Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

Resumen

Hemos establecido un fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para la detección de un genoma del virus de ADN persistente dentro de las secciones de tejido de modelos animales. Este protocolo permite el estudio de proceso de infección por codetection del genoma viral, sus productos de ARN, y proteínas virales o celulares dentro de las células individuales.

Resumen

Codetection célula individual de un gen, su producto de ARN y proteínas reguladoras celulares es fundamental para estudiar la regulación de la expresión génica. Este es un reto en el campo de la virología, y en particular para los virus de ADN persistentes nucleares-replicantes que involucran modelos animales para su estudio. Tipo de virus del herpes simple 1 (VHS-1) establece una infección latente de por vida en neuronas periféricas. El virus latente sirve como reservorio, de la que se reactiva e induce un nuevo episodio herpética. La biología de las células de HSV-1 latencia sigue siendo poco conocida, en parte debido a la falta de métodos para detectar HSV-1 genomas in situ en modelos animales. Se describe un ADN de hibridación in situ fluorescente (FISH) enfoque detectar de manera eficiente bajo número de copias de genomas virales dentro de las secciones de los tejidos neuronales de modelos animales infectados. El método se basa en el antígeno desenmascarar a base de calor, y las sondas de ADN caseras directamente etiquetados, o sondas disponibles en el mercado. Hemos desarrollado una triple staienfoque ning, combinando ADN-FISH con ARN-FISH e inmunofluorescencia, utilizando amplificación de la señal peroxidasa basado para dar cabida a cada requerimiento de la tinción. Una mejora importante es la capacidad para obtener, dentro de 10 micras secciones de tejido, las señales de baja fondo que se pueden obtener imágenes en alta resolución por microscopía confocal y de campo amplio de epifluorescencia convencional. Además, la triple tinción trabajó con una amplia gama de anticuerpos dirigidos contra proteínas celulares y virales. El protocolo completo tarda 2,5 días para dar cabida a anticuerpo y penetración de la sonda dentro del tejido.

Introducción

Tipo de virus del herpes simple 1 (VHS-1) es un virus neurotrópico humano persistente, establecer una infección latente a largo plazo en las neuronas de los ganglios del trigémino (TG) del sistema nervioso periférico, de la que se reactiva periódicamente para replicar y propagarse. El HSV-1 del genoma es un ADN de doble cadena 150 kb de localización en el núcleo de la neurona de acogida donde permanece plásmidos cromatinizados como multicopia, que no se integran en el genoma de la célula huésped ^1,2. Durante la latencia, el programa genético de HSV-1 ciclo de replicación está fuertemente reprimida, y la expresión génica está restringida a la transcripción asociado a la latencia (LAT) locus, de establecimiento de latencia de la iniciación de la reactivación ^3. LAT produce una larga 8,5 kb no codificante ARN procesado en un importante 2 kb lazo estable, y varios miARN ^4-7. HSV-1 latencia se caracteriza, pues, por la presencia del ADN viral genómico, ARN LAT, y la ausencia de las proteínas del ciclo de replicación detectables.

ONTENIDO "> Los modelos animales, predominantemente de ratón y conejo, son modelos experimentales que recapitulan varias características de latencia en humanos. Uno de los principales intereses de esos modelos es que permiten estudiar los aspectos fisiológicos de HSV-1 latencia en huéspedes inmunocompetentes. Durante las últimas décadas , muchas herramientas experimentales, tales como virus y ratones modificados genéticamente, se han desarrollado para estudiar la fisiología, la genética y la biología celular de HSV-1 latencia, de tejidos animales. Hasta ahora, se detectó ADN genómico vírico y se cuantificó mediante Southern blot y qPCR de disociado TG. Sin embargo, actualmente no existe ningún método disponible para detectar el HSV-1 del genoma mediante hibridación in situ en secciones de tejido ^8. En consecuencia, la latencia se evalúa rutinariamente en secciones histológicas a través de la detección de ARN LAT por ARN hibridación in situ en lugar de la detección del genoma viral. Debido a que ha sido imposible caracterizar las células infectadas basado en la presencia de genomas virales, this limitación técnica ha sido un inconveniente importante para el análisis de muchos aspectos de las interacciones huésped-virus, tales como la relación entre el genoma viral y la expresión génica celular y viral o la respuesta inmune mediada por células huésped ^9,10.

Lo más importante, la heterogeneidad de célula a célula de la infección latente sigue siendo relativamente inexplorada y se ha demostrado que una característica clave de la latencia en ratones y en las neuronas ganglionares de la sensoriales humanos implantados en ratones SCID ^11-17. Típicamente, se demostró por qPCR que el VHS-1 genoma número de copias por célula varía de 5 a varios cientos. Aunque LAT aparece como un regulador clave de la latencia y la reactivación, qPCR datos sobre las neuronas aisladas y PCR in situ indican que sólo un subconjunto de neuronas infectadas de forma latente, tan bajo como 30%, expresa el locus LAT ^11,12,18-21. ¿Cómo la célula huésped y el entorno celular en el impacto de tejido sobre el establecimiento y la latencia del virusla expresión génica viral sigue siendo poco clara. Aquí se describe un fluorescente robusta de hibridación in situ (FISH) método para la detección eficiente de bajo número de copia VHS-1 DNA genómico dentro de las secciones de tejidos animales neuronales. Este método ha sido diseñado y utilizado por nosotros para tener acceso a imágenes de microscopía de alta resolución que es necesario estudiar la interacción del genoma viral con los componentes intra-nucleares de la célula huésped ^22. Además, se describe un método de tinción múltiple para la detección simultánea del ADN viral con ARN y proteínas, que es una herramienta única para describir las interacciones virus-huésped que regulan la expresión génica viral. El método también se puede aplicar para una amplia gama de análisis que requieren la detección de HSV-1 del genoma latente, tales como la cuantificación de las neuronas infectadas en gran número de secciones. Un paso clave es aplicar el tratamiento de recuperación de antígeno para hacer el ADN viral accesibles a la hibridación. Por lo tanto, este protocolo también puede ser eficaz para la detecciónde otros virus de ADN de doble cadena, que en la actualidad no son detectables por métodos de DNA-FISH convencionales dentro de los tejidos animales.

Protocolo

Este método se utilizó en un estudio publicado previamente ^22. Para el fondo general y descripción de la manipulación convencional en ISH, IF y FISH, sugerimos la siguiente bibliografía disponible ^23.

1. Infección Animal

Todos los procedimientos con animales experimentales se ajustaban a las cuestiones éticas de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en la investigación, y fueron aprobados por el comité de ética local de la UPR-3296-CNRS, de acuerdo con la Comunidad Europea Directiva 86/609/CEE del Consejo. Todos los animales recibieron un acceso ilimitado a comida y agua.

El método de la infección del ratón con HSV-1 se describe a continuación ha sido utilizado en los estudios previamente publicados ^24-26.

1. Preparar las siguientes soluciones para prepararse antes de partida:
   
   Solución de HSV-1 de virus
   Anestesiar solución - KetaminaE-100 mg / kg y xilazina-10 mg / kg
   
2. Toma 1 l de virus (10 ⁶ ufp) en una microjeringa 5 l de vidrio conectado a un dispositivo de bomba microjeringa entregar 0,1 l / seg Nota:. Resuspender el stock de virus en un medio libre de rojo fenol para ver el límite entre el aceite rojo presentar en el capilar y la solución del virus y para evitar la inyección de aire en el sitio de la inoculación del virus.
3. Coloque el ratón anestesiado (ketamina-100 mg / kg y xilazina-10 mg / kg) en su parte posterior hacia arriba.
4. Coloque la cabeza del ratón anestesiado bajo un microscopio estereoscópico binocular e insertar la aguja en la capa subepitelial del labio superior izquierda en la frontera mucocutánea. Se inyecta la solución de virus en dos pasos (dos veces 0.5 mu l) a una velocidad de 0,5 l cada 5 s Note:. Respetar una pausa de 10 segundos entre las dos inyecciones de 0,5 mu l, para permitir la suspensión viral para absorber en el sitio de la inyección.
5. Coloque el ratón enun 37 ° C incubadora hasta despertar.
6. Deje el ratón en las instalaciones de los animales que se recuperaran durante el tiempo requerido Nota:. En el modelo de ratón, HSV-1 induce una infección primaria, llamada infección aguda, que dura menos de 10 días en el sitio de la inoculación y dentro de varios tejidos neuronales incluyendo TG, ganglios cervical superior (SCG), y los ganglios de la raíz dorsal (DRG) dependiendo del sitio de inoculación. Los signos de la infección primaria desaparecen progresivamente y la latencia se considera plenamente establecido unos 28-30 días después de la infección (dpi) en adelante. Tejidos neuronales se pueden cosechar por lo general de 4 dpi para los estudios sobre la infección aguda, y de 28 dpi para los estudios de latencia.

2. Ratón de perfusión-fix

1. Preparar las siguientes soluciones antes de empezar: 50 ml de tampón salino fisiológico
   
   60 ml de PBS 1x
   150 ml de recién preparada de paraformaldehído al 4% en PBS 1x
   60 ml de sacarosa al 20% en PBS 1x.
   
2. Preparar el tubo de perfusión: conectar la aguja a un capilar, que está conectado a una bomba peristáltica.
3. Anestesiar el ratón como se describe anteriormente (PAER 1,2) y lo pondré sobre la espalda a una bandeja de disección, concedida por las cuatro patas con alfileres.
4. Usando tijeras cortan la piel del vientre hasta la garganta *. Arranca la delgada capa de tejido que recubre los órganos. Abra la caja torácica por el corte de las costillas en un lado del esternón. Quitar la piel arrancando. Aléjese de unos a otros la partes derecha e izquierda de la caja torácica para revelar el corazón Nota:. Tenga cuidado de no incidir las agallas, los pulmones y los vasos grandes (arterias carótidas y venas yugulares), lo que hará perfuse fijación imposible.
5. Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo *. Incisión en la aurícula derecha con las tijeras. Proceda con desangramiento mediante la inyección de 20 ml de solución salina fisiológica en los vasos sanguíneos en el corazón. Que el flujo de sangre en la bandeja. No seTE: Durante este procedimiento, prestar atención de no perforar a través del otro lado del corazón.
6. Perfundir con 150 ml de PFA al 4% en 1x PBS durante 15 min * (Atención: PFA es tóxico, manipular bajo vitrina extractora). Perfundir 60 ml de 20% de sacarosa en PBS 1X durante 6 min. En esa etapa el ratón está listo para la cosecha TG Nota:. Ajuste la bomba a 10 ml / min. Una buena perfusión es notable cuando la cola del ratón se pone rígido, alza luego caer de nuevo.

3. TG cosecha

1. Preparar la solución siguiente antes de comenzar:
   
   20% de sacarosa en PBS 1x
   
2. Cortar la cabeza a nivel del cuello. Corte la punta de la nariz justo detrás de los incisivos con el fin de revelar la cavidad de la nariz. Incisión en el paladar en dos con unas tijeras y se alejan cada lado del paladar Nota:. El TG aparece justo debajo de la boca, como dos masas blancas y alargadas de 2-3 mm de longitud situado a la derecha ylado izquierdo del campo y conectado al nervio trigémino.
3. Cortar las ramas del nervio trigémino en cada lado de los TG para liberar los TG desde el tronco cerebral. Retire los TG con pinzas quirúrgicas y mantenerlos en una solución estéril de sacarosa al 20% durante 24 horas Nota:. Utilice dos receptores diferentes para la izquierda y la derecha TG, para evitar la confusión entre la TG izquierda (infectados) y el TG derecha (o no débilmente infectado). Incubar los TG en el 20% de sacarosa en 1x PBS durante 24 horas antes de clavarse.
4. Insertar los TG en un solo bloque en cryosectioning medio de inclusión y la congelación a -80 ° C.
5. Almacene bloques a -80 ° C hasta el corte.

4. Preparación criosección

1. Cortar las longitudinal GTs como 10 micras secciones en un -20 ° C criostato, y colóquelos en portaobjetos (30 ° C) Superfrost ligeramente calentado. Deje que las rodajas se secan durante 5-10 minutos y luego congelar y almacenar a -80 ° C hasta su uso Nota:. Hasta 4-5 secciones pueden ser placed en una sola diapositiva, si gran número de secciones es para ser procesados ​​al mismo tiempo. Se procede de la siguiente manera: secciones seriadas se depositan en 3 serie de diapositivas identificada A1, B1, C1 y, a continuación, A2, B2, C2 y así sucesivamente. Por lo tanto, cada serie de diapositivas (A, B, y C) se puede procesar para diferentes tinción (hibridación in situ, FISH, PCR in situ, LCM) y los datos obtenidos utilizando las diferentes técnicas se puede comparar sabiendo que las diapositivas que llevan el mismo número corresponden a la misma región de la TG.

5. HSV-1 sonda de etiquetado

El protocolo descrito a continuación para la detección de HSV-1 del genoma de ADN de pescado ha sido utilizado con éxito con dos tipos de sondas. La primera es una sonda fluorescente marcada con Cy3 hecho en casa, que es apropiado para la multa análisis de la organización nuclear dentro de las células individuales, por microscopía fluorescente de alta magnificación. La segunda es una sonda biotinilada disponible comercialmente, que se puede combinarD con amplificación de la señal a base de peroxidasa para proporcionar una señal brillante. Este último es adecuado para la identificación y cuantificación de virus que contiene las neuronas a bajo aumento en toda la sección, y para el análisis de los patrones de HSV-1 del genoma. Los usuarios finales deben evaluar qué método se ajusta mejor al objetivo de su estudio. La sonda comercialmente disponible aparece en la sección de reactivos, y la preparación de la sonda de fabricación casera se describe a continuación.

1. Preparar las siguientes soluciones antes de comenzar:
   
   HSV-1 del genoma que contiene vectores (ver paso 1)
   Etanol al 70%, de grado biología molecular.
   
2. . Preparar cósmidos que contienen porciones de 30 kb de HSV-1 genomas (cósmidos número 14, 28, y 56 describen en la referencia ²⁰ utilizando columnas de purificación reservados a los grandes vectores Nota: Otro tipo de bibliotecas que contienen el VHS-1 genomas, tales como cromosomas artificiales bacterianos debe funcionar tan bien, siempre y cuando la sonda cubre alporción arge del HSV-1 genoma para producir la señal sea suficiente ^27-29. En nuestras manos, sondas hechas a partir de la columna vertebral vector cósmido no produjeron ninguna señal, y se utilizaron como control negativo. Vectores cósmidos lo tanto enteras que contienen el VHS-1 de secuencia fueron utilizados en nuestro estudio. También es posible cortar la secuencia de HSV-1 y lo utilizan para preparar la sonda.
3. . Etiqueta 2 g de cada cósmido con Cy3-dCTP utilizando un kit de traslación de mella de acuerdo con las directrices del fabricante Nota: Realizar etiquetado con una mezcla de reacción que contiene sólo Cy3-dCTP y sin dCTP no marcado.
4. Detener la reacción mediante la adición de 3 l de EDTA 0,5 M en la mezcla y calentamiento a 70 ° C durante 10 min. Enfriar en hielo.
5. Purificar la sonda en un minicolumna exclusión en gel G50. Añadir 150 g de ADN de esperma de salmón a la sonda y precipitar la sonda por precipitación con etanol. El sedimento de ADN debe ser de color rosa debido a la incorporación Cy3. Lavar el precipitado con etanol al 70% y eliminar la mayor cantidad de etanolcomo sea posible con una pipeta. No deje que el sedimento seco.
6. Disuelva la pastilla con 100 l de formamida desionizada (Precaución: formamida es tóxico Manipular bajo campana extractora.). La concentración de la sonda no puede ser medido de forma fiable en este punto. Las cantidades de sondas mencionadas en el texto se refieren a la cantidad de la plantilla de ADN utilizado para hacer la sonda. El protocolo se basa en 2 g de plantilla de ADN y 100 l de formamida, que se considera que es de 20 ng / l. Almacenar a -20 ° C. La sonda marcada se puede preparar en gran cantidad y se almacenó congelado durante varios meses.

6. DNA-FISH

La figura 1 muestra una visión general de las principales etapas del protocolo DNA-FISH, y cómo realizar DNA-FISH como parte de un experimento de tinción múltiple para codetect ARN y proteínas, tal como se describe en los Protocolos 7-9.

1. Preparar las siguientes soluciones antes de comenzar:
   
   0,5% de Triton X-100 en PBS 1x
   2x SSC y tampón SSC 0,2 x
   PH 100 mM pH 6,0 tampón citrato (10x solución de reserva) y 10 mM de tampón citrato 6,0 (solución de trabajo)
   Tampón de hibridación 2x ​​(ver Protocolo n º 4)
   
2. El día 1, coloque los portaobjetos en un soporte de diapositivas a temperatura ambiente, y dejar que las secciones se sequen durante 10 min. Encierra en un círculo las secciones con un lápiz hidrofóbico. Rehidratan las secciones en 1x PBS durante 10 min. Incubar las secciones 20 minutos con 0,5% de Triton X-100 en PBS 1x para permeabilizar el tejido. Lave 3x 10 min con 2x SSC, y mantenerse en 2x SSC hasta que se calienta el tampón desenmascaramiento (ver abajo).
3. Para desenmascaramiento, preparar una bandeja portaobjetos de vidrio (capacidad de 20 diapositivas) lleno con 200 ml de 10 mM de tampón de citrato de sodio (pH 6,0). Colocar la bandeja en un recipiente más grande llena con 500 ml de agua destilada. Esta configuración permite un mejor control de los impulsos de calefacción. Antes de colocar las diapositivas en la bandeja, precalentar el buffer en el horno de microondas hasta que el buffer llega a ebullición (unos 8 minutos a 800 W).
4. Colocar los portaobjetos en la bandeja que contiene tampón citrato-precalentado, y compruebe que están completamente cubiertos con tampón. El calor durante unos 20 segundos hasta que el buffer llega a ebullición. Cuidado, no deje que el tampón durante ebullición, lo que podría dañar el tejido. Enfriar a temperatura ambiente durante 2 min. Repetir el ciclo de calentamiento 6x (7 ciclos de calentamiento en total) *. Enfriar 2 min y transferir las diapositivas en 2x SSC durante 5 min.
   Nota *: Este es uno de los pasos más críticos. El número óptimo y la duración de ciclos de calentamiento deben ser determinadas empíricamente, y pueden variar en el tipo de tejido o del tipo de sonda utilizada. El horno de microondas, bandeja, recipiente y el volumen de tampón en la bandeja y el agua en el recipiente debe mantenerse idénticos para la reproducibilidad de desenmascaramiento. El exceso de ebullición podría resultar en la pérdida de tejidos y células dañadas. Para cada impulso de calentamiento, la aparición de ebullición se vigila cuidadosamente, y el calorción se debe detener en primeras señales de ebullición. Una vez configurado, desenmascaramiento aparece robusto y reproducible. Figura 2A muestra que el VHS-1 genoma puede ser detectado por desenmascarar con diferentes tampones, lo que indica que las condiciones de desenmascaramiento se pueden explorar aún más. Desenmascarar a base de citrato fue encontrado para proporcionar de forma coherente buena señal de FISH, y la conservación del tejido, con secciones de diferentes modelos animales y en laboratorio.
5. Incubar los portaobjetos en una mezcla de metanol: ácido acético: mezcla de PBS (03:01:04) durante 15 min, a continuación, en una mezcla de metanol: mezcla de ácido acético (3:1) durante 15 min (Precaución: ácido acético es corrosivo Manipular bajo de humos. capó y utilizar protección adecuada. Preparar esta solución justo antes de su uso).
6. Deshidratar la sección a través de sucesivas incubación de 10 min en el 70%, entonces 2x 10 min en etanol al 100%. Dejar secar a temperatura ambiente durante 10 min. Mantener seco hasta que el sondeo.
7. Preparar la solución de sondeo de la siguiente manera: preparar con antelación una reserva de 2x co tampón de hibridación 20 mlntaining sulfato de 20% de dextrano (PM 500.000), solución de Denhardt 2x, 4x SSC *. Alícuota de la solución como 500 l en microtubos y almacenar a -20 ° C. Para 1 diapositiva (cubreobjetos de 22 mm x 50 mm), mezclar 90 ng de HSV-1 sonda marcada con Cy3 (30 ng de la sonda para cada cósmido) y completar el volumen hasta 40 l con formamida. Añadir 40 l de tampón de hibridación 2x. Mezcle bien con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces.
   Nota *: Para preparar el tampón de hibridación 2x, la mezcla 4 g de sulfato de dextrano de PM 500.000 en 10 ml de agua destilada. Se hace una mezcla viscosa que se disuelven en 3-4 horas a 70 ° C. Mezclar con regularidad para ayudar a disolver. Añadir 4 ml de 20x SSC, 400 l de solución de Denhardt 100x. Completar hasta 20 ml y mezclar bien usando un vórtice.
8. Caiga 80 l de solución de sondeo sobre las secciones secas. Cubra con el cubreobjetos de 22 mm x 50 mm de cristal, y verificar que la solución de sondeo se extiende sobretoda la superficie del cubreobjetos. Precaución: no debe haber burbujas. Presencia de burbujas disminuye la eficiencia de la hibridación. Sellar el cubreobjetos utilizando cemento de goma, y ​​dejar secar. Mantenga las diapositivas de la oscuridad a temperatura ambiente durante al menos 2 horas para la señal de hibridación óptima en toda la diapositiva.
   Nota: El cemento de caucho es conveniente, ya que se seca rápidamente, es resistente al agua y protege la muestra se seque durante la hibridación. También es fácil de pelar para quitar el cubreobjetos después de la hibridación. El esmalte de uñas es una alternativa eficiente, pero la opción menos conveniente.
9. Proceder con la desnaturalización mediante la colocación de las diapositivas en una incubadora de diapositivas 80 ° C durante 5 min. Como alternativa, coloque las diapositivas en una bandeja de metal y colocar la bandeja en un baño de agua de 80 ° C (la bandeja debe flotar). A continuación, traslado rápidamente las diapositivas en una bandeja metálica colocada en hielo. Dejar reposar 5 min. Transfiera los portaobjetos a 37 ° C (calentador de diapositivas o incubadora) para la hibridación durante la noche.
   Nota: No se recomienda la hibridación más corto, lo que resulta en débil o no hay señal.
10. El día 2, quitar el cemento de goma con una pinza, mientras que el mantenimiento de la diapositiva en el calentador para mantener la sección a 37 ° C. Quite el cubreobjetos suavemente con la punta de una hoja de bisturí.
11. Lavar 3 veces con 2x SSC a 37 ° C durante 5 min, y tres veces con 0,2 x SSC a 37 ° C durante 5 min. Lavar una vez con 2x SSC a temperatura ambiente durante 5 min y proceder con la tinción de ADN y de montaje (véase el Protocolo 10 a continuación).
    Nota: Este método permite la detección de blancos genómicas celulares, mediante el uso de sondas correspondientes en la solución de sondeo junto con el VHS-1 sondas específicas según lo publicado por centromérica y secuencias pericentromeric ^22.

7. Dual FISH ARN-ADN

Consulte la Figura 1, las cajas verdes para un resumen general.

Para múltiplestinción procedimientos incluyendo un paso de ARN-FISH, se aconseja generalmente para realizar la primera detección de ARN como tal meta es sensible a la degradación por la ARNasa y los productos químicos. Además, el procedimiento de ADN-FISH incluye tratamientos que reducen la eficiencia de la otra tinción. Para ARN-FISH, se optó por un enfoque de detección enzimático basado (tiramida amplificación de señal (TSA) usando sondas biotiniladas y peroxidasa (HRP) de estreptavidina acoplada). TSA se basa en un sustrato tiramida fluorescente (véase la tabla reactivo para más detalles), que está unido covalentemente al tejido mediante una reacción enzimática de la peroxidasa. La señal de ARN-FISH se preserva así durante DNA-FISH.

1. Preparar las siguientes soluciones antes de comenzar:
   
   Vector para la transcripción in vitro de locus LAT (pSLAT-2)
   1x PBS que contenía 2 mM RVC
   0,5% de Triton X-100 en 1x PBS que contenía 2 mM de RVC
   3% de H ₂ 0 ₂ en agua destilada.
   70%, 80%, etanol al 95%, de grado biología molecular.
   Solución de hibridación de ARN 4x (ver Protocolo n º 4)
   
2. Por lo menos un día antes del experimento ARN-FISH, prepare la sonda FISH ARN. Para detectar el HSV-1 Asociado a Latencia Transcripción (LAT), preparar un ribo-sonda biotinilada de la pSLAT-2 vector de ^30, o de otro vector para la transcripción in vitro del locus LAT, como se describió anteriormente en referencia ^26. En pocas palabras: Linealizar 10 g de pSLAT-2 con HindIII y purificar el vector digerido con un kit de purificación de ADN. Sintetizar una hebra única ribo-sonda de 2 g de digerido pSLAT-2 con un kit T7 transcripción in vitro en presencia de biotina-16-UTP *. Se purifica la sonda con un mini columna de ARN y cuantificar a 260 nm usando un espectrofotómetro. Diluir la sonda a 50 ng / l en ADNasa / RNasa libre de agua y se almacenan a -80 ° C, en pequeñas alícuotas para evitar los ciclos de congelación-descongelación.
   Nota *: La biotina-16-UTP: relación de UTP debe ser determinada empíricamente. Nos found una relación de 40:60 para proporcionar sondas de detección eficiente LAT por el ARN-FISH.
3. El día 1, coloque los portaobjetos en un soporte de diapositivas a temperatura ambiente, y dejar que las secciones se sequen durante 10 min. Encierra en un círculo las secciones con un lápiz hidrofóbico. Rehidratar las secciones en 1x PBS que contenía 2 mM ribonucleósido Vanadyl Complex (RVC) * durante 10 min. Incubar las secciones durante 20 minutos con 0,5% de Triton X-100 en 1x PBS que contenía 2 mM de RVC para permeabilizar el tejido. Lave 3x 10 min con PBS 1x, 2 mM RVC. Para saciar cualquier actividad de la peroxidasa endógena, incubar la sección en el 3% de H ₂ O ₂ para 2x 10 min, y luego se lava una vez con PBS 1x, 2 mM RVC.
   Nota *: A lo largo del procedimiento de ARN-FISH, ribonucleósido de vanadilo complejo (RVC) se añade a los tampones y soluciones para evitar la degradación del ARN.
4. Incubar 2x 10 min en etanol al 70%. En esta etapa, las secciones pueden ser almacenados en etanol al 70% a -20 ° C durante varias semanas. Deshidratar las secciones mediante incubación en 80%, 95%, y 100% ETHanol, 5 min cada uno. Deje que la parte seca durante al menos 10 min.
   Nota: En algunos casos, el tratamiento con etanol puede ser perjudicial para la detección de otros objetivos. Un protocolo alternativo utilizando una etapa de prehibridación en formamida al 50% - 2x SSC puede ser utilizado (véase más adelante en el Protocolo 9 para obtener detalles sobre la tinción triple). Sin embargo, el tratamiento con etanol es el método más versátil para el ARN-FISH y proporciona el fondo más bajo.
5. Preparar la solución de sondeo de la siguiente manera: prepararse con anticipación a 10 ml de solución madre de una solución de hibridación de ARN que contiene 8x 4x SSC, 20x solución de Denhardt, EDTA 4 mM, 40% de dextrano *. Alícuota de la solución como 500 l en microtubos y almacenar a -20 ° C. Para 1 diapositiva preparar 80 l de solución (cubreobjetos de 22 mm x 50 mm), mezclando 20 ng de ribosonda LAT biotinilado, 40 ng de tRNA de levadura, 2 mM de RVC y completa a 20 l con agua. Añadir 20 l de solución de hibridación de RNA de 4x, y 40 lde formamida (concentración final 50%). Para facilitar el pipeteo y la mezcla, se recomienda precalentar la solución de hibridación de ARN 4x a 75 ° C. Mezcle bien con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces.
   Nota *: Para preparar la solución de hibridación de RNA 4x, la mezcla 4 g de sulfato de dextrano (PM 500.000) en 3 ml de agua destilada y 4 ml de 20x SSC. Se hace una mezcla viscosa que se disuelve en 3-4 horas a 70 ° C. Mezclar con regularidad para ayudar a disolver. Añadir 2 ml de 100x solución de Denhardt, y 80 l de una solución de EDTA 0,5 M. Completar hasta 10 ml con agua y mezclar bien usando un vórtice. Precaución: Use sólo la ARNasa / ADNasa productos gratuitos.
6. Desnaturalizar la sonda 10 min a 75 ° C. Mientras tanto, colocar los portaobjetos en un conjunto de diapositivas incubadora a 65 ° C. Caída de 80 l de solución de sonda en las secciones y rápidamente colocar un cubreobjetos sobre la gota. Precaución: no debe haber ninguna burbuja. Presencia de burbujas disminuye eff hibridacióniciency. La incubación tiene que tener lugar en una cámara húmeda desde el cubreobjetos no está sellado. Utilice una incubadora de diapositivas que puede contener el agua (véase la tabla de materiales), o preparar una cámara húmeda dentro de una caja sellada y colóquela en un horno de hibridación 65 º C.
7. Incubar durante una noche a 65 º C. Nota: LAT ARN-FISH se llevó a cabo a 65 ° C para evitar la unión no específica de la sonda, que se observa a 37 ° C. Muchas otras sondas de ARN-FISH deberían dar lugar a una buena señal a 37 ° C.
8. En el día 2, antes de comenzar el lavado, preparar los reactivos de detección de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de detección de TSA. La detección se realizó con un kit comercial de detección de TSA incluyendo una peroxidasa de rábano picante (HRP) y estreptavidina acoplada un sustrato fluorescente verde o azul.
9. Mantenga las diapositivas en el calentador de portaobjetos a 65 ° C. Retire con cuidado el cubreobjetos y rápidamente agregar 1 ml de formamida al 50% en 2x SSC, precalentado at 65 ° C. Cuidado, no dejes que la parte seca. Lavar dos veces 10 minutos a 65 ° C en el 50% formamida en 2x SSC 2x y 10 min en 2 x SSC a 65 ° C. Lavar una vez más con 2x SSC y colocar la placa en un calentador de diapositivas de 37 ° C.
10. Proceda con el paso de detección de acuerdo con las instrucciones del fabricante kit de detección de TSA. La concentración de HRP-estreptavidina, la concentración de sustrato fluorescente y el tiempo de reacción debe ser determinada empíricamente *. Para la detección de ARN LAT, que rutinariamente utilizó la siguiente condición: HRP-estreptavidina diluido a 1/500, reactivo fluorescente al 1/100 de la fluorescencia azul y 1/500 para la fluorescencia verde, y tiempo de reacción de 10 min. La señal se puede comprobar rápidamente con un microscopio de fluorescencia invertida sin montaje, antes de proceder con ADN-FISH.
    Nota *: El protocolo de amplificación será el diseño de acuerdo con los principales objetivos del experimento. Por ejemplo, para finamente localizar el ARN diana, que es adVISED utilizar el tiempo de reacción corto. En contraste, para identificar y contar las células positivas a bajo aumento rápidamente, el tiempo de reacción se puede aumentar para generar una señal brillante.
11. Para el ADN-FISH, siga el procedimiento indicado anteriormente, a partir de la etapa de desenmascaramiento (paso 6.2).

8. FISH-ADN Inmuno

Consulte la Figura 1, las cajas de color púrpura para un resumen general.

De manera similar a la ARN-ADN-FISH, se aconseja llevar a cabo primero la inmunofluorescencia, ya que el ADN-FISH es probable que desnaturalizar las proteínas y evitar su detección por anticuerpos. La calidad de la señal de inmunofluorescencia es altamente dependiente de las características de anticuerpos, y varios anticuerpos debe ser probado siempre que sea posible. Epítopo desenmascaramiento se realiza una vez antes de la inmunofluorescencia para mejorar tanto la detección de la proteína y ADN-FISH. Para preservar la señal de inmunofluorescencia en la muestra durante el procedimiento de ADN-FISH es necesario covalently vincularlo al tejido. Presentamos aquí dos enfoques que proporcionan buenos resultados en nuestras manos, la detección de anticuerpos después de la fijación y tiramida basada (véase el paso 8.5). La elección debe ser impulsada por las pruebas preliminares para cada par de destino / anticuerpo.

1. Preparar las siguientes soluciones antes de comenzar:
   
   1x PBS que contenía 3% de suero de cabra normal (NGS).
   2% PFA en 1x PBS (dilución de la solución madre 4%)
   
2. El día 1, los primeros pasos son idénticos a DNA-FISH, hasta la etapa de desenmascaramiento (pasos 6.1 a 6.2).
3. Después de desenmascarar, incubar las secciones con 1x PBS que contenía 3% de NGS durante 1 hora.
4. Incubar con el anticuerpo primario diluido en 1X PBS que contenía 3% de NGS durante 24 horas. Baja tiempo de incubación se puede utilizar para acortar el protocolo, aunque se encontró que una incubación durante la noche por lo general resulta en una señal más fuerte. Hasta 48 a 72 horas de incubación puede ser necesario para anticuerpos primarios de baja afinidad, tales como IgM.
5. En el día2, se lavan 3x 10 min con PBS 1x.
6. Protocolo con el anticuerpo después de la fijación: se incuba 1 hora con el anticuerpo secundario acoplado con un tinte fluorescente verde, a 1/200 en 1x PBS que contenía 3% de NGS. Lavar tres veces 10 min con PBS 1x. Posteriores a la fijación se realiza con 2% de PFA en 1x PBS durante 10 min *. Lave 3x 10 min con PBS 1x.
   Protocolo con detección de TSA: incubar 1 hora con el anticuerpo secundario acoplado a HRP a 1/250 en 1 x PBS que contenía 3% de NGS. Lavar tres veces 10 min con PBS 1x. Proceder con la detección de tiramida de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como se indicó anteriormente (paso 7.9), dilución de los reactivos y el tiempo de reacción debe ser determinada empíricamente. En la mayoría de los casos, nuestro protocolo se ha basado en una dilución 1/500 del sustrato fluorescente y un tiempo de reacción 10 min. Lave 3x 10 min con PBS 1x.
   Nota *: Post-fijación es un paso crítico en la inmuno-FISH, y requiere una cuidadosa puesta a punto. Cuanto más fuerte es la posterior a la fijación delmejor la señal de FI, y menor la eficiencia de ADN-FISH.
7. Proceda con DNA-FISH de la etapa de metanol-ácido acético (paso 6.3). Duración de inmuno-ADN-FISH es típicamente 3 días, con el primer anticuerpo se incubaron durante la noche.

9. Dual FISH ADN-ARN Junto con inmunofluorescencia

Consulte la Figura 1, las cajas de naranja para un resumen general.

ARN-FISH se lleva a cabo primero, seguida por inmunofluorescencia, y por último el ADN-FISH. Si inmunofluorescencia se detecta por reacción tiramida, es clave para saciar por completo la actividad de HRP en el paso de ARN-FISH con H ₂ O _2, y verificar que la extinción es eficiente. Esto se hace mediante el uso de una diapositiva como un control "sin anticuerpo primario".

Debido a la deshidratación a base de etanol es perjudicial para algunas proteínas sensibles a los solventes, este paso de ARN-FISH puede inhibir la inmunofluorescencia. Si es así, el ARN-FISH se puede realizar with un protocolo alternativo, como se detalla a continuación en STPE 9.3.

1. Preparar la solución siguiente antes de comenzar:
   
   50% de formamida en 1x PBS que contenía 2 mM de RVC
   
2. El día 1, preparar la sonda de ARN-FISH y proceder como para la doble ARN-FISH, hasta el H ₂ O ₂ etapa de enfriamiento (paso 7.2).
3. Caso 1, la tinción de inmunofluorescencia funciona después de la deshidratación de etanol: proceder con ARN-FISH como se indicó anteriormente en los pasos 7.3 a 7.9. A continuación, proceder al paso 9.6 a continuación.
4. Caso 2, la tinción de inmunofluorescencia se previene por tratamiento con etanol: Colocar los portaobjetos en una cámara humidificada sobre un calentador de portaobjetos ajustado a 65 ° C y se incuba durante 1,5 horas en una solución de prehibridación que contiene 50% de formamida, 1 x PBS, y 2 mM de VCR. Escurrir la solución de prehibridación y colocar 80 l de solución de hibridación, como se indica en los pasos 7.4 y 7.5. A continuación, proceder con la hibridación de ARN-FISH y la detección como abov indicadae en los pasos 7.6 a 7.9 (días 2 y 3).
5. El día 2, después de que se completó ARN-FISH, proceder con inmuno-ADN-pescado de partida con el paso de desenmascaramiento (véase el paso 6.2). A continuación, siga el protocolo de ADN-inmuno-FISH, como se indica más arriba en los pasos 8.2 a 8.6.

10. Montaje Slide and Imaging

1. Preparar la solución siguiente antes de comenzar:
   
   Hoechst 33342 a 0,5 mg / ml en PBS 1x
   
2. Núcleos mancha durante 10 minutos con DAPI o Hoechst 33342 * a 0,5 g / ml en PBS 1X durante 10 min. Lave 3x 10 min con PBS 1x.
   Nota *:. Precaución Si uno de los sistemas de detección utiliza un colorante azul fluorescente, no utilice DAPI o Hoechst. En su lugar, utilice una fluorescentes tintes de ADN con un espectro de emisión dentro de la longitud de onda del rojo lejano como Topro3.
3. Escurra la mayor cantidad de líquido posible de la diapositiva. Caída de 80 l de medio de montaje que contienen un agente antifading en un extremo de la corredera. Cubrir las secciones con una alta calidad ópticacubreobjetos (n ° 1.5 vidrio). Deje que el cubreobjetos bajar lentamente por su mantenimiento en un extremo con una pinza, con el fin de permitir que el medio de montaje, repartidas en la sección sin burbujas.
4. Selle con esmalte de uñas y se almacenan a 4 ° C en una caja de diapositivas oscuro.
5. La observación directa de señal de DNA-FISH de latentes de HSV-1 genomas requiere un aumento del objetivo 40X o mayor inmersión en aceite, con alta apertura numérica (por ejemplo 40X NA 1.1, 60X-63X NA 1.4, 100X NA 1.3) y una fuente de luz de excitación de por lo menos equivalente a una lámpara de mercurio de 100 W. Le aconsejamos el uso de un microscopio de transmisión de alta eficiencia como las previstas por los fabricantes en los últimos 5 años (véase el cuadro de los equipos). La microscopía confocal proporciona herramientas para recoger las imágenes con el fondo más bajo debido a la autofluorescencia de los tejidos, como el seccionamiento fino o imágenes espectrales.

Resultados

Después de varios meses de extensas pruebas, descubrimos que desenmascarar química basada en el calor hizo latente HSV-1 genoma disponible para la hibridación fluorescente in situ. Durante el proceso, hemos intentado diversos procedimientos desenmascarar y tratamientos sólo en base al calor (es decir, el calentamiento de las secciones hasta la temperatura sub-ebullición en un horno de microondas) aparecimos eficiente. A continuación, prueba varios tampones de sal que se utilizan rutinari...

Discusión

El protocolo descrito aquí permite la detección de HSV-1 del genoma latente dentro de las neuronas de ratón secciones de tejidos neuronales. Nuestra comprensión de las vías que regulan la expresión de genes virales se ha visto limitado por la falta de método para detectar el HSV-1 ADN genómico in situ dentro de los tejidos neuronales. La información sobre el número de copias del genoma y la proporción de las neuronas infectadas provino principalmente de análisis de PCR en las neuronas disoc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb/c mice	Janvier, France		6 week-old females
HSV-1 strains	SC16 strain (wild type)		See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.
Ketamine hydrochloride	Sigma	K2753	Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochloride	Sigma	X1251
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127	Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.
Physiological Saline	Sigma	07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7.4 (sterile)	Life Technologies	10010-015
Sucrose	Sigma	84100	Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS.
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound	SAKURA	4583
Large vector DNA purification kit	Qiagen	12462	To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C
Nick translation kit	Roche Applied Sciences	10 976 776 001
Cy3-dCTP	GE Healthcare	PA53021	Protect from light
0.5 M EDTA	Sigma	E6758
G50 Mini spin column	GE Healthcare	27-5330-01
Salmon sperm DNA 10 mg/ml	Invitrogen Life Technologies	15632-011
Ethanol molecular biology grade	Sigma	87047	Prepare a 70% solution
Salmon sperm DNA	Invitrogen Life Technologies	15632-011
Formamid Molecular biology grade	Sigma	F9037	Caution. Manipulate under fume hood.
HSV-1 biotinylated commercial probe	Enzo Life Sciences	ENZ-40838
ImmEdge hydrophobic pen	Vector Laboratories	H-4000
20x Saline Sodium Citrate (SSC)	Sigma	S6639	Prepare a 2x SSC solution in ddH20.
Triton X-100	Sigma	T8787	Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use.
10 mM Sodium citrate pH 6.0	Sigma	S1804	Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use.
Acetic Acid	Sigma	320099
Methanol, molecular biology grade	Sigma	322415
Dextran sulfate - MW 500,000	Euromedex	EU0606-A
Denhardt's solution (100x)	Euromedex	1020-A
Rubber Cement "FixoGum"	Marabut	290110000
DNA purification kit  - Qiaquick PCR purification kit	Qiagen	28104
T7 in vitro transcription kit	Ambion Life Technologies	AM1314
Biotin-16-UTP	Roche Applied Sciences	11388908910
RNA purification minicolumn	Qiagen	73404
Ribonucleoside Vanadyl Complex	New England Biolabs	S1402S
H2O2	Sigma	H3410	Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light.
Yeast tRNA	Invitrogen	15401011	prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000
Primary antibodies	any supplier		The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secondary fluorescent antibodies	Invitrogen Life Technologies		The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence)	Invitrogen Life Technologies	#T20937	TSA kits are also available from Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence)	Invitrogen Life Technologies	#T20932
Hoechst 33342	Invitrogen Life Technologies	H3570	Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution.
22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass	Electron Microscopy Sciences	72204-04
Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD	Vector Laboratories	H-1000	Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science
Superfrost glass slides	FisherScientific	12-550-15
Equipment/Material	Company	Reference	Note
Needle for infection			Glass micropipette hot drawn. Custom made.
Dissection equipment	Moria, France		Microsurgical scissors and forceps
Peristaltic pump	Cole Palmer Instruments		Easyload Masterflex
Microsyringe pump device (Nano Pump)	kdScientific	KDS310
Cryostat	Leica France	CM 1510-1
-80 °C freezer	Sanyo		Ultra Low -80 °C
Domestic microwave oven
Dry block heater	Eppendorf	022670204
Incubator Slide moat	Boekel Scientific	240000
Coplin Jar	Dominique Dutscher	68512
Staining glass container	Dominique Dutscher	68506
Fluorescent microscope	Zeiss		The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series