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Resumen

El caracol marino Aplysia californica ha sido ampliamente utilizado como modelo neurobiológico para los estudios sobre bases celulares y moleculares del comportamiento. Aquí se describe una metodología para explorar el sistema nervioso de Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de neuronas individuales de circuitos neuronales identificados.

Resumen

Un desafío importante en neurobiología es entender los fundamentos moleculares de los circuitos neuronales que gobiernan un comportamiento específico. Una vez identificados los mecanismos moleculares específicos, se pueden desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para tratar anomalías en comportamientos específicos causadas por enfermedades degenerativas o envejecimiento del sistema nervioso. El caracol marino Aplysia californica es muy adecuado para las investigaciones de las bases celulares y moleculares del comportamiento porque los circuitos neuronales subyacentes a un comportamiento específico podrían determinarse fácilmente y los componentes individuales de los circuitos podrían ser fácilmente manipulados. Estas ventajas de Aplysia han llevado a varios descubrimientos fundamentales de la neurobiología del aprendizaje y de la memoria. Aquí se describe una preparación del sistema nervioso Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de las neuronas individuales. Brevemente, el ganglio diseccionado del sistema nervioso se expone a la proteasa para eliminar la vaina ganglionar de tal manera que las neuronas están expuestas pero conservan la actividad neuronal como en el animal intacto. Esta preparación se utiliza para llevar a cabo mediciones electrofisiológicas de neuronas únicas o múltiples. Es importante destacar que, después de la grabación utilizando una metodología simple, las neuronas podrían aislarse directamente de los ganglios para el análisis de expresión génica. Estos protocolos se utilizaron para llevar a cabo grabaciones electrofisiológicas simultáneas de las neuronas L7 y R15, estudiar su respuesta a la acetilcolina y la cuantificación de la expresión del gen CREB1 en aislados de las neuronas L7, L11, R15 y R2 de Aplysia.

Introducción

El cerebro humano es extraordinariamente complejo con casi 100 mil millones de neuronas y billones de conexiones sinápticas. Hay casi un número igual de células no neuronales que interactúan con las neuronas y regulan su función en el cerebro. Las neuronas se organizan en circuitos que regulan comportamientos específicos. A pesar de los avances en nuestra comprensión de las funciones cerebrales y los circuitos neuronales, poco se sabe sobre la identidad de los componentes de los circuitos que controlan un comportamiento específico. El conocimiento de las identidades de varios componentes de un circuito facilitará grandemente nuestra comprensión de la base celular y molecular del comportamiento y ayuda en el desarrollo de las estrategias terapéuticas nuevas para los desordenes neuropsiquiátricos.

El caracol marino Aplysia californica ha sido un caballo de batalla para determinar los circuitos neuronales subyacentes a comportamientos específicos1-14. El sistema nervioso de Aplysia contiene aproximadamente 20.000 neuronas que se organizan en 9 ganglios diferentes. Las neuronas de Aplysia son grandes y se pueden identificar fácilmente en función de su tamaño, propiedades eléctricas y posición en los ganglios. Aplysia tiene un rico repertorio de comportamientos que pueden ser estudiados. Uno de los comportamientos bien estudiados es el reflejo branquial-abstinencia (GWR). Los componentes centrales de este reflejo están situados en los ganglios abdominales. Se han mapeado componentes de los circuitos GWR y se han determinado las contribuciones de varios componentes. Es importante destacar que los circuitos GWR se someten a aprendizaje asociativo y no asociativo5,6,15-19. Décadas de estudio sobre este reflejo también han identificado varias vías de señalización que tienen un papel clave en el aprendizaje y la memoria20-24.

Varias preparaciones diferentes de Aplysia se utilizaron para estudiar las bases celulares y moleculares del almacenamiento de la memoria. Estos incluyen el animal intacto2,3,la preparación semi-intacta1,7,13,14,16 y la reconstitución de los principales componentes de los circuitos neuronales25-29. Una preparación reducida para explorar los ganglios de Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de circuitos neuronales identificados se describe aquí. Las cuatro neuronas identificadas siguientes fueron estudiadas. R15, una neurona que estallaba, L7 y L11, dos diversas neuronas de motor y R2, una neurona colinérgica fueron estudiados. R2 es la neurona más grande descrita en el sistema nervioso de los invertebrados. Brevemente, esta metodología implica el tratamiento proteasa de ganglios, mediciones electrofisiológicas antes y después de los tratamientos farmacológicos, y el aislamiento de neuronas individuales para el análisis cuantitativo de la expresión génica. Esta metodología nos permite combinar análisis moleculares con el registro simultáneo de múltiples neuronas. Esta metodología se utilizó con éxito para estudiar las respuestas de las neuronas R15 y L7 a la acetilcolina (Ach) por grabaciones intracelulares emparejadas. Después de mediciones electrofisiológicas R15 y L7 y otras neuronas identificadas como L11 y R2 se aislaron para el análisis cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) de la expresión de CREB1, un factor de transcripción importante para el almacenamiento de memoria.

Protocolo

1. Preparación De Ganglios Abdominales, Mediciones Electrofisiológicas, Y El Aislamiento De Las Neuronas Individuales Identificadas Del Ganglio Abdominal De Aplysia californica

  1. Mantenga Aplysia en el acuario de laboratorio con agua de mar artificial circulante (ASW) a 16 ° C bajo condiciones de luz: oscuras de 12:12.
  2. Aislamiento del ganglio abdominal.
    1. Anestesiar a los animales inyectando 380 mM mgCl2 solución durante 5-10 min (equivalente al 30-35% del peso corporal del animal).
    2. Identificar el ganglio abdominal en función de su posición en el sistema nervioso central24,28.
    3. Retirar los ganglios mediante operación quirúrgica y almacenarlos inmediatamente en agua de mar artificial consistente en 450 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 10 mM de CaCl2,55 mM de MgCl2,2,5 mM de NaHCO3,y 10 mM de HEPES (pH 7,4).
  3. Tratamiento con proteasas.
    1. Incubar ganglio abdominal durante 30 min a 34 °C±0,5 en una placa de Petri con proteasa (dispase) al 0,1% diluida en ASW descrita anteriormente.
      NOTA: La cantidad de la proteasa utilizada debe estandarizarse con la edad y el peso de los animales. En general, los animales más viejos y más grandes requerirían más proteasa.
  4. Retiro de la envaesda de los ganglios.
    1. Después del tratamiento enzimático, fije los ganglios a la base de silicona de Sylgard de una cámara celular (Ø = 1 cm; vol. = 0,3 ml) y perfunda con ASW (caudal: 150 μl/min) a temperatura ambiente (18 °C±2).
      NOTA: Con el fin de aumentar la visibilidad de las neuronas identificadas, coloque el ganglio en la parte superior de un cilindro de vidrio de policarbonato(Figura 1)(diámetro Ø = 2 mm de cámara celular modificada) que se puede iluminar fácilmente desde la parte inferior utilizando un estereomicroscopio binocular con aumento de 20X y 40X.
    2. Retire cuidadosamente la vainquia del ganglio mediante el uso de tórceps y microscisores.
  5. Grabación electrofisiológica simultánea de dos neuronas.
    1. Identificar la neurona de interés.
    2. Empalar la neurona con un solo microelectrodo agudo intracelular con resistencia 10-15 MΩ lleno de 3 M KCl solución.
    3. Registre la actividad neuronal (paso de banda de 10 kHz) utilizando un sistema de grabación intracelular.
    4. Procese los datos de registro utilizando software de electrofisiología como Axograph.
      NOTA: Uno puede llevar a cabo fácilmente la grabación de múltiples neuronas. Las neuronas L7, L11 o R15 y R2 se identifican fácilmente en función de su posición. Se requieren dos amplificadores y dos micromanipuladores para grabar simultáneamente desde dos neuronas L7 y R15 (Figura 2).
  6. Aplicación de fármacos.
    1. Aplicar el fármaco de elección en la cámara celular por pipeteo suave o inyectar directamente en las neuronas.
    2. Realizar mediciones electrofisiológicas.
      NOTA: Dependiendo del objetivo experimental, se podrían medir diferentes parámetros electrofisiológicos de las neuronas como los cambios en el potencial de membrana (MP) o el potencial de acción (AP) antes, durante y después de la aplicación del fármaco.
  7. Aislamiento de neuronas individuales.
    1. Al concluir los experimentos electrofisiológicos, detenga la perfusión de ASW y lave el ganglio con etanol al 100%.  La exposición al etanol petrificará las neuronas y, usando los pórceps finos, hará que sea fácil quitar las neuronas individuales sin dañar otras neuronas del ganglio.
    2. Retire las neuronas individuales debajo de un estereomicroscopio y transfiérelo a un pequeño tubo de Eppendorf que contenga un reactivo de extracción de ARN de 500 μl helado. Las neuronas individuales aisladas se pueden almacenar en reactivos de extracción de ARN a -80 °C para futuros análisis.

2. Aislamiento de ARN de neuronas individuales y análisis de expresión génica por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)

  1. Precauciones para minimizar la degradación del ARN:
    Las ribonucleasas (RNasas) degradan el ARN y son enzimas muy estables y activas. Siga estos pasos durante el manejo de los ENR.
    1. Limpie el área de trabajo y los instrumentos con agentes desactivadores de RNase.
    2. Use guantes en todo momento mientras manipula el ARN y cámbiese los guantes con frecuencia.
    3. Use solo plásticos libres de ARNsa para manejar los ARNs.
  2. Aislar el ARN total de las neuronas individuales:
    1. El protocolo trizol estándar para el aislamiento de ARN se puede utilizar para aislar LOS ARN de neuronas individuales. Añadir brevemente 20% v/v de cloroformo a Trizol, mezclar bien por breve vórtice.
    2. Coloque los tubos en el rotador durante 10 min a 4 °C. Haga girar la mezcla Trizol-Cloroformo a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
    3. Recoger la fase acuosa y transferir a un tubo fresco.
    4. Añadir solución de acetato de sodio (pH 5,5) a una concentración final de 0,3 M, 100 ng/ml del coprecipitante GlycoBlue, y 2,5 volúmenes de etanol al 100% para precipitar el ARN.
    5. Mezcle bien las muestras e incube a -80 °C durante la noche.
    6. Gire las muestras a 12.000 x g durante 20 min a 4 °C y un pequeño pellet azul será visible en la parte inferior del tubo.
    7. Retire el sobrenadante y lave el pellet con 850 μl de etanol helado al 75% a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    8. Retire el sobrenadante con cuidado y seque al aire el pellet de ARN durante 7-10 min, máximo.
      NOTA: Asegúrese de que el ARN no se deja secar durante mucho tiempo como encima-secar el pellet de ARN hace que la solubilización sea muy difícil.
    9. Una vez secado, resuspend el pellet de ARN en 10 μl de agua libre de RNAse y determinar la concentración de ARN.
      NOTA: Determine la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro. Cuando no se use de inmediato, guarde el ARN a -80 °C.
  3. Síntesis de aRNA a partir de neuronas individuales:
    1. Amplificar el ARN (una o dos rondas dependiendo del objetivo experimental) utilizando el sistema de amplificación de ARN lineal disponible en el comercio.
      NOTA: El ARN total de neuronas individuales varió de ~10-60 ng. El rendimiento esperado de la primera ronda de amplificación es de ~ 100-300 ng y la segunda ronda de amplificación es de ~ 0.8-1.5 μg de ARN.
  4. Transcripción inversa del ARN:
    1. Para generar ADNc a partir de aRNA, utilice 1,0 μg de ARN en 20 μl de una reacción de transcripción inversa. Varios kits están disponibles comercialmente para este propósito.

      NOTA: El ADNc se sintetizó de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando los siguientes ajustes en el ciclador térmico.
      5 min a 25 °C
      30 min a 42 °C
      5 min a 85 °C
      Mantener a 4 °C
    2. Después del paso de transcripción inversa, almacene el ADNc a -20 °C para el almacenamiento a largo plazo.
  5. Diseño y estandarización de cebadores:
    Varios programas de software excelentes están disponibles, de forma gratuita, para el diseño de cebadores para amplificaciones en tiempo real.
    1. Seleccione 18-24 oligonucleótidos de mer que produzcan amplicones de 70-110 pb y sintetice los cebadores utilizando fuentes comerciales.
      NOTA: Se deben diseñar de dos a tres pares de cebadores para cada gen de interés. Cada conjunto de cebadores debe ser estandarizado por qPCR. Los pares de cebadores delanteros e inversos que se utilizaron para el gen CREB1(Figura 4)son los siguientes:

      Juego de cebadores 1
      Adelante: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3'
      Reverso: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
      Juego de cebadores 2
      Delantero: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'

      Reverso: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'
    2. Para seleccionar el mejor cebador que se utilizará para los análisis aguas abajo, monitoree el valor de Ct y la forma de la curva de amplificación en qPCR.
      NOTA: Los cebadores que dan valores de Ct (Umbral de ciclo) entre 10-35 en la amplificación de 40 rondas y curvas suaves durante la fase exponencial de la PCR seguida de una meseta suave son óptimos para los análisis de expresión génica.
  6. PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR):
    Nota: Utilice tubos o placas apropiados que sean compatibles con la máquina qPCR.
    1. Diluya el ADNc a 5x con agua libre de nucleasa.
    2. A 2 μl de ADNc diluido, agregue 8 μl de una mezcla maestra qPCR que contenga 2 μl deH2O, 5 μl de 2x mezcla maestra verde SYBR y 1,0 μl de imprimación directa e inversa de 10 μM (cada una).
    3. Cierre los tubos y selle la placa después de pipetear el ADNc y la mezcla maestra. Mezcle el contenido tocando suavemente y girando hacia abajo a 1.500 rpm durante 30 segundos.
    4. Proceda a configurar la máquina qPCR.

Resultados

Los pesos de los animales que fueron utilizados en este estudio se extendieron a partir del 100-200 g. Siguiendo los protocolos descritos, se realizaron mediciones electrofisiológicas y análisis moleculares de neuronas de ganglios abdominales aislados de animales que oscilaban entre 2-5 g y 200-300 g.

La estandarización del tratamiento con proteasa es importante para el éxito de las mediciones electrofisiológicas de las neuronas en los ganglios. Inicialmente, se utilizaron concentraciones...

Discusión

La neurona R15 participa en la regulación de los sistemas cardiovascular, digestivo, respiratorio y reproductivo30. Una actividad que estalla regularmente rítmica del AP es una característica de R15. Como se muestra en la sección de resultados, el registro emparejado de R15 y L7 muestran que la preparación de los ganglios ha preservado la actividad de las neuronas R15. Las neuronas R15 y L7 respondieron apropiadamente a Ach. Esta preparación de los ganglios se podía mantener hasta 8-10 horas y la activi...

Divulgaciones

Los autores no tienen ningún interés financiero en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos sinceramente a la Fundación Whitehall por su apoyo financiero y fondos de inicio del Scripps Research Institute por llevar a cabo este trabajo.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AplysiaNational Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaClSIGMAS 3014-1KG
KClSIGMAP 9333-500G
CaCl2•2H2OSIGMAC5080- 500G
MgCl2•6H2OFisher ScientificBP 214-501
NaHCO4SIGMAS 6297-250G
HEPESSIGMAH 3375-500G
ProteaseGIBCO17105-042
TrizolAmbion15596-026
ChloroformMP Biomedicals2194002
100% EthanolACROS64-17-5
GlycoBlueAmbionAM9515
3 M NaOAc, pH 5.5AmbionAM9740
Nuclease free waterAmbionAM9737
MessageAmp II aRNA Amplification KitAmbionAM1751
qScript cDNA SuperMixQuanta Biosciences95048-100
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
ForcepsFine Science Tools11252-20
ScissorsFine Science Tools15000-08
Stainless Steel Minutien Pins Fine Science Tools26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal CyclerApplied BiosystemsVeriti Thermal Cycler
5430R CentrifugeEppendorf5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCRApplied Biosystems7900HT Fast Real-Time PCR
AmplifierBRAMP-01RNPI Electronics
Digidata ConverterInstrutech ITC-18HEKA ELEKTRONIK
Micro ManipulatorPatch StarScientifica

Referencias

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