Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Resumen

Listeria monocytogenes es un patógeno bacteriano Gram positiva utilizado frecuentemente como un modelo importante para el estudio de parasitismo intracelular. Imágenes tardías L. monocytogenes etapas de infección en el contexto de los pequeños ARN de interferencia pantallas permite el estudio global de las vías celulares requeridos para la infección bacteriana de las células huésped diana.

Resumen

Patógenos bacterianos intracelulares pueden ser concebidos como herramientas moleculares para disecar cascadas de señalización celular debido a su capacidad para manipular exquisitamente y subvertir las funciones celulares que se requieren para la infección de tejidos diana del huésped. Entre estos agentes patógenos bacterianos, Listeria monocytogenes es un microorganismo Gram positiva que se ha utilizado como un paradigma para el parasitismo intracelular en la caracterización de la respuesta inmune celular, y que ha desempeñado un papel decisivo en el descubrimiento de las vías moleculares que controlan la dinámica del citoesqueleto y de la membrana de la trata. En este artículo se describe un ensayo microscópico robusta para la detección de las etapas de la infección celular tardías de L. monocytogenes basan en el etiquetado fluorescente de InlC, una proteína secretada bacteriana que se acumula en el citoplasma de las células infectadas; este ensayo se puede acoplar a las pequeñas pantallas de ARN de alto rendimiento de interferencia automatizados con el fin de carbonizarterizar vías de señalización celular implicadas en la altura o hacia abajo-regulación de la infección.

Introducción

La bacteria Gram positiva Listeria monocytogenes es un patógeno transmitido por los alimentos que invade las células huésped, interrumpe su vacuola internalización y se replica en el citoplasma de las células huésped ^1. L. monocytogenes facilidad de manipulación en el contexto de laboratorio (rápido crecimiento, baja toxicidad para los individuos sanos) asociado con la persistencia de rasgos de virulencia bacterianas observadas en modelos celulares y animales (actividad hemolítica, leucocitosis) permite su uso inicial en la década de 1960 como un modelo importante para el estudio de parasitismo intracelular y para el establecimiento de los fundamentos teóricos de la inmunidad celular contra la infección ^2. A finales de 1980 y principios de 1990, la disección del ciclo intracelular bacteriano ^3, así como la caracterización molecular de la virulencia bacteriana más importante factores de ^4-7 favoreció el uso de L. monocytogenes como una herramienta clave molecular para la manipulación y el pernoy de las funciones de la célula huésped. La presencia de no virulenta (L. innocua) y (Listeria monocytogenes) especies virulentas en el género Listeria allanaron el camino para estudios genómicos comparativos ⁸ que, junto con la reciente creación de la completa L. monocytogenes transcriptoma ^9, han aumentado nuestra comprensión de la evolución de la L. monocytogenes como un patógeno humano y como un sistema modelo para estudios de infección ^10.

L. monocytogenes induce su internalización en las células huésped en la interacción de las proteínas de la superficie bacteriana INLA y InlB con sus receptores de células huésped E-cadherina y Met, respectivamente ^11-12. Estudios basados ​​en la candidata inicial condujeron a la identificación del enlace cateninas-actina α / β como un componente importante de la vía ^InlA-13 y la invasión de la fosfoinosítido 3-quinasa (PI 3-K) como un efector crítico de la InlB- casca invasión dependientede ^14-15. Ensayos proteómicos y basados ​​funcional posteriormente permitieron la identificación de nuevos elementos del citoesqueleto y ¹⁶ segundos mensajeros lipídicos ¹⁷ requeridos para la invasión de la célula huésped. Estudios transcripcionales ¹⁸ y proteómica cuantitativa basada en la espectrometría de masas ¹⁹ se han esclarecido algunos puntos en relación con la activación de cascadas de señalización de acogida y la represión de la respuesta inmune durante la L. monocytogenes infección. La biología de sistemas se acerca basado en la inactivación de los grandes conjuntos de genes (kinomes, genomas completos) por pequeños ARN de interferencia (siRNA) silenciamiento se han abierto recientemente nuevas vías para el análisis de la serie mundial de las cascadas de señalización en el contexto de las funciones celulares específicas, incluyendo la fagocitosis y internalización patógeno ^20. Pantallas siRNA del genoma completo han realizado anteriormente para investigar cascadas celulares requeridos para la infección de L. monocytogenes en fagocítica Drosophila células S2 ^21-22, pero este tipo de análisis no ha sido realizado en las células no fagocíticas, que representan objetivos críticos para la infección in vivo.

Hemos optimizado un protocolo para la detección microscópica de las etapas tardías de la infección por L. monocytogenes que es adecuado para siRNA estudios de alto rendimiento de la entrada de bacterias dentro de las células epiteliales. Nuestro ensayo se aprovecha de una L. altamente invasiva monocytogenes cepa que presenta una mutación puntual en PrfA, el principal regulador de la transcripción de L. monocytogenes factores de virulencia ^6: esta mutación (llamado PrfA *) hace que PrfA constitutivamente activa ²³ y conduce a un aumento de la expresión de las proteínas de invasión inlA y InlB, por lo tanto, favorecer la entrada de bacterias en células no fagocíticas de lo contrario pobremente infectados. Nuestra lectura para la infección se basa en la detección de la acumulación citosólica de la secretada InlC proteína bacteriana: esta molécula esun efector pleiotrópica que se expresa preferentemente por intra-citoplasmática L. monocytogenes ⁹ y que participa no sólo en la célula de células-a-bacteriana propagan ²⁴ pero que también modula las respuestas inmunes del huésped ^25. El marcaje fluorescente de la secreción de InlC por bacterias intracelulares no sólo permite distinguir claramente infectado a partir de células no infectadas, sino que también representa una lectura de punto final que se puede utilizar para diseccionar posteriormente infección en sus diferentes pasos: entrada, de escape vacuolar, citosólica bacteriana la proliferación y propagación de célula a célula. Este protocolo basado en microscopía-puede estar acoplado a las pantallas de siRNA por lo tanto, para estudiar las vías celulares implicadas en la infección de células huésped por L. monocytogenes.

Protocolo

1. Preparación de Celular y bacterianas Culturas, Herramientas de transfección y Anticuerpos primarios

1. Preparar una placa de agar fresco para aislar individuo L. monocytogenes colonias a partir de un stock de glicerol bacteriana (50% glycerol/50% saturada cultivo de una noche de líquido bacteriano) mantuvo a -80 ° C.
   1. El uso de un bastidor de aluminio (se mantiene a -80 ° C) para el transporte de un Congelados glicerol bacteriana de valores, las bacterias del rayado en una infusión de corazón cerebro (BHI) placa de agar.
   2. Incubar la placa a 37 ° C durante 48 h (o hasta que las colonias bacterianas individuales se pueden aislar).
   3. Mantenga esta placa de trabajo después a 4 º C durante un tiempo máximo de 1 mes (que será utilizado para sembrar cultivos líquidos).
   4. En el protocolo, se utiliza el L. monocytogenes serotipo 1/2a EGDe.PrfA * cepa, pero como se ilustra en la Figura 1, la L. serotipo monocytogenes 4b P14.PrfA * Cepa da resultados similares.
2. ÉlLa ATCC CCL2 células se cultivan en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) en ausencia de antibióticos.
3. Piscinas independientes de revuelto (control) y los anti-Met siRNAs se cargan en 384-y placas de cultivo celular de microscopía negros.
   1. Diluir 160 pmoles de siRNA en 500 l de RNasa libre de agua y añadir 5 l de esta solución por pocillo (concentración final: 1,6 pmol).
   2. Mantenga esta placa a -20 ° C durante un período máximo de 1 año.
4. Anticuerpos de conejo policlonales contra la proteína bacteriana InlC se han obtenido mediante inmunización usando una proteína recombinante GST-InlC como se ha descrito previamente ^25.

2. Invierta siRNA transfección celular

1. 72 horas antes de la infección llevar a temperatura ambiente un 384-así placa de cultivo celular microscopia negro que contiene 1,6 pmol siRNA en 5 l de RNasa libre de agua en cada pozo.
2. Se centrifuga la placa durante 3 minutos a 300fcr a temperatura ambiente para reducir siRNA que podrían haber sido depositados en las paredes de los pozos.
3. Preparar habitación DMEM suplementado con temperatura 0,4% Lipofectamine RNAiMAX.
4. Añadir 25 l de medio de transfección DMEM / RNAiMAX a cada pocillo (no incubar el medio de transfección más de 20 min antes de añadir a la ARNsi).
5. Mueva la placa de un lado a otro para mezclar el siRNA con la solución de transfección, a continuación, mantener la placa durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir complejos de siRNA Lipofectamine a la forma.
6. Lavar las células HeLa de un frasco confluente o cultivo celular sub-confluente una vez con 10 ml 37 ° C PBS precalentado.
7. Separar las células HeLa mediante la adición de 1 ml de 37 ° C precalentado tripsina al matraz de cultivo celular y se incuba durante 3 a 5 min a 37 ° C.
8. Vuelva a suspender las células en 10 ml 37 ° C precalentado DMEM suplementado con 16% de SFB.
9. Contar las células y preparar una suspensión de células de 12.000 células por ml en DMEM suplementado con16% de FBS.
10. Añadir 50 l de la suspensión celular a cada pocillo en la placa de 384 pocillos.
11. Mueva la placa rápidamente hacia adelante y hacia atrás para distribuir las células y dejar que se calmen las células durante 10 minutos a temperatura ambiente.
12. Sellar la placa con Parafilm y mantenerlo durante 72 horas en un 5% de CO ₂ que contienen atmósfera húmeda a 37 ° C.

3. La infección celular y tinción

1. El día antes de la infección, tome una sola colonia de L. monocytogenes de la placa de agar BHI y resuspender en 5 ml de medio BHI líquido en un tubo de poliestireno de 15 ml.
2. Incubar durante la noche a 37 ° C en un dispositivo de shacking para permitir el crecimiento bacteriano.
3. El día de la infección, lave 1 ml de la noche a la mañana L. monocytogenes cultura centrifugando 2 min a 10.600 FCR en una centrífuga de mesa.
4. Descartar el sobrenadante (que contiene el secretado listeriolisina citotoxina O) y resuspender el precipitado en 1 ml de PBS (REPEAt la etapa de lavado 3 veces más).
5. Leer la densidad óptica a 600 nm bacteriana y estimar el número de bacterias (OD = 1 es equivalente a 1E9 bacterias / ml).
6. Prepare la adecuada L. monocytogenes dilución en DMEM suplementado con 1% de SFB: el uso de cepas altamente invasivos como EGDe.PrfA *, se sugiere el uso de bacterias 5E4 en 30 l de medio por pocillo (la multiplicidad de la infección se estima en 25 por 2.000 células).
7. Retire el medio de cultivo celular en cada pocillo (80 l) y sustituirla por la adición de 30 l de la L. monocytogenes que contienen medio.
8. Centrifugar la placa a 200 rcf durante 5 min a temperatura ambiente para sincronizar el proceso de infección.
9. Incubar la placa durante 1 hora en un 5% de CO ₂ que contienen atmósfera húmeda a 37 ° C en un bloque de aluminio precalentado.
10. Retire la L. monocytogenes que contienen medio de cada pocillo y añadir 30 l de DMEM precalentado suplementado con 10% de FBS y40 mg / ml de gentamicina para matar extracelular L. monocytogenes.
11. Se incuba durante 4 horas en un CO _2-atmósfera que contiene 5% a 37 ° C en un bloque metálico precalentado.
12. Preparar una solución de PBS suplementado con 8% de formaldehído (esta solución debe prepararse fresca de modo que los monómeros de formaldehído, en lugar de los polímeros de paraformaldehído, se utilizan).
13. Sin desechar el medio de cultivo de células, añadir 30 l de PBS suplementado con 8% de formaldehído (concentración final: 4%) y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
14. Quite el fijador y lavar las células tres veces con 80 l de PBS por pocillo (mantener las células en un volumen final de 80 l de PBS por pocillo).
15. Preparar una dilución 1:250 del anticuerpo de conejo anti-InlC suero en PBS suplementado con 0,2% de saponina.
16. Añadir 10 l de la solución de anticuerpo primario a cada pocillo después de retirar el PBS y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
17. Deseche la primariasolución de anticuerpo y lavar cuatro veces con 40 l de PBS por pocillo.
18. Diluir el anticuerpo secundario Alexa Fluor 546 acoplado-anti-conejo (1:250), la solución de DAPI (1:1.500) y faloidina-Dy647 (1:150) en PBS suplementado con 0,2% de saponina.
19. Añadir 10 l de esta solución de tinción secundaria a cada pocillo e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
20. Deseche la solución de tinción secundaria y lavar cuatro veces con 40 l de PBS por pocillo (dejar un volumen final de 40 l en cada pocillo y sellar la placa).
21. La placa se pueden visualizar inmediatamente o se puede almacenar a 4 ° C protegido de la luz (cubrir con papel de aluminio) para su posterior análisis.

4. Adquisición de imágenes y análisis

1. Adquirir imágenes en tres canales diferentes (350 nm, 546 nm y 647 nm) utilizando un objetivo de 10X montada en un microscopio automatizado (adquirir con preferencia 9 imágenes por pocillo).
2. La señal de InlC se puede medir usando la imagensoftware de análisis como CellProfiler que permite la segmentación automatizada de núcleos y cuerpos celulares utilizando el DAPI y la tinción phalloidin, respectivamente.

Resultados

Etiquetado fluorescente de citoplasmática InlC proporciona una lectura robusta para la infección de células por L. monocytogenes, como se ilustra en la Figura 1: la célula central en la micrografía es altamente infectadas por la cepa P14.PrfA * ²³ como se puede observar en la imagen de contraste de fase (puntas de flecha, Figura 1A) y se confirma por la señal DAPI donde bacterias individuales se pueden distinguir con claridad (fig. 1B). La tinc...

Discusión

Varios parámetros son críticos para el éxito de nuestro protocolo InlC-detección, incluyendo el uso de líneas de células sanas que muestran un citoplasma suficientemente grande para permitir una detección inequívoca de la señal de InlC. En el ensayo se presentan en este artículo se propone el uso de células HeLa CCL2, que son particularmente muy adecuado para nuestro ensayo debido a la extensión de su espacio citosólico; otros clones de HeLa tales como células HeLa Kioto muestran un citoplasma más pequeñ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Brain Heart Infusion	BD	237500	For liquid BHI preparation
Bacto Agar	BD	214010	Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum	Biowest	51830-500
DMEM	Invitrogen	61965-026
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778-100
Gentamicin	Sigma	G1397-10ML
Formaldehyde (16%)	EMS	15710	Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546	Invitrogen	A-11035
DAPI	Invitrogen	D-1306
Phalloidin Dy647	Dyomics	647-33
siRNA Scramble	Dharmacon	D-001810-10
siRNA Met	Dharmacon	L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate	Corning	3985
AxioObserver Z1 microscope	Zeiss	431007 9901
sCMOS camera	Andor	Neo
Metamorph analysis software	Molecular Devices	4000
CellProfiler analysis software	Broad Institute	Public software available at http://www.cellprofiler.org/