Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal

Resumen

Imagen confocal Time-lapse es una técnica de gran alcance útil para caracterizar el desarrollo embrionario. Aquí se describe la metodología y caracterizamos la morfogénesis craneofacial de tipo salvaje, así como PDGFRA, Smad5 y smo embriones mutantes.

Resumen

Proyección de imagen de lapso de tiempo es una técnica que permite la observación directa del proceso de morfogénesis, o la generación de la forma. Debido a su claridad óptica y la susceptibilidad a la manipulación genética, el embrión de pez cebra se ha convertido en un organismo modelo muy popular con el que se realiza un análisis cronológico de la morfogénesis en embriones vivos. De formación de imágenes confocal de un embrión de pez cebra en vivo requiere que un tejido de interés se persistentemente marcado con un marcador fluorescente, tal como un transgén o medio de contraste inyectado. El proceso exige que el embrión se anestesia y se mantiene en su lugar de tal manera que el desarrollo saludable continúa normalmente. Parámetros para la formación de imágenes se deben configurar para tener en cuenta para el crecimiento tridimensional y para equilibrar las exigencias de la solución de células individuales al obtener fotos instantáneas de desarrollo. Nuestros resultados demuestran la capacidad de realizar a largo plazo de imágenes in vivo de embriones de pez cebra marcados con fluorescencia y para detectar variadas conductas de tejido enla cresta neural craneal que causan anomalías craneofaciales. Retrasos en el desarrollo causados ​​por la anestesia y el montaje son mínimos, y los embriones son sanos y salvos por el proceso. Embriones Time-lapse fotografiados pueden devolverse al medio líquido y posteriormente reflejados o se fijan en los puntos posteriores en el desarrollo. Con una abundancia cada vez mayor de líneas de pez cebra transgénico y suerte de cartografía bien caracterizado y técnicas de trasplante, las imágenes de cualquier tejido que se desea es posible. Como tal, time-lapse de imágenes in vivo combina fuerza con métodos genéticos de pez cebra, incluyendo los análisis de los embriones mutantes y microinyectados.

Introducción

Morfogénesis craneofacial es un proceso de varios pasos complejos que requiere la interacción coordinada entre múltiples tipos de células. La mayoría del esqueleto craneofacial se deriva de células de la cresta neural, muchos de los cuales deben migrar desde la dorsal del tubo neural en estructuras transitorias llamados arcos faríngeos ^1. Al igual que con muchos tejidos, la morfogénesis del esqueleto craneofacial es más complicado que puede ser entendido por imágenes estáticas de embriones en puntos específicos de tiempo de desarrollo. A pesar de que es mucho tiempo para llevar a cabo, in vivo microscopía de lapso de tiempo proporciona una apariencia continua en las células y tejidos de un embrión en desarrollo. Cada imagen en una serie de lapso de tiempo le da contexto a los otros, y ayuda a un movimiento hacia el investigador deducir por qué se produce un fenómeno en lugar de deducir lo que está ocurriendo en ese momento.

Imágenes in vivo es por tanto una herramienta descriptiva poderosa para enfoques experimentales paradeconstruir las vías que guían la morfogénesis. El pez cebra Danio rerio es un modelo genético popular de desarrollo embrionario de los vertebrados, y es particularmente adecuada para formación de imágenes in vivo de la morfogénesis. Moderno, métodos convenientes para la transgénesis y la modificación genómica están avanzando rápidamente el número de herramientas disponibles para los investigadores de pez cebra. Estas herramientas mejoran los métodos ya firmes para la manipulación genética y la microscopía. Imágenes in vivo de casi cualquier tejido en casi cualquier contexto genética deseada se acerca más a la realidad que la fantasía.

Movimientos morfogenéticos de los arcos faríngeos se guían por señales interacciones entre la cresta neural y el epitelio adyacente, tanto ectodermo y endodermo. Hay numerosas moléculas de señalización expresadas por los epitelios que son necesarios para conducir la morfogénesis de los elementos esqueléticos craneofaciales. Entre estas moléculas de señalización, Sonic Hedgehog (Shh) es de importancia crítica fo el desarrollo craneofacial ^2-8. Shh se expresa tanto por el ectodermo oral y faríngea endodermo ^2,6,9,10. La expresión de Shh en el endodermo regula los movimientos morfogenéticos de los arcos ^10, el patrón de la cresta neural dentro de los arcos ^10, y el crecimiento del esqueleto craneofacial ^11.

Bmp señalización también es de vital importancia para el desarrollo craneofacial ¹² y puede alterar la morfogénesis de los arcos faríngeos. Bmp señalización regula dorsal / ventral del patrón de cresta dentro de los arcos faríngeos ^13,14. La interrupción de Smad5 en el pez cebra provoca graves defectos palatinos y un fracaso de los cartílagos de Meckel fusionar adecuadamente en la línea media ^15. Además, los mutantes también muestran reducciones y de fusión en los elementos de cartílago ventral, con la 2 ^ª, 3 ^ª, y a veces elementos de arco 4 ^ª faríngea fusionados en la línea media ¹⁵. Estas fusiones sugieren fuertemente que la señalización de BMP dirige la morfogénesis de estos elementos faríngeas.

Señalización de PDGF es necesario para el desarrollo craneofacial, pero tiene funciones desconocidas en arco faríngeo morfogénesis. Tanto el ratón y el pez cebra mutantes PDGFRA tienen profunda fisura del tercio medio facial ^16-18. Al menos en el pez cebra esta hendidura mediofacial es debido a un fallo de la adecuada migración de células de la cresta neural ^16. Células de la cresta neural siguen expresando PDGFRA después de que hayan entrado en los arcos faríngeos. Además, los ligandos de PDGF se expresan por los epitelios facial y dentro de los arcos faríngeos ^16,19,20, por lo tanto la señalización de PDGF también podrían desempeñar un papel en la morfogénesis de los arcos faríngeos siguientes migración. Sin embargo, los análisis de la morfogénesis de los arcos faríngeos en mutantes PDGFRA no han sido realizados.

Aquí, nos demuestran en microscopía confocal in vivo de pharynguluna etapa de pez cebra transgénico y describir la morfogénesis de los arcos faríngeos dentro de este período. Además, demuestran comportamientos de tejido que se ven afectados por mutaciones que alteran la Bmp, PDGF, y las vías de señalización de Shh.

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Protocolo

1. Ganadería y mutante alelos

1. Levante y criar el pez cebra como se describe ^21.
2. Alelos mutantes de pez cebra utilizados en este estudio fueron ¹⁶ PDGFRA ^{B1059, B1100} Smad5 ^22, y ^B577 SMO ^23. Las fuentes de estas cepas de pez cebra son ZIRC.

2. Preparación de las soluciones e Implementos

Nota: Todas las soluciones y los instrumentos se pueden hacer con antelación y se almacenan para su uso futuro.

1. Hacer medios embrión (EM) como se ha descrito previamente ^21.
2. Hacer 4 g / L MS-222 (tricaína). Disolver 4 g de fosfato disódico (Na ₂ HPO ₄₎ en 450 ml de agua estéril. Añadir 2 g de MS-222 a la solución. Ajustar el pH a 7,0-7,2 dentro. Añadir agua estéril hasta un volumen total de 500 ml.
3. Opcional: Hacer 4 g / L de aceite de clavo. Pesar 0,2 g de aceite de clavo de olor puro en un tubo cónico de 50 ml. Añadir EM hasta un volumen total de 50 ml. Almacenar a 4 ° C.
4. Hacer 3% methylcelluloSE. Llevar 50 ml de EM + 0,1 M HEPES a ebullición. Retire del fuego. Revuelva en 1,5 g de metilcelulosa hasta que la solución sea homogénea. Almacenar a 4 ° C.
5. Hacer 0,2% de agarosa. Añadir 0,1 g de agarosa a 50 ml de EM. Traiga EM a hervir en el microondas o en una placa calefactora y verificar que la agarosa se disuelva. Alícuota en 500 volúmenes mu l en tubos de microcentrífuga y se almacenan a 4 ° C. Nota: Los volúmenes se pueden ajustar según sea necesario.
6. Hacer atizadores capilares. Coloca una gota de pegamento en el interior de un tubo capilar 0,9 mm ID. Inserte una longitud de 4-5 cm de 6 libras prueba de línea de monofilamento de pesca dentro del tubo capilar de manera que aproximadamente 3-4 mm de la línea se extiende más allá del extremo del tubo.
7. Haga dos cubreobjetos puenteados por espécimen. Super-cola 22 x 22-1 vidrio cubierta en cada extremo de una cubierta de vidrio de 24 x 60-1 dejando a la libre medio. Hacer singles (1 pequeña cubierta de vidrio por fin) para los embriones de menos de un día de edad, se duplica (2 vasos pequeños de la cubierta en la parte superior de uno al otro por fin) para los embriones tres y cincuenta y nueve days de edad, o triples (3 vasos pequeños de la cubierta en la parte superior de uno al otro por fin) para embriones cinco días o de más edad.
8. Llene una jeringa de 10 ml con grasa de alto vacío. Nota: la grasa de vacío sirve como un sellante para prevenir la deshidratación de los especímenes durante largos períodos de tiempo, y tiene bajo potencial de toxicidad en comparación con los selladores más volátiles.

3. Montaje de embriones de pez cebra para Microscopía Confocal (Ver Figura 1)

1. Preparar medio anestésico. Derrita una alícuota de 0,2% de agarosa en el microondas en intervalos de 20 segundos hasta que esté completamente líquida. Mezclar 8 l de EM-222 en 192 l de 0,2% de agarosa o de 5 l de 4 g / L de aceite de clavo en 195 l de 0,2% de agarosa. Mantener en un bloque de calentamiento de 42 ° C. Nota: La exposición prolongada a MS-222 provoca retrasos en el desarrollo más fuerte que el aceite de clavo hace en embriones de pez cebra ^24.
2. Si es necesario: dechorionate manualmente embriones transgénicos no eclosionados a analizar sólo antes del análisis. Con unas pinzas, poco a poco tear el corion abierta hasta que se libera el embrión.
3. Anestesie los embriones de pez cebra. Añadir 1 ml de una 4 g / L de stock de MS-222-24 ml de medio de embriones. Por otra parte, añadir 390 l de 4 g / L de aceite de clavo de 24 ml de agua de pescado ^24. Nota: El aceite de clavo actúa lentamente para realizar este paso por lo menos 15 a 20 minutos antes de la microscopía de lapso de tiempo.
4. Coloque una gota de grasa de vacío alrededor del espacio central de un cubreobjetos puente que mira hacia arriba. Empujar lentamente la grasa de vacío fuera de la jeringa, haciendo un cordón suave y continua que es adyacente a y en el interior de los puentes y el borde del cubreobjetos.
5. Corre un círculo de 4% de metilcelulosa en el medio de la cubreobjetos puente usando un aplicador de madera.
6. Transferencia del embrión en ser fotografiado. Cuando se anestesia el embrión dibuja para arriba en una pipeta de vidrio. Mantener la pipeta verticalmente para permitir que el embrión se hunda hasta el fondo del líquido en la pipeta. Mueva la pipeta en la solución de agarosa y permitir que el embrión caigaen la agarosa. No expulsar el líquido.
7. Coloque la muestra. Dibuje un poco de solución de agarosa y el embrión en la pipeta. Expulsar el embrión en una gota de solución de agarosa en la parte superior de la metilcelulosa. Utilice un póquer capilar para empujar el embrión hacia abajo sobre la metilcelulosa y orientar el embrión como se desee para formación de imágenes.
8. Selle la muestra.
   1. Coloque un cubreobjetos de puente en la parte superior de la montados uno, que mira hacia abajo. Aplicar una presión uniforme en ambos lados de los cubreobjetos intercaladas hasta que los puentes hacen contacto directo y los sellos de gota de agarosa a ambos cubreobjetos. Verifique que el embrión está bien orientada.
   2. Frote un aplicador de madera a lo largo del vidrio para suavizar las grietas y huecos en el cordón de grasa de vacío. Limpie el exceso de grasa de los bordes.

4. Time-lapse confocal de imágenes de pez cebra transgénico embriones

(Este protocolo ha sido optimizado para un microscopio confocal Zeiss LSM 710 nosción de imágenes de software ZEN, y puede ser modificado para su uso con otros sistemas.)

1. Activar el equipo. Encienda el microscopio confocal y los dispositivos láser externos. Encienda el ordenador conectado a un microscopio confocal. Software de imagen confocal Abrir y seleccione "Sistema de Inicio" para activar los controles de adquisición de imágenes.
2. Preparar el escenario climatizada. Baje la plataforma de montaje del microscopio confocal y mover las lentes del objetivo de su posición. Vuelva a colocar el escenario por defecto con una etapa electrónica climatizada. Encienda el controlador para la etapa de calefacción y la temperatura de 29.5 ° C.
3. Coloque la muestra en el campo de visión. Coloque la muestra montada en el escenario. Mueva la lente objetivo de 20X en su posición y elevar la plataforma puesta en escena. Activar el emisor de luz visible y mirar a través de los oculares. Centro de la cabeza del embrión en el campo de visión.
4. Definir la configuración del experimento.
   1. Activar canales de fluorescencia seleccionandola longitud de onda fluorescente para detectar y seleccionar tablas de búsqueda de color (LUT) para cada canal. Si es necesario, utilice los controles manuales en el software para activar el láser necesarios (por ejemplo, 561 nm para RFP). Para cada canal de fluorescencia, ajuste la intensidad del láser a 10,0 y el voltaje del fotomultiplicador (HV o ganancia) entre 600-700. Establezca el promedio a 4 y la profundidad de bits a 16 bits.
   2. Activar los módulos de la serie Z-stack y hora. Ajuste el ojo de aguja para una resolución Z 5 micras o menor, y establecer el Z-intervalo a la distancia óptima sugerido.
      Nota: Por lo general, 5 micras Z-resolución permite que cada imagen pila Z a recoger lo suficientemente rápido para una "instantánea" del embrión en un momento particular, a la vez que la resolución de las células individuales. La reducción de la promediación también reduce la cantidad de tiempo por imagen.
   3. Defina el intervalo de tiempo deseado entre las imágenes (por lo general 10 a 20 minutos) y la duración total del experimento.
5. Ajuste de posicióninformación.
   1. Gire la cámara en el modo en vivo. Ajuste el enfoque y aumentar la intensidad del láser, si es necesario para ver la fluorescencia. Ajuste el zoom digital de 0,6 para una visión más amplia, si se desea.
   2. Coloque el escenario de tal manera que todas las estructuras de interés son visibles y no hay espacio en el campo de visión para dorsalmente consecuencia y anterior. Enfoque a través del embrión a los límites superior e inferior de la fluorescencia. Establezca la primera y última posiciones rebanada Z-stack al menos 100 micras o más allá de estos límites.
6. Optimizar la intensidad de fluorescencia.
   1. Establezca la LUT de visualización para variar indicador. Estructuras fluorescentes deben ahora aparecen de color blanco, y el resto del campo de visión debe ser de color azul (sin detección) o negro.
   2. Aumentar HV / ganancia a un nivel justo por debajo de donde aparecen saturado (rojo) píxeles. Si es necesario, ajuste la compensación por lo que la mayoría de los antecedentes no se detecta (azul). Nota: Menor diámetro del agujero de alfiler y el aumento de la intensidad del láser tanto mejorar la imagen defnición, pero la intensidad del láser debe mantenerse baja para preservar los tejidos vivos. Aumento de HV / ganancia y el diámetro del agujero de alfiler (<5 micras) son generalmente preferibles a una mayor intensidad del láser.
   3. Mantenga el diámetro del agujero de alfiler lo suficientemente amplia como para recoger las imágenes en el momento oportuno, con un promedio de sets a 4. El intervalo Z debe estar siempre a la distancia óptima sugerido para el diámetro del agujero de alfiler. Realizar exploraciones cortas (de promedio = 1) con diferentes configuraciones, y utilizar la intensidad del láser mínimo que alcanza la resolución deseada.
7. Ejecutar el experimento para la longitud deseada de tiempo. Después, retire embrión desde la etapa climatizada y lentamente separar los cubreobjetos. Sumergir el portaobjetos y el embrión en EM en un 30 mm placa de Petri. Usando una pipeta de vidrio lavar suavemente el embrión fuera del cubreobjetos y retire el cubreobjetos de la placa de Petri. Coloque el embrión en una incubadora de 28,5 ° C a seguir desarrollándose.
8. Comparar el crecimiento. Al final del experimento, tomar individuo Zsimágenes de la tachuela de embriones de hermanos de agarosa-montado que se representaban de manera similar a la muestra en el comienzo del experimento, pero se suscitaron en EM en un incubador de 28,5 ° C.
9. Mida arcos faríngeos, según sea necesario. Las mediciones pueden realizarse en algunas suites de software confocal. Las mediciones que se encuentran aquí se realizaron con Fiji25 importando y Z-proyectar archivos. LSM de fotogramas individuales.

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Resultados

En los embriones de tipo salvaje, a raíz de la población de la cresta neural, los arcos faríngeos se alargan a lo largo de los ejes ventral anterior / posterior y dorsal / mientras se mueve en una dirección rostral (Película 1). En 30 horas después de la fertilización (HPF), la longitud anterior / posterior de la primera arco faríngeo es entre 1.8 a 1.9 veces su dorsal / ventral altura. Dorsal / elongación ventral avanza de manera constante, más rápido que la extensión anterior / posterior h...

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Discusión

Time-lapse microscopía confocal es una poderosa herramienta para el análisis del desarrollo. Aquí, nos demuestran la utilidad del método en el estudio de la morfogénesis arco faríngeo en el pez cebra, que son mutantes para importantes vías de señalización que utilizan un transgénico que marca las células de la cresta neural. Además de los análisis a nivel de los tejidos, los análisis de lapso de tiempo también son aplicables a los análisis a escala celular ^28. Muchos métodos de pez cebra ampl...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 lb Test monofilament line	Cortland Line Company	SLB16
Agarose I	Amresco	0710
Argon laser	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID	FHC	30-31-0
Clove oil	Hilltech Canada, Inc.	HB-102
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator	Fisher Scientific	2050FS
Laser scanning microscope	Carl Zeiss AG	LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
Potassium chloride	Fisher Scientific	M-11321
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Sodium chloride	Fisher Scientific	M-11624
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.