Inyección sistémica de Neuronales células madre / progenitoras en ratones con EAE crónica

Resumen

El trasplante de células madre / progenitoras neuronales (CPN) tiene grandes promesas en neurología regenerativa. La administración sistémica de NPC se ha convertido en el protocolo eficaz, de bajo invasiva, y terapéuticamente muy eficaz para entregar las células madre en el cerebro y la médula espinal de roedores y primates no humanos afectados por daño experimental inflamatoria crónica del sistema nervioso central.

Resumen

Células madre / precursoras neuronales (CPN) son una fuente prometedora de células madre para trasplante enfoques destinados a la reparación del cerebro o la restauración de la neurología regenerativa. Esta directiva ha surgido a partir de la amplia evidencia de que la reparación del cerebro se logra después focal o sistémica trasplante de NPC en varios modelos preclínicos de enfermedades neurológicas.

Estos datos experimentales han identificado la ruta de suministro de células como uno de los principales obstáculos de terapias con células madre de restauración para enfermedades cerebrales que requiere una evaluación urgente. Intraparenquimatosa injerto de células madre representa un enfoque lógico para aquellas patologías que se caracterizan por lesiones cerebrales aisladas y accesibles, tales como lesiones de la médula espinal y la enfermedad de Parkinson. Desafortunadamente, este principio es muy poco aplicable a condiciones caracterizadas por una naturaleza multifocal, inflamatoria y diseminada (tanto en tiempo y espacio), incluyendo la esclerosis múltiple (EM). Como tal, el cerebro dirigido por el sistla entrega de la APN emic se ha convertido en un protocolo invasiva y terapéuticamente eficaz bajo para entregar las células al cerebro y la médula espinal de roedores y primates no humanos afectados por experimental de daño inflamatorio crónico del sistema nervioso central (SNC).

Este método alternativo de suministro de células se basa en la pathotropism APN, específicamente su capacidad innata para (i) detectar el medio ambiente a través de las moléculas de adhesión de células funcionales y los receptores de citoquinas y quimioquinas inflamatorias; (Ii) cruzar las barreras anatómicas fugas después por vía intravenosa (iv). O inyección intracerebroventricular (icv); (Iii) acumular en el nivel de sitio múltiple perivascular (s) del daño cerebral y la médula espinal inflamatoria; y (iv) ejercer trófico tejido notable y efectos reguladores inmunes en diferentes células diana huésped in vivo.

Aquí se describen los métodos que hemos desarrollado para el iv. y <em> entrega icv de NPC singénicos en ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), como modelo de desmielinización inflamatoria crónica del SNC, y prever la entrega sistémica de células madre como una técnica valiosa para la dirección selectiva del cerebro inflamado en neurología regenerativa.

Introducción

Fuerte evidencia ha surgido a partir de los estudios in vivo que prueben la eficacia terapéutica del trasplante de células somáticas neurales madre / precursoras (NPCs) en modelos animales de trastornos del SNC ^1-8. Sin embargo, una serie de cuestiones relativas a la entrega de las células madre en el huésped requiere una cuidadosa consideración antes de que estos resultados experimentales se pueden traducir en aplicaciones clínicas. Un obstáculo particularmente importante para el desarrollo de (hematopoyéticas) restaurativos terapias con células madre para enfermedades cerebrales, inflamatorias crónicas multifocales es la identificación de la ruta ideal de la inyección de la APN. Un firme entendimiento de la fisiopatología de la enfermedad específica (focal o multifocal; degenerativa inflamatoria o primaria primaria), y un análisis cauteloso de las cuestiones de viabilidad y de riesgo asociados con las técnicas de entrega son para identificar el protocolo óptimo para la entrega de células madre.

Mientras que el centro de coordinación ( Por ejemplo. en el parénquima del sistema nervioso) trasplante de células madre es un enfoque lógico para el tratamiento de enfermedades del SNC caracterizados por áreas espacialmente confinados de daño (por ejemplo, el Parkinson y la enfermedad de Huntington, del cerebro y la médula espinal lesiones traumáticas, y accidente cerebrovascular), el mismo enfoque puede resultar a ser prácticamente no es factible en condiciones tales como MS, donde un daño en el SNC multifocal, crónica, y espacialmente diseminada acumula con el tiempo. En este último caso, apuntando a las inyecciones de células de coordinación para las lesiones individuales también se ve obstaculizada por la limitada capacidad de los NPCs trasplantadas a migrar a través de largas distancias dentro del parénquima del SNC, lo cual incitará a la identificación de métodos alternativos y más adecuados de focalización del SNC con los trasplantes de NPC menos invasivos .

Gran promesa surgió de las observaciones que se dirigen a los NPCs un tumor intracraneal (p. ej. Glioma) en ratones cuando se inyecta por vía intravascular fuera del CNS9. Después de esta seminalen evidencia in vivo de la pathotrophism de células madre ^10, los datos extensos se han acumulado correspondiente a la viabilidad y la eficacia terapéutica de la trasplante sistémica de NPC en animales de laboratorio con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), como un modelo de daño inflamatorio del SNC, ya sea a través de vía intravenosa (iv) o intracerebroventricular (icv). NPC inyección ^{1,2,5,6,8 ..} Hemos mostrado por primera vez que esto depende de la capacidad de los NPCs trasplantados para apuntar y para entrar en la inflamación del SNC, y participar posteriormente múltiple intercelular programas de comunicación dentro de microambientes específicos in vivo ^11. Con el fin de centrarse específicamente en el sistema nervioso central, los personajes se entregan directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de distribución por la inyección icv, o en el torrente sanguíneo a través de la inyección iv. Una vez que entra bien en el torrente sanguíneo o en el LCR, NPCs trasplantados interactúan activamente conel hematoencefálica (BBB) ​​o sangre líquido cefalorraquídeo (BCSFB) barreras y entrar en el parénquima del SNC. Esta interacción entre el injerto APN y la acreditación (o BCSFB) está regulada por conjunto específico de moléculas de adhesión celular de la superficie de la APN (CAMs) y facilitada por la expresión de altos niveles de la leva contra-ligandos en endoteliales / células ependimarias activados ^12-14. Ejemplos de estas levas incluyen el receptor de hialuronato, CD44, y la molécula de adhesión intercelular (ICAM) -1 ligando antígeno muy tardío (VLA) -4 ^5,15,16 (que, en los leucocitos, son responsables de la interacción con ependimal activado y células endoteliales), y en un grado de linfocitos asociado a la función de antígeno mucho más baja (LFA) -1 y el ligando glicoproteína P-selectina (PSGL) -1. NPC también expresan una amplia gama de receptores de quimioquinas, incluyendo CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, CXCR4 y (pero no expresan CCR3 y CCR7), que son funcionalmente activos, tanto in vitro como in vivo ^5,16. Por lo tanto, systemicaNPC LLY inyectados utilizan estas levas, junto con la proteína G de receptores acoplados (GPCRs), a acumularse en el nivel de la inflamación del SNC. Por el contrario, los NPCs inyecta por vía sistémica en ratones sanos no entre al SNC a través vascular o cefalorraquídeo rutas espacio fluido ^2. Inflamación del SNC, o la activación de células endoteliales / ependimal siguiente sistémica de citoquinas o lypopolisaccharide inyección (LPS) como un modelo de encefalitis inducida químicamente, por lo tanto, es necesario para la acumulación de NPC sistémicamente inyectados en el cerebro y la médula espinal ^2. Por lo tanto, la orientación exitosa de la CNS con terapias sistémicas NPC depende de la identificación de una ventana específica de la enfermedad de la Oportunidad (WoO) en el que el cerebro y el medio ambiente de la médula espinal son propicias para la acumulación y la migración transendotelial de NPCs. Tales condiciones generalmente surgen en el contexto de la inflamación aguda y subaguda ^17. Una vez que haya entrado en el sistema nervioso central, trasplantado NPCs indiferenciadasse ha demostrado para mejorar las características clínico-patológicas de los ratones, así como de mayor tamaño, primates no humanos con EAE. Esto ha sido descrito a ser dependientes de la sustitución célula mínima ² y la secreción considerable de factores paracrinos reguladoras y neuroprotectores inmunes dentro perivascular CNS ^2,5,6,18 vs no CNS zonas inflamadas ^19,20 (por ejemplo, los ganglios linfáticos) en respuesta a la la señalización celular inflamatoria provocada por la infiltración de células inmunes ^5.

Aquí se describe los aspectos metodológicos fundamentales de la inyección sistémica de NPCs somáticos en un modelo murino de EAE crónico. Más específicamente, se definen los protocolos que hemos establecido para (i) Obtenga, ampliar y prepararse para el trasplante NPCs somáticos de la zona subventricular (SVZ) de adultos C57BL / 6 ratones; (Ii) inducir la EAE crónica en tales ratones y (iii) realizar terapéuticamente eficaz sistémica (IV o icv) de la APN el trasplante iratones nto EAE.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los principios de cuidado de los animales de laboratorio aprobados por el Ministerio del Interior del Reino Unido en virtud de los animales (procedimientos científicos) Act 1986 (PPL N º 80/2457 de SP).

1. Derivación de somática Neuronales células madre / progenitoras (CPN) de la zona subventricular (SVZ) del cerebro de ratones adultos

1. Elaboración de instrumentos de disección y medios de comunicación
   NB: Estas dos soluciones se deben preparar 1-2 h antes de disecciones instrumentos están listos y precalentado a 37 º C por lo menos 20-30 minutos antes de su uso (que ayuda a diluir la papaína y optimiza la actividad de la enzima).
   
   1. Autoclave una tijera afilada recta, una pequeña tijera quirúrgica y dos pequeñas pinzas dentadas curvadas.
   2. Solución 'digestión': Prepare dos tubos de 50 ml separadas con:
      Solución # 1: 25 ml de solución salina equilibrada de ácido etilendiaminotetraacético (EBSS) + 10 mg (EDTA) + 10 mg de L-cisteína de Earle;y
      Solución # 2: 25 ml de EBSS + 50 mg de papaína.
   3. Preparar 'medio completo de crecimiento' (CGM): medio basal de ratón completo con los suplementos de proliferación de ratón, heparina de 0.002%, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF; 10 ng / ml), factor de crecimiento epidérmico (EGF; 20 ng / ml), y antibióticos (Pen / Strep).
2. La disección del cerebro
   NB: La eliminación de los huesos temporales puede dañar fácilmente el tejido debido a su nitidez. Para evitar esto, para sujetar firmemente los huesos con las pinzas y tire hasta que se ha eliminado todo el hueso.
   
   1. Para cada preparación de NPCs, sacrificio por dislocación cervical n = 5-7, 4-8 semanas de edad C57BL / 6 ratones.
   2. Limpie con etanol al 70% (en agua) el pelo de los ratones sacrificados y por detrás de las orejas con la tijera afilada recta para quitar de la cabeza;
   3. Se practica una incisión en la línea media usando un pequeño tijera quirúrgica para cortar la piel sobre el cráneo. Usando las pinzas, doblar los dos trozos de piel para exposicionese el cráneo.
   4. Con la pequeña tijera quirúrgica realizar dos pequeños cortes en la base del cráneo y retirar los huesos debajo de la protuberancia / médula (cráneo ventral). Continúe tirando de los huesos temporales. Con la misma tijera realizar un corte a lo largo de todo el cráneo, a partir de la base de las bombillas, sin dañar la superficie del cerebro. Además, realizar un corte entre los huesos frontales y los ojos, para facilitar la eliminación de los huesos parietales. Con dos pinzas empiezan retirar el cráneo tirando de cada uno de los huesos parietales hacia el exterior. Mientras tira, preste atención a las meninges, que puede dañar el cerebro cuando se deben extirpar los huesos.
   5. Una vez que el cráneo se ha eliminado, deslice la pinza entre el cerebro y el cráneo para separar completamente las meninges fueron. Levante ligeramente el cerebro contra el cráneo. Cortar los nervios ópticos para liberar el cerebro y finalmente recoger el cerebro en un tubo con frío tampón fosfato salino (PBS).
   6. Mantenga el tubo en un baño de hielod Repita el mismo procedimiento para todos los ratones.
3. Ensayos de disección de la ZVS, neuroesfera de incorporación y mantenimiento
   Promedio del número de células x factor de dilución x 10 ⁴
   
   Donde 10 ⁴ representa la conversión del volumen total de la cámara de hematocitómetro (volumen total = 0,1 mm ³ -> 10-4 cm ³ -> 10-4 ml). Al considerar el factor de dilución, tanto el realizado con CGM y con la tinción vital tener que ser tomado en consideración. Como un ejemplo, si 160 células han sido contados en los 4 cuadrados de las esquinas, la densidad final (células / ml) de la suspensión celular será:
   
   160/4 x 5 (dilución con CGM) x 2 (dilución con tinción vital) x 10 ⁴
   
   1. Encienda una campana de disección equipado con un microscopio de disección.
   2. Limpiar todas las superficies con etanol al 70% (en agua), y rociar con una solución anti Mycoplasma para reducir el riesgo de contaminación.
   3. Cubiertala parte inferior de un vaso de precipitados con una gasa estéril (para preservar instrumentos afilados) y llenarlo con etanol al 70% (en agua). Remojar en el vaso de precipitados de dos pares de pinzas, un par de micro tijeras y una cuchilla quirúrgica.
   4. Coloque todo el cerebro en la matriz de cerebro-máquina de cortar.
   5. El uso de dos hojas de afeitar realizan una coronal seccionar 2 mm desde el polo anterior del cerebro, con exclusión de las vías ópticas y 3 mm posterior al corte anterior; y colocar el tejido en una placa de Petri limpia.
   6. Bajo el microscopio de disección aislar el tejido SVZ y cortar en 1 mm ³ piezas con iridectomía tijeras. Repita el procedimiento para todos los cerebros.
      1. Mezcle bien las dos soluciones (sección 1.1.2) por encima y filtrar a través de un filtro de 0,22 micras inmediatamente después de que los cerebros se diseccionaron y los SVZs están listos para ser digerido.
   7. Transferencia de las secciones en 30 ml de solución 'digestión', resuspender suavemente con A10 pipeta ml e incubar 30 min a 37 ° C en 5% de CO _2. Cada 15 min sacuden suavemente el tubo de 2-3x.
   8. Centrifugar a 300 xg durante 10 min.
   9. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 200 l de CGM pipeteando primero con un P1000 y luego con una pipeta P200 (10-20x cada uno), hasta obtener una suspensión de células individuales.
   10. Tome la suspensión de hasta 5 ml con CGM y transferir a un matraz T25 ^cm2.
   11. Después de 5-7 días in vitro formarán (DIV) neuroesferas. Recoger la suspensión en un tubo de 15 ml y centrifugar 10 min a 150 x g.
   12. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 200 l de CGM.
       Disociar las neuroesferas mecánicamente haciendo pasar la células 100-150x con una pipeta P200, hasta obtener una suspensión de células individuales y llevarlo hasta 1 ml con CGM.
   13. Diluir la suspensión de células, por ejemplo, 10 l de suspensión celular en 40 l de CGM para obtener una dilución 1:05, y mezclar bien. Mezclar 10 l de la DILUTe suspensión celular con 10 l de un colorante vital y mezclar bien.
   14. Llene una cámara de recuento del hemocitómetro con 10 l de una suspensión de células 01:01: Solución colorante vital. Por separado contar el número de células (Azules) vivos (blancos) y muertas en las 4 casillas de las esquinas. Para determinar el número de células / ml, aplicar el siguiente cálculo:
   15. Resuspender 2 x 10 ⁵ células en 5 ml de CGM y la transferencia a un matraz T25 cm ^2;
   16. Repita secciones 1.3.11-1.3.12 cada 4-5 DIV. Desde el segundo paso de expansión en adelante, evaluar la viabilidad celular por exclusión de colorante vital y empezar a construir una curva de crecimiento continua en placas a una densidad clonal NPC (8.000 células/cm2), tal como se describe ^21. Mantenga el número de células y repetir el procedimiento cada 4-5 DIV. Para generar una curva de crecimiento continuo, haga lo siguiente:
       NB: Para tener una buena preparación de células, después de 4-5 esferas DIV deberían haber alcanzado un diámetro de 150 a 200 micras. Para tener una buena estimación de tque la densidad celular, es importante encontrar un factor de dilución óptima con el fin de tener bien distribuidas, células que no se superponen a lo largo del hematocitómetro. Idealmente, no debería ser de entre 50 a 200 células totales. Al contar, sólo las células comprendidas en la plaza sin tocar los bordes tienen que ser considerados. Además, la viabilidad de las células es un factor crucial para tener una preparación saludable. Es importante destacar, que debería ser mayor de 90%. Una curva de crecimiento lineal es otro indicador de una preparación de células sanas.
       
       1. Contar el número de células vivas y muertas (por ejemplo, 1,3 x 10 ^6).
       2. Definir la tasa de crecimiento dividiendo el número de células vivas por el número de células cultivadas en placas (por ejemplo, 1,3 x 10 ^6/2 x 10 ⁵ = 6,5).
       3. Calcular el número total de células multiplicando la tasa de crecimiento para el número total de células presentes en el punto de tiempo anterior (al inicio = 2 x 10 ^5).
       4. Indicar la media7; desviación estándar para construir una línea de tendencia lineal.
   17. A partir de pasaje 6, disociación mecánica se sustituye por disociación enzimática. Después de centrifugación a 150 xg durante 10 min, eliminar el sobrenadante, resuspender el precipitado en 200 l de solución de disociación agregado celular, resuspender 7-8x con una P200 e incubar 10 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
   18. Resuspender 7-8x con una P200 para obtener una suspensión de células individuales y añadir 800 l de CGM. Contar las células (vivas y muertas) y establecer su viabilidad. Resuspender 2 x 10 ⁵ células en 5 ml de CGM y la transferencia a un matraz T25 cm ^2.
4. Transducción viral de NPCs para el rastreo de células in vivo
   NB: Para verificar la eficacia de la transducción viral, construir una curva de crecimiento paralelo con NPCs transducidas y nontransduced. Además, la eficiencia clonal, que es el número absoluto de células formadoras de neuroesferas presente dentro de una preparación de célulasción o un análisis del ciclo celular por el contenido de ADN (con yoduro de propidio, PI), se pueden utilizar como otras indicaciones del estado de las células. Si el porcentaje de células infectadas no debe ser bueno, el protocolo de transducción viral se puede repetir una segunda vez con la misma población de células. Una vez que el nivel de infección es satisfactoria y la curva de crecimiento es similar a la obtenida con las células de tipo salvaje, NPC transducidas se pueden expandir y / o transplantadas.
   
   1. Recoger las neuroesferas y obtener una suspensión de células individuales. Placa las células en alta densidad (1,5 x 10 ⁶ células en un matraz T75 cm ²⁾ en 10 ml CGM.
   2. Después de 12 horas de añadir 3 x 10 ⁶ TU / ml de un vector lentiviral pRRLsin tercera generación. PPT-ingeniería de hCMV con la E. coli derivada de β-galactosidasa (lacZ) o con la proteína fluorescente verde (GFP).
   3. 48 horas más tarde, cosechar las células, se centrifuga a 300 xg durante 10 min y replate las células a una proporción de 1:1.
   4. Después3 pasajes in vitro verificar la eficiencia de la infección. La citometría de flujo se utiliza comúnmente para probar la eficacia de la infección, y el satisfactorio nivel de infección es comúnmente aceptados para estar en el rango de 75 a 95% de células positivas. Comprobar de nuevo la eficiencia de la infección después de 3, otros pasajes de expansión para verificar el mantenimiento de la expresión del marcador.
5. Neurosphere congelación
   1. Recoger las neuroesferas a partir de un matraz T25 cm ^2, centrifugar a 300 xg durante 10 min, y descartar el sobrenadante.
   2. Resuspender el sedimento con 1 ml de medio de congelación (CGM con 10% dimetil sulfóxido (DMSO).
   3. Coloque los crioviales a -80 ° C dentro de un contenedor de congelación.
   4. Después de al menos 24 hr mover las células a una Caja criogénica y se almacenan a -80 ° C durante meses, o traer a nitrógeno líquido _(N2) para un almacenamiento más prolongado.
6. Neurosphere descongelación
   NB: Para evitar los efectos tóxicos de contacto prolongado of NPCs con DMSO, el proceso de descongelación debe ser lo más rápido posible.
   
   1. Retire el vial del -80 ° C / N ₂ y mantenerla en hielo seco.
   2. Descongelar rápidamente el vial en un baño de agua hasta que casi toda la suspensión celular se descongela y sólo una pequeña pieza de suspensión permanece helado.
   3. Resuspender la suspensión de células con 5 ml de fresco y precalentado CGM.
   4. Centrifugar a 300 xg durante 10 min.
   5. Eliminar el sobrenadante, resuspender suavemente con 5 ml de fresco CGM y la placa de la suspensión de células en un frasco limpio y sin tratamiento T25 ^cm2.
7. 1.7) Caracterización de la APN
   NB: El último lavado con PBS se puede sustituir con 0,05% de azida de sodio-PBS para prevenir el crecimiento de hongos o contaminaciones, y cubreobjetos se almacenan a 4 ° C durante 2-3 semanas.
   
   NB: Para la tinción de marcadores intracelulares agregar un agente de permeabilización a PBS en la solución de bloqueo. Si la fuente del anticuerpo primario es de cabra, Albumi de suero bovinoN (BSA) o suero de cabra que no sea deben ser utilizados.
   
   NB: Para las manchas de marcadores intracelulares utilizan un agente de permeabilización en la solución de anticuerpo primario.
   
   1. Coloque una coverslide vidrio de 13 mm en la parte inferior de una placa de 24 pocillos. Añadir 150 l de solución de recubrimiento en la parte superior de cada coverslide para crear una pequeña gota. Incubar durante al menos 30 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
   2. Recoger las neuroesferas y se disocian para obtener una suspensión de células individuales.
   3. Contar las células vivas y se diluye hasta obtener 80.000 cells/35 l. Retire el exceso de solución de revestimiento de la coverslide por aspiración suave, y la placa de los 35 l de suspensión celular.
   4. Incubar 25 min a 37 ° C, 5% de CO _2. Compruebe rápidamente en el microscopio de contraste de fase si las células han comenzado a adherirse.
   5. Preparar el medio de diferenciación mediante la mezcla de medio basal de ratón con los suplementos apropiados (véase el cuadro 1) y antibióticos (Pen / Strep).
   6. Añadir 400 l de medio de diferenciación y se incuba a 37 ° C, 5% de CO _2.
   7. Después de 3 DIV, cambio de la mitad del medio con medio de diferenciación fresco.
   8. Después de 6 DIV, se elimina el medio y lavar una vez con PBS. Bajo una campana química retirar el PBS y añadir 300 l de precalentado 4% de paraformaldehído (PFA) al 4% de sacarosa. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Retire la PFA y lavar 3 veces con PBS.
   9. Para continuar con inmunocitoquímica, retire el PBS y se bloquea con PBS 10% de suero normal de cabra (NGS) (solución de bloqueo), y se incuba 1 hora a temperatura ambiente.
   10. Eliminar la solución de bloqueo y añadir el anticuerpo primario diluido en PBS deseada 1% de NGS. Incubar a 4 ° CO / N o, alternativamente, 120 min a TA.
   11. Después de la incubación, lavar 2x con PBS. Incubar con el anticuerpo secundario apropiado diluida con PBS 1% de NGS. Incubar 60 min a TA.
   12. Lavar 2 veces con PBS y contra-teñir los núcleos con 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI) diluido 1:20.000 con PBS agente de permeabilización durante 3 min a TA en la oscuridad. Lavar dos veces con PBS y una vez con agua destilada.
   13. Ponga una gota de medio de montaje en un portaobjetos de tejido de vidrio y con fórceps montar el coverslide con las células hacia el medio de montaje. Presione suavemente el coverslide para exprimir el exceso de medio de montaje. Deje el coverslide en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que se seca el medio de montaje y almacenar a 4 ° C.

Autoinmunidad experimental 2. Mielina de oligodendrocitos glicoproteína (MOG) inducida en ratones C57BL / 6

1. Preparación de la emulsión
   1. En un vaso de precipitados de vidrio de preparar una emulsión compuesta de adyuvante incompleto de Freund que contiene 4 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis [defina de otro modo como el adyuvante completo de Freund (CFA)] y 200 g de MOG (péptido 35-55), teniendo en cuenta que la cantidad total de emulsión por ratón será de 300 l.
      NB: Consignación de Créditoscontroles TE de ratones inmunizados con MOG en CFA son ratones inmunizados con CFA solo. La varianza esperada de aparición de la enfermedad en los ratones inmunizados con MOG es de 11,3 (± 1,8) dpi.
      
      NB: Para el cálculo del volumen total de la emulsión es necesario, tener en cuenta el doble de volumen que el número de ratones por inmunizar. Material de vidrio se debe preferir a recipientes de plástico para minimizar la pérdida de parte de la emulsión.
      
      1. Con una jeringa de vidrio de la celebración de una mezcla de 19 G de la aguja durante aproximadamente 30 minutos, manteniendo siempre la emulsión en hielo.
      2. Para verificar si la emulsión está lista, deje caer una pequeña cantidad de emulsión en agua. La emulsión está listo para ser inyectado sólo si la gota se mantiene tal como es y no se dispersa.
      3. Inmunizar el grupo de control de ratones con sólo CFA. Tratar ratones experimentales (MOG inmunizado) con MOG en CFA. La varianza esperada de aparición de la enfermedad en ratones inmunizados con MOG es de 11,3 (± 1,8) dpi.
   2. Transfiera la aguja de 19 G a un 1 ml jeringa de plástico de unND aspirar la emulsión. Evite las burbujas, cambiar la aguja con un 25 G y dejar la jeringa en el hielo. Jeringas llenas con la emulsión son listo para ser utilizado y se deben mantener en hielo durante un par de horas.
2. Inmunización
   1. Coloca los ratones (6-8 semanas de edad, mujeres) en una caja de calentamiento y espere unos 10 minutos para permitir que la vena de la cola se dilate.
   2. Transferir un ratón de la caja de calentamiento a una inmovilización del ratón. Cierre la inmovilización para evitar cualquier movimiento del mouse.
   3. Llene una jeringa de 1 ml de insulina con 100 l de la toxina pertussis (5 mg / ml), evitando hacer burbujas. Inyecte lentamente la solución en la vena de la cola. Retire la aguja y presionar durante unos segundos con un trozo de papel para tapar la hemorragia.
   4. Coloque el ratón en la jaula y repita el mismo procedimiento para todos los ratones.
   5. Anestesiar a un ratón con la inhalación continua de isoflurano (1-2%, 2 L / min) e inyectar 100 l de la emulsión por vía subcutánea a nivelde los dos flancos y la base de la cola (300 l de emulsión / ratón). Retire lentamente la jeringa, evitando la fuga de la emulsión.
   6. Marque el ratón con un golpeador oreja, coloque el ratón en la jaula y se les presentarán hasta la recuperación completa. Repita el procedimiento para todos los ratones.
   7. Después de 48 horas (2 días después de la inmunización, dpi) repetición de sección 2.2.3.
3. El análisis del comportamiento de los ratones con EAE
   1. A partir de 5 dpi, pesar los ratones diariamente y controlar sus actuaciones locomotor utilizando el sistema de puntuación de la escala descrita en la Tabla 1.

3. La inyección de Neuronales células madre / progenitoras en la vena de la cola (iv)

1. Preparación de las células
   1. Neuroesferas cosecha por centrifugación a 300 xg durante 10 min.
   2. Eliminar el sobrenadante y añadir 200 l de solución de disociación total de la célula. Incubar 10 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
   3. Resuspender 10-12x (avoiding burbujas) con un P200 hasta obtener una suspensión de células individuales y toman a 800 l con medio basal sin Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +.}
   4. Contar las células mediante el uso de un colorante vital a ensayo de viabilidad celular y diluir la suspensión con medio basal sin Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +} para obtener una densidad final de 10 ⁶ cells/150 l. Mantener la suspensión de células en hielo hasta su uso.
2. Inyección iv NPC
   NB: La disociación ideales en suspensión de células individuales y la ausencia de burbujas de aire son dos aspectos clave a tener en cuenta para reducir el riesgo de cualquiera de grumos / agregados vs formación de émbolos que puedan dar lugar a la oclusión de la vena y la consiguiente muerte.
   
   1. En el pico de la enfermedad (16-18 dpi), pesar y anotar los ratones. Distribuir los ratones según la puntuación obtenida con el fin de tener grupos homogéneos.
   2. Coloca los ratones en una caja de calentamiento y espere unos 10 minutos para permitir que la vena de la cola se dilate.
   3. Transferir un ratón de la caja de calentamiento a una inmovilización del ratón. Cierre la inmovilización para evitar cualquier movimiento del mouse.
   4. Llene una jeringa de insulina de 1 ml con 150 ml de suspensión celular y asegúrese de eliminar todas las burbujas. Inyecte lentamente la solución en la vena de la cola. Retire la aguja y presionar durante unos segundos con un trozo de papel para tapar la hemorragia (Figuras 6A y 6B).
   5. Coloque el ratón en la jaula y se les presentarán hasta la recuperación. Repita el mismo procedimiento para todos los ratones.

4. Inyección de Neuronales células madre / progenitoras en la cisterna magna (icv)

1. Preparación de las células
   1. NPCs Cosecha por centrifugación a 300 g durante 10 min.
   2. Eliminar el sobrenadante y añadir 200 l de solución de disociación total de la célula. Incubar 10 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
   3. Resuspender 10-12x con un P200 hasta obtener una sola csuspensión ell y tomar a 800 l con medio basal sin Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +.}
   4. Contar las células y se diluye la suspensión con medio basal sin Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +} para obtener la densidad celular deseada. Mantener la suspensión de células en hielo hasta su uso.
2. 4.2) la inyección icv NPC
   1. En el pico de la enfermedad (16-18 dpi), pesar y anotar los ratones. Distribuir los ratones según la puntuación obtenida con el fin de tener grupos homogéneos.
   2. Coloque el ratón en un aparato estereotáxico bajo inhalación continua isoflurano (1-2%, 2 L / min). Fije la cabeza del ratón con las barras de oído. A continuación, ajuste la boca y nariz piezas. Asegúrese de que la cabeza del ratón es plana y fija.
   3. Limpie la cabeza del ratón con povidona yodada (PVP-I) y hacer una incisión para cortar la piel en la parte posterior de la cabeza para exponer el cráneo.
   4. El uso de un micromanipulador, inserte la punta de un microlitrojeringa ITER en la hendidura entre el occipucio y la vértebra Atlas a través de los músculos y ligamentos intactos en la línea media en la parte posterior del cuello. La parte doblada de la aguja se mantiene en estrecho contacto con la superficie interna del occipucio para toda la longitud, tal como se describe ^22.
   5. Introduzca lentamente la aguja y espere unos segundos. El operador tiene la intención de aprender a reconocer la sensación de la aguja de ser "enganchado" en el cráneo del ratón, antes de iniciar la inyección de la preparación de células. Lentamente inyectar el volumen de células (dentro de 3-5 min). Deje la aguja en su lugar durante unos segundos adicionales después de la inyección y retire lentamente la jeringa.
   6. Suturar la piel y colocar el ratón en una jaula de recuperación hasta la recuperación completa.

5. Procesamiento de tejido

1. Profundamente anestesiar a los ratones con una mezcla de 0,5 ml de ketamina (100 mg / ml), 0,25 ml de xilazina (23,32 mg / ml) y 4,25 ml de agua estéril y transcardically perfundir, Wincineración con solución salina-EDTA y la fijación con 4% PFA. Retire las dos columnas vertebrales y cerebros y Postfix en PFA al 4% durante 12 horas a 4 ° C. Lavar el tejido en PBS, eliminar las médulas espinales de los huesos y dejar el tejido al menos 48 h en 30% de sacarosa (en PBS) a 4 ° C. Incrustar los tejidos de la temperatura óptima de corte (OCT) compuesto y encaje congelación con nitrógeno líquido, tal como se describe ^2.
2. Utilice un micrótomo para cortar los tejidos en 10-12 micras rodajas gruesas.
3. Alternativamente, incrustar tejido fresco en agarosa y cortar el tejido en un vibrátomo 50-80 micras rodajas gruesas.
4. En los dos casos, incubar O / N a 37 ° C en D-galactopiranósido (X-gal) solución para detectar la actividad β-galactosidasa nuclear indolil-β-3-cloro-5-bromo-4.
5. Volver a cortar las secciones que contienen las células β-gal + en 5 micras rodajas y doble tinción utilizando proteína fibrilar ácida antiglial (GFA) de astrocitos (50 mg / ml), el antígeno nuclear antineuronal (NeuN) para las neuronas (1 &# 956; g / ml) y antiNestin para las células neuronales no diferenciadas (10 g / ml).
6. Proceda como se describe en las secciones 1.7.11 y 1.7.12. Para múltiples coloraciones asegúrese de utilizar anticuerpos secundarios conjugados con diferentes fluorocromos.
7. Para tejidos que contengan células GFP etiquetados proceda según se explica en los pasos 5.1 a 5.3 y proceder con las múltiples coloraciones.
8. Añadir unas gotas de medio de montaje a los portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos de tejido.
9. Por secciones teñidas con anticuerpos conjugados con biotina preparar una solución de complejo avidina biotina (ABC solución, véase el cuadro 2) y dejar en agitación durante 45 min.
10. Incubar la rodajas de 5 min con 1% de H ₂ O ₂ para bloquear la actividad de peroxidasa endógena.
11. Lavar dos veces con PBS.
12. Incubar con solución ABC durante 1 hora a temperatura ambiente.
13. Lavar dos veces con PBS.
14. Incubar con una solución de 3,3 '-diaminobenzidina y el 0,3% de H ₂ O _2. Supervisar la ONU reacciónder un microscopio y lavar con PBS tan pronto como el segmento comienza a recibir marrón (generalmente alrededor de 5-10 min).
15. Lavar dos veces con PBS y proceder como se describe en el paso 5.7.

Lista completa de los materiales y reactivos se muestra en la Tabla 2.

Resultados

NPC derivación y caracterización
Disecciones SVZ se realizan en piscinas (n = 5-7 ratones / piscina) de 6-8 semanas de edad C57BL / 6 ratones por medio de disociación mecánica y enzimática (Figura 1A). Después de unos pocos días de cultivo en CGM, neuroesferas de libre flotación comienzan a formarse (Figuras 1A y 1B). Esferas primarias se recolectaron y mecánicamente a pases cada 4-5 DIV. Al pases, número de células vivas y muertas y se determinan el n...

Discusión

Terapias basadas en células madre somáticas están surgiendo como una de las estrategias más prometedoras para el tratamiento de trastornos del SNC inflamatorias crónicas tales como MS2 ^11. Aunque todavía tienen que ser completamente dilucidado los mecanismos que sustentan sus efectos terapéuticos, el impacto significativo de la APN el trasplante en diferentes modelos experimentales de enfermedades neurodegenerativas ha dado lugar a la creencia de un tanto provocativa que las células madre pueden pront...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
EBSS	Sigma	E2888
L-Cystein	Sigma Aldrich	C7352
Papain	Worthington	30H11965
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult proliferation supplements	Stem Cell Technologies	05701
Heparin	Sigma	H3393
Basic fibroblast growth factor	Peprotech	100-18B-1000
Epidermal growth factor	Peprotech	AF-100-15-1000
Pen/Strep	Invitrogen	1514012
Matrigel (coating solution)	BD Biosciences	354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse)	Stem Cell Technologies	05704
Accumax	eBioscience	00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg	PAA Laboratories	H15-011
Myco trace	PAA Laboratories	Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum	PAA Laboratories	B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether	Sigma Aldrich	T8787
Mouse anti Nestin	Abcam	ab11306
Rabbit anti GFAP	DAKO	203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)	Abcam	ab14955
Rabbit anti MAP-2	Abcam	ab32454
Rat anti MBP	AbD SEROTEC	MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345	Millipore	MAB345
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting solution	DAKO	S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete	Sigma Aldrich	F5506
Mycobacterium tuberculosis	DIFCO	H37Ra
MOG(35–55)	Espikem
Pertussis toxin	List Biological Laboratories	181
Tissue processing
Iris scissor straight	Fine Sciences Tools	14060-09
Blunt/bended forceps	Fine Sciences Tools	11080-02
Brain slicer	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Surgical blades	Swann-Morton	324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar)	Boehringer Ingelheim	01LC0030
Xylazine (Rompun)	Bayer	32371
Stereotaxic frame	KOPF	Model 900
Hamilton syringe	Hamilton	7762-04
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6100