosfatasa dentro de 1 h de la preparación debido a la inestabilidad en soluciones acuosas.
  2. Proceso para la neuroquímica
    1. Utilice estriado diseccionado de otro hemisferio de cada muestra almacenada a -80 °C para HPLC. Descongelar los tejidos estriados en tubos de microfugios sobre hielo, añadir 500-μl de ácido perclórico (PCA) 500-μl (PCA) y homogeneizar utilizando sonicador.
      Nota: Para hacer 100 ml de PCA 0.3N, mida 90 ml ddH2O, agregue a un cilindro graduado de 100 ml, agregue 2.58 ml de PCA al 70% y lleve a la marca de 100 ml. Este búfer de muestra se puede almacenar a 4 °C durante un mes.
    2. Sonicar tejido estriado en 500-μl helado 0.3N PCA, para 10 pulsos a 10-12 Hz y colocar sobre hielo. Para garantizar la homogeneidad, sonicar muestras una segunda vez durante 10 segundos, a continuación, centrífuga durante 12 minutos a 4oC a 16.100xg.
    3. Decantar inmediatamente el sobrenadante a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenarlos a -80°C. Seque al aire la fracción de pellets en la campana.
    4. Mantener el sobrenadante a -80°C hasta su uso para la medición de dopamina y sus metabolitos, ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC) y ácido homovanílico (HVA) por HPLC con detección electroquímica.
    5. Una vez seco, reconstituya la fracción de pellets en 0.5N NaOH (500 μL), y sonice brevemente. Almacenar la fracción de pellet reconstituida a 4°C hasta su uso para la determinación de la proteína total utilizando el método lowry.
  3. Proceso para inmunohistoquímica
    1. Inmersión-fije los bloques mediados y posteriores-cerebro durante la noche en la solución acuosa del formaldehído del 4% y el cryoprotect en soluciones graduadas de la sacarosa (el 10% en solución salina fosfato-tamponada (0,01 M PBS; 0,138 M NaCl, 0,0027 M KCl, y ddH2O, pH 7,4) para 24 h, entonces el 30% en PBS hasta que el tejido se hunda) en 4°C. Limpie brevemente los bloques crioprotegidos para eliminar el exceso de solución de sacarosa, congele el hielo seco y guárdelo a -80 °C hasta su uso.
    2. Seccionamiento de microtomas de bloques cerebrales que contienen la mitad y la parte posterior del cerebro en un criostato.
      1. Retire los tejidos de -80 °C, equilibre a -16 °C durante 1 h en el criostato y monte en el medio de incrustación de tejidos.
      2. Recoger secciones coronales a 40 μm de espesor en solución crioprotectora (0,01M PBS con sacarosa al 30%, 30% de etilenglicol, pH 7,4) a -16°C. Recoja el tejido en serie en 6 tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a intervalos de 240 um y guárdelo a -20 °C.

6. Immunoblotting

  1. Determinar la concentración de proteínas en la fracción sobrenadante estriatal (preparada como se describe en la Sección 5.1) mediante ensayo de BCA.
  2. Calcule la dilución requerida para que cada muestra produzca 10 μg por pozo entregado en 20 μl de volumen.
  3. Diluya la proteína sobrenadante con tampón 4X Laemmli y tampón de homogeneización para producir 10 μg de proteína en solución tampón 1X Laemmli. Ejemplo de cálculo:
    1. Determinar la concentración final de proteína y el volumen requerido. En este caso, se requieren 10 μg en 20 μl (0,5 mg/ml).
    2. Determinar el volumen final de la solución de proteína necesaria. Aunque se requieren 20 μl para la carga, se debe preparar un volumen adicional (30 μl).
    3. Dado que se conocen el volumen final y la concentración, y se conoce la concentración de la fracción sobrenadante de proteínas (determinada por el ensayo BCA), calcule el volumen del sobrenadante proteico requerido utilizando la ecuación:
      Sobrenadante V = (Vfinal x Cfinal)/C sobrenadante
      Así, para una concentración de proteína sobrenadante de 1,5 mg/ml,
      Vsobrenadante = (30 μl x 0,5 mg/ml)/1,5 mg/ml
      Vsobrenadante = 10 μl
    4. Calcular la cantidad de tampón Laemmli 4X necesaria para producir una concentración de 1x en 30 μl de volumen (30 μl / 4 = 7,5 μl). Nota: El tampón 4X Laemmli debe diluirse a una fuerza 1X en la preparación de la muestra.
    5. Calcular la cantidad de tampón de homogeneización necesaria para llevar el volumen a 30 μl (y obtener la concentración final deseada de proteína de 0,5 mg/ml):
    6. Prepare la muestra por vórtice y luego pipeteando 10 μl de sobrenadante de proteínas en 12.5 μl de tampón de homogeneización. Añadir 7,5 μl de tampón 4X Laemmli para una solución de trabajo de muestra de 30 μl y una concentración de 0,5 mg/ml.
  4. Preparar todas las muestras utilizando el procedimiento descrito, vórtice y hervir durante 5 min.
    Nota: Utilice tubos de microcentrífuga de tapa atornillada para evitar fugas y aperturas debido a la presión durante la ebullición.
  5. Después de 5 min, colocar inmediatamente en el hielo. Cargue 20 μl de muestra de solución de trabajo por gel bien (10 μg de proteína). Separe las muestras de proteína por SDS-PAGE en un gel de Tris-glicina al 12%.
    1. Utilice una escalera de proteínas pre-teñidas para la confirmación de pesos moleculares. El tampón corriente es 25 mM Tris-base, 192 mM glicina, 0.1% SDS, y ddH2O, pH 8.3.
    2. Separar las proteínas por electroforesis: correr a 80 V para limpiar los pozos (10 min) y 125 V (aproximadamente 1 h; hasta que la escalera de proteínas se haya separado completamente) para resolver las proteínas.
  6. Realizar transferencia de proteína a nitrocelulosa utilizando membrana de nitrocelulosa de 0,2 μm en tampón de transferencia de Tris-glicina (25 mM Tris, 192 mM de glicina, 0,04% de SDS, 20% de metanol y ddH2O, pH 8,3) durante la noche durante 40 V a 4 °C.
  7. Lave las manchas de nitrocelulosa en 1x Tris solución salina (TS; 25mM Tris, 0.9% NaCl en ddH2O, pH 7.4) durante 10 min en RT. lncubate en Ponceau S durante 5 min y luego enjuague en ddH2O para proporcionar una verificación aproximada de la carga de proteína equivalente. Escanee la imagen para conservar el registro para el bloc de notas y detener mediante PBS.
    Nota: Alternativamente, lave la mancha blanca /negra en Milli-Q o ddH2O que contiene HCl (0.2%) durante aproximadamente 5 min. Buscar registro. Elimine la tinción de Ponceau S de la membrana mediante la etapa de incubación posterior (es decir, colocarla en el tampón de bloqueo).
  8. Bloquear manchas en leche en polvo al 5% sin grasa en TS durante 1 h a RT e incubar 24h a 4ºC con conejo anti-tirosina hidroxilasa (1:1000),anti-β-actina (1:200); anti-GFAP (1:1000) en leche-TS del 5%.
  9. Lave las manchas blancas /o del doble 3 x 5 minutos en el TS con el 0.05% Tween-20 y 1 x 5 minutos en el TS, después incube en el anticuerpo secundario HRP-conjugado (1:5000 en el TS que contiene la leche del 5%). emparejado a la especie del primario, para 2 h en el RT.
  10. Prepare el sustrato quimioluminiscente utilizando volúmenes iguales de soluciones de luminol y peróxido y aplique durante 1-3 min. En un cuarto oscuro, coloque la mancha blanca /negra en una manga de plástico para la exposición de la película y exponer a la película; la película se desarrolla utilizando un procesador automático.
  11. Tira de manchas con tampón de extracción disponible en el comercio a 37 °C durante 30 min, lavar 3x 10 min en TS con 0.05% Tween-20, y 1x 10 min en TS y luego reprobar para el control de carga u otra proteína de interés.
  12. Cuantificar las señales mediante el software Image J para mediciones de densidad óptica y normalizar al control interno de carga β–actina.

7. Neuroquímica

  1. El tejido para análisis se prepara como se describe anteriormente en la Sección 5.2. Consulte la Tabla 1 para la receta de fase móvil.
    Nota: Todos los reactivos deben ser ≥99.0% puros y de grado HPLC. Garantice la integridad del búfer con cristalería limpia y dedicada y barras de agitación. El tampón de fase móvil debe utilizarse dentro de los siete días posteriores a la preparación.
    1. Pesar el fosfato de dihidrógeno y el ácido cítrico, añadir 1 L de ddH2O y mezclar en un cilindro graduado de 2-L. Filtre la solución a través de una membrana GSTF de 0,22 μm.
      Nota: Esto maximiza la extracción de contaminantes en el fosfato y el ácido cítrico, lo que ayuda a minimizar las corrientes de fondo.
    2. Añadir la AOS seguida de la solución de acetonitrilo y EDTA. Añadir hplc grado ddH2O a aproximadamente 1900 ml antes de ajustar el pH a 3,0 con ácido fosfórico.
    3. Agregue el grado de HPLC ddH2O a la marca de 2 L y, a continuación, vierta en un matraz de 2 L. Agregue una barra de agitación dedicada y desgasificar la fase móvil revolviéndolo al vacío durante > 10 min.
  2. Prepare los estándares para la dopamina, y DOPAC y HVA para las curvas estándar. Las soluciones de cepas de estándares se preparan a 1 mg/ml en 0,3 N PCA.
    1. Pesar 12.4 mg de dopamina-HCl, y añadir 10.0 ml de 0.3 N PCA para hacer 1 mg/ml de dopamina.
    2. Pesar 10,0 mg de DOPAC y añadir 10,0 ml de PCA de 0,3 N para hacer 1 mg/ml de DOPAC.
    3. Pesar 10,0 mg de HVA y añadir 10,0 ml de PCA de 0,3 N para hacer 1 mg/ml de HVA.
  3. Prepare soluciones estándar de trabajo a partir de las soluciones de stock. Los estándares de cinco puntos se utilizan para generar una curva de concentración.
    1. Para la medición de la dopamina estriatal, preparar concentraciones estándar de 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, y 200 ng/ml.
    2. Para dopac estriado, preparar concentraciones estándar de 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml y 40 ng/ml.
    3. Para el HVA estriado, prepare concentraciones estándar de 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml y 80 ng/ml.
    4. Generar estándares de cinco puntos: diluir 1 mg/ml de solución de stock de dopamina a 5 μg/ml usando PCA 0.3N. Diluir 1 mg/ml de solución común de DOPAC a 1 μg/ml utilizando 0,3N PCA, y diluir 1 mg/ml de solución de HVA en 2 μg/ml utilizando 0,3N DE PCA.
    5. Transferir 1 ml de 5 μg/ml de dopamina, 1 ml de 1 μg/ml de DOPAC y 1 ml de 2 μg/ml de HVA en un matraz a volumetrágico de 25 ml y llevar el volumen a 25 ml de marca con 0,3 N de PCA.
      Nota: Las normas mixtas en el matraz a volumeriento contienen la concentración más alta de las normas de cinco puntos: 200 ng/ml de dopamina, 40 ng/ml de DOPAC y 80 ng/ml de HVA.
    6. Transferir 1 ml de las normas mixtas en tubos de microcentrífuga limpios de 1,5 ml. Realice la dilución en serie 1:1 cuatro veces para generar los estándares de cuatro puntos subsiguientes.
      1. Por ejemplo, a 250 μl de los estándares mixtos, agregue 250 μl de tampón de muestra y vórtice a fondo para producir estándares mixtos al 50% de las concentraciones originales; repetir el proceso hasta que se logren las diluciones deseadas.
  4. Prepare el sistema de HPLC (bomba, muestreador automático, columna de fase inversa (C18, 150×3,2 mm, 3 μm)). Purgue la bomba con una fase móvil fresca para reemplazar toda la solución anterior en el sistema de HPLC y las burbujas de aire atrapadas con una fase móvil nueva. Enfríe el muestreador automático a 4 °C. Caliente la columna a 35 °C, lo que reduce la presión total.
    1. Ajuste el voltaje en -150 mV y 220 mV para el primer y segundo electrodo del detector electroquímico, respectivamente. Equilibrar el sistema durante al menos 2 h, e idealmente durante la noche, con la fase móvil a un caudal de 0,2 ml/min.
      Nota: Durante el equilibrio, las celdas deben estar enciadas y la lectura de línea de base debe ser monitoreada. La lectura estable indica que el sistema está listo para usarse. Durante las dos horas de la fase de equilibrio, permita que la fase móvil entre en un contenedor de residuos en lugar de recircularlo. Después de este período, la fase móvil se puede reciclar durante la noche para el equilibrio.
    2. Una vez completado el equilibrio, ajuste el caudal de la fase móvil a 0,6 ml/min. Inyecte 20 μl de cada una de las normas de cinco puntos.
  5. Descongele las muestras estriales en el hielo e inyecte 2 x 20 μl de cada muestra en el sistema de HPLC. Utilice los estándares al principio y al azar a lo largo de cada conjunto de muestras estriados.
  6. Utilice el software para analizar el área bajo dopamina, DOPAC, y los picos de HVA producidos por los estándares y muestras. Identifique los analitos por tiempo de retención y mida comparando el área bajo pico con la de la curva de 5 puntos para su estándar correspondiente.
  7. Preparar la fracción de pellets como se describe en el punto 5.2.3. Realice un ensayo de proteína Lowry en el pellet estriado. Nota: Este ensayo medirá la cantidad de proteína presente en las muestras estriales en mg/ml; esta información se utiliza para determinar la concentración ng/mg de analito.

8. Inmunohistoquímica

  1. Inmunofluorescencia dual GFAP/TH
    1. Retire los tubos que contienen mesencéfalo seccionado del congelador de -20 °C y lleve a RT. Retire las secciones de tejido que contienen sustancia negra de la solución criopreservadora en una bandeja que contenga PBS.
    2. Coloque las secciones de tejido en inserciones de poliestireno con fondos de malla de poliéster para inmunoquímica de flotación libre. Lavar 3 x 5 min en PBS.
    3. Transfiera secciones a una placa de 96 pozos con solución de bloque de 180 μl (5% de suero de burro normal, 1% de PVP, 1% de BSA y 0,3% de Triton X-100 en PBS) en cada pozo. Incubar 40 min en RT.
      Nota: Todos los pasos de lavado e incubación se realizan con agitación ligera en la coctelera.
    4. Transferir secciones a pozos que contengan la solución de anticuerpos primarios (180 μl por pozo). Incubar en cóctel de anticuerpos primarios, conejo anti-GFAP (1:1000) y anti-TH de ovejas (1:400) diluido en PBS con BSA al 1% y TX-100 al 0,3%, durante 24 h a 4°C. IgG de la especie primaria sirve como el control de inmunotenstenimiento negativo.
    5. Incubar en cóctel de anticuerpos secundarios (1:200 burro anti-conejo 568 y 1:200 FITC burro anti-ovejas en PBS con 0,1% TX-100). Use papel de aluminio para proteger la solución de la luz durante la preparación y la incubación; incubar en RT durante 2 h.
      1. Para un control negativo, incubar secciones en IgG de la especie primaria diluidas a la misma concentración que se utiliza para los anticuerpos primarios.
      2. Lavar 2 x PBS y 1 x TS durante 5 min cada uno en RT. Montar secciones de tejido en más portaobjetos en medio de montaje con mancha Hoechst y cubrebocas.
    6. Incubar en cóctel de anticuerpos secundarios (1:200 burro anti-conejo 568 y 1:200 FITC burro anti-ovejas en PBS con 0,1% TX-100). Use papel de aluminio para proteger la solución de la luz durante la preparación y la incubación; incubar en RT durante 2 h.
    7. Lavar 2 x PBS y 1 x TS durante 5 min cada uno en RT. Montar secciones de tejido en más portaobjetos en medio de montaje con mancha Hoechst y cubrebocas.
    8. Proteja los portaobjetos de la luz y la oxidación hasta la obtención de imágenes almacenándolos en una caja de diapositivas a 4 °C.
    9. Analice el control negativo primero para determinar el nivel de fondo de fluorescencia, después evalúe para el immunoreactivity positivo usando microscopia fluorescente.
  2. Iba1 inmunohistoquímica con chromagen precipitación
    1. Retire los tubos que contienen mesencéfalo seccionado del congelador de -20 °C y lleve a RT. Retire las secciones de tejido que contienen sustancia negra de la solución criopreservadora en una bandeja que contenga PBS.
    2. Coloque secciones de tejido en inserciones de poliestireno para inmunoquímica flotante. Lave las secciones 3 x 5 min en PBS, y coloque las secciones directamente en la placa de 12 pozos que contiene monohidrato de ácido cítrico precalentado de 10 mM, pH 9.0, 80 ° C durante 30 min, para la recuperación del epítopo.
    3. Enfriar la placa 20 min a rt. Volver secciones a las inserciones y lavar 3 x 5 min en PBS.
    4. Transfiera secciones a una placa de 96 pozos que contenga una solución de bloqueo de 180 μl (10% de suero de cabra normal, 1% de BSA en PBS) por pozo, e incube 40 min en RT.
    5. Secciones de transferencia a pozos que contienen anticuerpo primario diluido de 180 μl (1:1000 en BSA-PBS al 1%). Incubar durante la noche a 4°C.
    6. Transferir secciones a inserciones. Lave 3 x 5 minutos PBS y aplique el anticuerpo secundario biotinylated (1:200 en suero-PBS normal del 1,5%) para 1 h en el RT.
    7. Prepare la solución ABC 30 min antes de su uso. Lavar 3 x 5 min PBS y transferir a la solución ABC durante 1 h en RT.
    8. Prepare la solución DAB en el capó. Lavar 2x 5 min en PBS y 1x 5 min en TS, e incubar secciones en DAB.
      1. Desarrollar durante 3-4 min. El control negativo debe permanecer de color claro.
        Nota: realice este paso en la campana extractora de humos, ya que dab es un carcinógeno conocido. Una solución de 0.2M de permanganato de potasio en ddH2O para la descontaminación debe mantenerse cerca en caso de goteo accidental.
    9. Enjuague las secciones brevemente en ddH2O, luego en TS 3 x 5 min. Monte secciones en toboganes más y seque al aire durante la noche en la campana extractora de humos.
    10. Descontaminar los residuos de DAB con un volumen igual de permanganato de potasio de 0.2M en ddH2O, vórtice e incubar en una campana extractora de humos durante la noche antes de almacenarlos en contenedores de residuos de DAB debidamente etiquetados en la campana extractora de humos.
      Nota: La solución de lejía no elimina las propiedades mutagénicas de DAB.
      1. Descontaminar los artículos que se van a reutilizar (es decir, inserciones de poliestireno) y lavar con detergente.
    11. Deshidratar/contratentar ligeramente con violeta cresyl (CV). Todos los pasos de deshidratación/lavado son 3 min: etanol 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV (30 segundos), ddH20 x 2, 95% etanol + ácido acético glacial (0.1%) x 2, etanol 100%, y xileno.
    12. Cubrebocas en medio de montaje de distireno-tolueno-xileno y secos en campana extractora de humos.
    13. Observe la inmunorreactividad positiva mediante un microscopio de luz. IgG de la especie primaria sirve como el control de inmunotenstenimiento negativo.

9. Estadísticas

  1. Evaluar las diferencias entre las medias mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparar las diferencias entre el genotipo y por el ANOVA bidireccional para comparar las diferencias entre el genotipo y el tratamiento con tóxicos. Utilice el análisis post hoc de HSD de Tukey cuando las diferencias se observan mediante pruebas de ANOVA(p≤0.05).
    Nota: los experimentos (con n = 6-9 ratones/grupo) se realizan un mínimo de dos veces para garantizar la reproducibilidad.

Resultados

Este paradigma de la exposición de la toxina puede producir un agotamiento estriado significativo y perceptible de la dopamina del 20% en mptp- contra animales salino-inyectados. Es importante tener en cuenta que diferentes lotes de MPTP pueden producir un poco más o menos lesiones; por lo tanto, para una mejor precisión, se recomienda un experimento preliminar en ratones de tipo salvaje antes de su uso en transgénicos cuando se utiliza un nuevo lote de neurotoxinas. El uso de lesiones leves a moderadas permite obse...

Discusión

El diseño de este estudio de la interacción gen-ambiente permitió ganar la nueva información con respecto a la naturaleza dual del isozyme 5-LOX en el camino nigrostriatal. Mediante la realización de HPLC para medir monoaminas estriadas después del tratamiento salino o MPTP en transgénicos que carecen de la isoenzima 5-LOX y sus compañeros de camada de tipo salvaje, pudimos observar que su deficiencia parece ser protectora en condiciones tóxicas(Figura 1),pero en condiciones normales, la falta ...

Divulgaciones

No hay nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud NIGMS 056062.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL)Sigma-AldrichM0896for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA)American MasterTech ScientificBUP0157for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA)Sigma-Aldrich244252for HPLC acid extraction
Tris BaseSigma-AldrichT1503for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE1644for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktailSigma-AldrichP5726for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH)Sigma-AldrichS5881for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) Sigma-AldrichS0389for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS)Sigma-AldrichP3813for IHC
BCA Protein Assay KitPierce/Thermo23225for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-wellInvitrogen/Life TechnologiesEC60052BOXfor SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Invitrogen/Life TechnologiesNP0007for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard Invitrogen/Life TechnologiesLC5800protein ladder
GlycineSigma-AldrichG7126for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS)Sigma-AldrichL3771for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent American MasterTech ScientificSPM1057Cmethanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagentSigma-AldrichS9888saline and buffers
Nonfat dry milk powderCarnationn/afor immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid Sigma-AldrichP7170for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonalChemicon/MilliporeAB1542for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonalPel-Freez BiologicalsP40101-0for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbitSigma-AldrichA2066for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonalChemicon/MilliporeAB5804for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonalCovance Inc.SMI-22Rfor immunoblotting
Tween-20Sigma-AldrichP1379for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated Fisher Scientific31462for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugatedPierce/Thermo31480for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugatedPierce/Thermo31430for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstratePierce/Thermo34078for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in Pierce/Thermo34089for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer Pierce/Thermo21059for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% Sigma-AldrichC1909for IHC
Normal Donkey SerumMilliporeS30-100MLfor IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP)Sigma-AldrichP5288for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilizedSigma-AldrichA3294for IHC
Triton X-100Fisher ScientificBP151-01for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled Invitrogen/Life TechnologiesA10042for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC Jackson ImmunoResearch713-095-147for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1500for IHC
Normal Goat SerumMilliporeS26-100MLfor IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) Vector LaboratoriesPK-4001for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidineVector LaboratoriesSK-4100for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30%Sigma-Aldrich216763for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1Biocare MedicalsCP290Afor IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength FD NeurotechnologiesPS102-01counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcoholSigma-AldrichR8382dehydration for IHC
100% Absolute ethanolMallinckrodt7019-10dehydration for IHC
Acetic acidSigma-AldrichA6283destaining for IHC
XyleneSigma-Aldrich534056clearing agent for IHC
DPX MountantSigma-Aldrich06522mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium American MasterTech ScientificEMOCTCSembeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganateSigma-Aldrich223468to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochlorideSigma-AldrichH8502for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC)Sigma-Aldrich850217for HPLC
Homovanillic acid (HVA)Sigma-AldrichH1252for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70%Sigma-Aldrich244252for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateSigma-Aldrich71504for HPLC
Citric acid monohydrateSigma-AldrichC1909for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA)Sigma-AldrichO8380for HPLC
EDTASigma-AldrichE1644for HPLC
AcetonitrileEMDAX0145-1for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O)Milliporefor HPLC
0.22 µm GSTF membraneMilliporefor filtration
Corning NetwellsSigma-AldrichCLS3477polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150)MSEMSE.41371.274
MicrocentrifugeEppendorf5414R
ESA MD-150 reverse-phase column ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000)DionexISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000)DionexWPS-3000TSL
Electrochemical detectorESACoulochem III
Guard CellESA5020
Analytical CellESA5011A
Chromeleon softwareDionex
Eclipse E400NikonE400light/fluorescent microscope
Disposable mouse cageAncareN10HT
Microfilter topAncareN10MBT
5-LOX- deficient miceThe Jackson Laboratory004155
12/15-LOX-deficient miceThe Jackson Laboratory002778

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