Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

Resumen

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Resumen

Muchos tejidos, tales como los corazones humanos adultos, no son capaces de regenerarse adecuadamente después de un daño. ^2,3 Estrategias en la ingeniería de tejidos proponen innovaciones para ayudar al cuerpo en la recuperación y reparación. Por ejemplo, los enfoques de TE pueden ser capaces de atenuar la remodelación cardiaca después de infarto de miocardio (MI) y, posiblemente, aumentar la función total del corazón a un nivel casi normal pre-MI. ⁴ Como con cualquier tejido funcional, regeneración exitosa del tejido cardíaco implica la correcta entrega de los múltiples tipos de células con señales ambientales que favorecen la integración y la supervivencia del injerto de células / tejido implantado. Tejidos reconstituidos deben abordar varios parámetros, entre ellos: señales solubles, interacciones célula a célula, y materiales de matriz evaluados como vehículos de administración, sus efectos sobre la supervivencia celular, la resistencia del material, y la facilitación de la organización de la célula a los tejidos. Los estudios que emplean la inyección directa de células del injerto sólo ignorar estos elementos esenciales. ^2,5,6Un diseño tejido combinando estos ingredientes todavía no se ha desarrollado. A continuación, presentamos un ejemplo de diseños integrados que utilizan capas de láminas de células estampadas con dos tipos distintos de materiales de origen biológico que contenga el tipo de células de órganos diana y las células endoteliales para la mejora de la formación de nuevos vasos en el "tejido". Aunque estos estudios se centran en la generación de tejido de corazón-como, este diseño de tejido se puede aplicar a muchos otros órganos además de corazón con diseño y el material cambios mínimos, y está destinado a ser un producto fuera de la plataforma para las terapias regenerativas. El protocolo contiene cinco pasos detallados. Una temperatura de poli sensible (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) se utiliza para platos de cultivo de tejidos abrigo. Luego, las células específicas de tejidos se cultivan en la superficie de las placas recubiertas / superficies micropatrón para formar láminas de células con fuertes adherencias laterales. En tercer lugar, se crea una matriz de base para el tejido mediante la combinación de matriz porosa con admisible que neovascularhe hidrogeles y células endoteliales. Finalmente, las láminas de células se levantan de los platos recubiertos PNIPAAm y se transfieren al elemento de base, por lo que la construcción completa.

Introducción

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.^5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.^13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.^18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types.

Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel²² for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.^1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

Protocolo

1. Creación de placas recubiertas con PNIPAAm

1. Disolver el 2,6 g de PNIPAAm en 2 ml de una solución de hexano 60% de tolueno / 40%.
2. Se calienta la mezcla a 60 ° C durante 10 min con agitación, hasta que se disuelva el PNIPAAm.
3. Cortar el papel de filtro en un círculo de diámetro 60 mm y coloque el papel en el embudo Buchner.
4. Se filtra la solución a través de un embudo Buchner en el vaso de vidrio previamente pesado (no utilice plásticos, como el hexano se derretirá plásticos).
5. Colocar el vaso y su contenido en un vacío de campana (24 psi) O / N (16 horas). Nota: Hasta que el residuo se hace reaccionar con isopropílico se oxidará así que asegúrese de que no entre en contacto con el oxígeno.
6. Pesar el vaso de precipitados para establecer el peso de la PNIPAAm.
7. Añadir alcohol isopropílico a la PNIPAAm, la creación de un 50/50 w / w solución.
8. Coloque 2 ml de la solución en la superficie de la placa de cultivo de tejidos, y el abrigo durante 5 minutos bajo luz UV.
9. Lavar la placa con 2 ml de PBS caliente dos vecesantes de usar para el cultivo celular.

2. Creación de láminas de células

Nota: láminas de células de células primarias para el órgano diana pueden ser creados usando un número de diferentes métodos, o mediante el recubrimiento de superficies de cultivo de tejidos con el polímero termosensible tal como se describe aquí. Placas termo-sensible Pre-recubiertos también son ofrecidos por varios proveedores.

Nota: Este protocolo es para la cultura utilizando una placa de 35 mm. Brevemente, las células se incubaron primero a 37 ° C durante un mínimo de 24 horas a confluencia de establecer conexiones laterales entre las células adyacentes. Para separar las hojas de células, las placas se someten a temperaturas inferiores a 32 ° C. La lámina de células se transfiere a continuación a la fuerte matriz fibrosa de base que contiene un hidrogel permisiva neovascular con las células endoteliales vasculares.

1. Aislar la población celular. Nota: Este método depende de los procedimientos de derivación individuales y el tipo de células. Rata mu lisa aórticacélulas SCLE (RASMC) se utilizan en este ejemplo. Estos son células musculares lisas primarias aisladas de la aorta abdominal de una rata.
2. Lavar las células con 2 ml de PBS caliente.
3. Añadir 3 ml de tripsina (u otra solución de escisión / disociar) a las células durante 5 min.
4. Inhibir la tripsina mediante la adición de 3 ml de los medios de cultivo, o una solución de tampón fosfato (PBS) que contenía 10% suero bovino fetal (FBS).
5. Recoger las células en un tubo cónico y contar una alícuota.
6. Girar las células a 1.000 rpm (228 xg) durante 5 min.
7. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en su medio de crecimiento (medio de cultivo SmGM2 más kit de bala se utiliza para RASMC).
8. Coloque el soporte que contiene las células en un termo-sensible placa de 35 mm - PNIPAAm placa recubierta con una concentración que permitirá alcanzar el 100% de confluencia. Nota: Para RASMCs ese número se determinó que era de 100.000 células / cm ^2. Sin embargo, debido a la pérdida de células durante el paso, 120% de que va se utiliza Lue.
9. Coloque en una incubadora a 37 ° CO / N. Nota: Es importante mantener las células a 37 ° C para mantener la adhesión de células a la placa.

3 Preparación de Matrix Foundational

Nota: Varias matrices fibrosas 3D se pueden utilizar para la capa matriz fibrosa fuerte entre las láminas de células delicadas. Algunos ejemplos incluyen: espuma de gel, bioglass, materiales naturales acellularized ²⁶ o nanospun materiales ^27,28 La matriz de la vejiga urinaria porcino (UBM) utilizado en estos estudios fue proporcionado generosamente de nuestro colaborador, el Dr. Badylak ^29.

1. Antes de usar, determinar las características de la matriz, incluyendo la falta de contenido celular si se utiliza matriz descelulariza, ^27,28 viabilidad de células específicas, y el espacio vacío. ²²
2. Cortar la matriz de pre-esterilizados en un tamaño y forma deseados. Nota: Aquí, una perforadora se utiliza para cortar un círculo de diámetro 4 mm.

ve_title "> 4. células endoteliales Siembra en un neovascular permisivo hidrogel

Nota: Las células endoteliales se pueden obtener de una variedad de fuentes, incluyendo la diferenciación de las células madre o progenitoras. En este caso, se utilizan las HUVEC.

1. Utilice cualquier hidrogel permisiva (fibrina, geles de colágeno), siempre y cuando el tiempo de reticulación es suficientemente corto como para permitir que las células permanecen viables. Nota: En este caso, un gel de ácido hialurónico (HA), basado reticulado se utiliza con un puente disulfuro.
2. Preparar el hidrogel HA de acuerdo con el protocolo de empresa.
3. Recoger las células endoteliales y se dispersan en una solución de una sola célula utilizando tripsina 1x. Nota: Accutase o tampón de disociación celular también podrían utilizarse para la dispersión de células individuales.
4. Desactivar la enzima tripsina mediante el uso de una cantidad igual de inhibidor de tripsina de soja (si es importante que las células no entran en contacto con suero) o 10% de FBS en PBS, recogiendo la solución / células en un tubo cónico de 15 ml.
5. Cporte de las células, y calcular el volumen necesario para las dimensiones del parche (previamente cuantificados). Nota: Para obtener un parche de 4 mm, se utilizan aquí de 2 millones de células endoteliales.
6. Extraer 2 millones de células, y colocarlo en un nuevo tubo cónico de 15 ml.
7. Haga girar al (228 xg) durante 5 min.
8. Aspirar el sobrenadante, dejando las células como sedimento en un tubo cónico.
9. Mezclar los materiales líquidos de HA y gelatina en una ración de 1: 1. A continuación, añadir 80% del volumen total en el tubo cónico que contiene el sedimento.
10. Resuspender las células endoteliales en la 1: / mezcla de gelatina 1 HA
11. Colocar las células en suspensión en la mezcla de HA / gelatina en la base de matriz fibrosa de la Etapa 2.
12. Añadir un quinto (20 por ciento) del volumen total deseado de la reticulante
13. Incubar durante 1 hora a 37 ° C.

5. Aislamiento de láminas de células

1. Retire las placas tratadas con PNIPAAm 35 mm que contienen las células de la incubadora y el lugar en una campana de cultivo celular aRT.
2. Aspirar rápidamente el medio de las células, y añadir 2 ml de 6% de gelatina normal que se ha calentado a 37 ° C.
3. Mientras que la gelatina está todavía caliente, coloque la retícula de metal en la gelatina, sumergiéndolo debajo de la superficie de la gelatina normal (Película 1).
4. Toda la placa sobre hielo durante 5 a 7 minutos, lo que permite que la gelatina se endurezca.
5. Después de 7 min, utilizar una espátula para separar cuidadosamente los bordes de gelatina desde el lado de la placa, y luego usar fórceps para levantar la retícula de metal de la placa Nota: La gelatina 6%, y la lámina de células debe levantar con la red.
6. Mueva la lámina de células a la placa y se coloca en la parte superior de la combinación de matriz de hidrogel de base fibroso, estableciendo cuidadosamente la red en la parte superior de la construcción. Nota: El lado apical de la lámina de células todavía estará en la posición superior.
7. Añadir 2 ml de medio caliente (37 ° C).
8. Incubar O / N permitiendo que la lámina de células para adherirse a la superficie del hidrogel.
9. Retire tretícula de metal después de que la solución se calienta (aproximadamente 1 hora), o al día siguiente.

Resultados

El diagrama de flujo (Figura 1) muestra el método general de hacer que el parche de varias capas. Láminas de células se separan de la placa tratada PNIPAAm dejando caer la temperatura por debajo de 32 ° C. A continuación, la lámina de células se coloca en la parte superior del hidrogel reticulado que contiene las células endoteliales sembradas en la matriz fibrosa subyacente (Figura 1). Las placas termo-sensible pretratados también se pueden utilizar para crear las láminas de ...

Discusión

Los pasos críticos en el protocolo incluyen: el revestimiento de las superficies de la placa con el polímero termosensible y la manipulación de las láminas de células después de enfriar las placas. Debido a que diferentes células exhiben diferentes propiedades físicas, como la adhesividad, el tiempo de elevación debe ser optimizada para cada tipo celular diferente. El segundo, y más desafiante significativamente componente de este protocolo, se centra en la manipulación de la capa celular, un aspecto crítico...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2	Lonza	CC-4149	Smooth Muscle Media
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Human Venous Endothelial Cells
HyStem	Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Specific Equipment
Filter paper	Ahlstrom	6310-0900
Buchner Funnel	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Plates	Nunc	2014-11
UV light	Jelight Company	UVO Cleaner Model No.42