Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo

Resumen

Gránulos de estrés (SGS) son gránulos de ARN citoplásmicos que contienen partículas estancadas ribonucleoprotein (RNPs), y importante en la respuesta celular a varios tipos de estrés. Dinámica de SGS puede seguirse en células vivas mediante la visualización de la localización de un componente de etiquetado de SGS en células primarias transfectadas después de estrés.

Resumen

SGS puede ser visualizado en las células mediante inmunotinción de los componentes específicos de la proteína o ARNm poliA +. SG son muy dinámicos y el estudio de su montaje y el destino es importante entender la respuesta celular al estrés. La deficiencia en los factores clave de la SG como G3BP (RasGAP dominio SH3 unión a proteínas) da lugar a defectos en el desarrollo en ratones y alteraciones del sistema nervioso central. Para el estudio de la dinámica de la SG en las células de un organismo, uno puede células primarias de cultivo y seguir la localización de un componente etiquetado transfectadas de SGS. Se describe el experimento de lapso de tiempo para observar SGS contiene G3BP1 en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). Esta técnica también se puede utilizar para estudiar SG que contiene G3BP en las neuronas en vivo, que es crucial, ya que ha demostrado recientemente que estas SG se forman en la aparición de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer. Este enfoque puede ser adaptado a cualquier otro cuerpo celular y proteína de los gránulos de componentes, y lleva a cabocon animales transgénicos, lo que permite el estudio directo de la dinámica de gránulos, por ejemplo, en la ausencia de un factor específico de estos gránulos.

Introducción

Gránulos de estrés (SGS) son focos citoplásmica no membranosa formada como una respuesta protectora celular al estrés ambiental, tal como temperatura elevada, el estrés oxidativo, la hipoxia, choque osmótico, la irradiación UV, la privación de glucosa, o infección viral ^1. Ellos pueden ser inducidas químicamente por tratamiento con compuestos como el arsenito de sodio, lo que provoca el estrés oxidativo. SG acumulan estancado traducción detenido ribonucleoproteína mensajero (mRNPs) Complejos de ^2, el secuestro de ARNm a partir de la maquinaria de traducción, y su montaje puede ser desencadenada por la fosforilación de eIF2α (factor de iniciación eucariota 2 α). SG son estructuras dinámicas que intercambian los componentes con los polisomas y otros gránulos como los P-cuerpos. Constituyen un "centro de triage", donde los ARNm se clasifican y procesan, ya sea para la traducción, el reinicio, la degradación o el paquete en mRNPs no polysomal estables ^3. El conjunto de SGS es rápido but es un proceso gradual con numerosos pequeños agregados iniciales, que se unen en gránulos más grandes. El uso de inhibidores químicos que interrumpen o estabilizar los microtúbulos muestra que se requiere la red de microtúbulos para la dinámica de SG incluyendo los procesos de montaje, coalescencia y desmontaje.

El ensamblado dinámico de SGS también es promovida por la agregación de proteínas de unión de ARN-específicos (ARN-BP) como TIA-1 (de células T antígeno interna-1) y TIAR (proteína relacionada con el TIA-1), que son capaces de dimerizar y promover polysome desmontaje y el encaminamiento de los ARNm en SGS ^4. G3BP (proteína de unión a dominio SH3 de RasGAP) es una ARN-BP tales que localiza a SGS cuando las células están estresados ​​con arsenito o alta temperatura, y la sobreexpresión de G3BP desfosforilado pueden inducir conjunto de SG ^5.

G3BP es un conservadas evolutivamente ARN-BP que se caracterizó inicialmente a través de su interacción con una proteína activadora de GTPasa Ras-(p RasGAP120 ^6); pero esta interacción ha sido recientemente revisada ^7. La familia G3BP incluye dos miembros en los mamíferos, G3BP1 (referido como G3BP) y G3BP2 ^8. Ambas proteínas colocalize en SG, cuando las células son sometidas a estrés ^9. G3BPs comprenden un dominio N-terminal NTF2 sugerido para influir en su localización y oligomerización, seguido de prolina ricos (PxxP) los motivos, a continuación, los motivos C-terminales asociados con RNA vinculante: la canónica ARN-Reconocimiento Motif (RRM) con RNP1 y RNP2 motivos conservados , seguido de una rica cuadro de arginina-glicina (RGG). Curiosamente, el análisis de diferentes partes de la proteína mediante la construcción de diferentes dominios fusionados a EGFP mostró que el dominio NTF2-y el dominio de unión al ARN fueron la reclutó más eficiente a SGS, lo que sugiere la importancia de las propiedades de la dimerización y de unión al ARN en la asamblea de SGS. Diversos modelos han revelado diferentes funciones de las proteínas G3BP in vitro ^10-13.La interrupción de la G3BP en ratones han demostrado la importancia de esta proteína en el desarrollo del crecimiento y la supervivencia ^14, así como un papel importante para G3BP en el Sistema Nervioso Central (SNC), caracterizado por ataxia y defectos en memoria de trabajo espacial ^15. Deficiencia G3BP conduce a la alteración neuronal plasticidad y calcio homeostasis, estableciendo un vínculo directo entre la formación de SG y enfermedades neurodegenerativas ^15. Es por lo tanto importante ser capaz de estudiar la dinámica de SG en células primarias como las neuronas.

Este protocolo proporciona una manera simple de observar el conjunto de contener G3BP1-SG en células primarias bajo tratamiento arsenito. Se puede utilizar para estudiar el montaje SG bajo diferentes condiciones, por ejemplo, diferentes tipos de tensiones. También se puede adaptar a otros gránulos u otros constituyentes de SGS. De hecho, este protocolo se centra en G3BP1, pero hay otros marcadores de gránulos de estrés como TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) ^2,FMRP (proteína X Frágil Retraso Mental Síndrome) ^16, (proteína de unión a DNA respuesta transactivo 43) TDP-43 ¹⁷ o Staufen ^18. En particular, las proteínas como TIA-1 / R son, como G3BP, nucleación proteínas de unión de ARN que pueden inducir conjunto de SG cuando se sobreexpresa, incluso si los diferentes SG formados pueden diferir en función, regulación y transcripciones asociadas. La transfección de versión fluoróforo de etiquetado de cualquiera de estos componentes clave o nucleadores de SGS se puede realizar para la imagen de montaje y la dinámica particular, SGS.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales en este protocolo son, en estricto apego a las directrices de la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea de 24 de noviembre de 1986 (86-609/EEC). La casa de los ratones del grupo, permitiendo que los alimentos y el agua ad libitum. Mantener en un ambiente controlado (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% de humedad) con un 12 hr: 12 horas de luz: oscuridad ciclo (la luz a las 7:00 de la mañana).

1 Cultura de células murinas primarias:. Fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)

1. Autoclave pinzas delgadas, así como pinzas curvas y tijeras de disección. Almacene en un recipiente estéril. Utilice estéril D-PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco). Preparar medio completo MEFs: medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) / F12 suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FBS), 1 mM de L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 1% de aminoácidos no esenciales, y 0,5 mM de 2-mercaptoetanol y caliente a 37 ° C.
2. La eutanasia a un ratón embarazadas (13,5 días post-coito (dpc)) Por dislocación cervical. Retire los cuernos uterinos del ratón desinfectado con un 90% de EtOH. Bajo una campana estéril y limpia, colocar los cuernos con los embriones en 37 ° C precalentado D-PBS. Abra el cuernos, el lugar los embriones en un 100 mm placa Petri de plástico estéril, limpiarlos a partir del material del cordón umbilical y lavarlos con agua tibia D-PBS para eliminar el exceso de sangre. En virtud de un binocular, retire las extremidades del embrión, los órganos internos y la parte superior de la cabeza que contiene el cerebro.
3. En una nueva placa de Petri, picar el embriones en piezas muy pequeñas con una estéril quirúrgica cuchilla o tijeras (por lo menos durante 1 min). En el caso de los embriones de diferentes genotipos, tenga cuidado de poner cada embrión en platos individuales de Petri y mantener la cola o la cabeza superior para el genotipado.
4. Cubrir el embrión con 1x tripsina-EDTA (0,25% de tripsina, EDTA 1 mM). Incubar durante 30 min a 1 h en una incubadora a 37 °. Añadir 10 ml de completaMEFs medio para detener la reacción con tripsina. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para eliminar todos los agregados. Dejar reposar la suspensión de células en un tubo de 50 ml (llenado con medio completo) durante 10 min, y se centrifuga el sobrenadante durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. Resuspender el sedimento en medio completo (6 ml para 1 embrión). Células nucleadas viables pueden contarse utilizando tripano azul (Alrededor de 5 x 10 ⁶ células se puede esperar de un embrión). Placa 3 ml por 60 mm placa de Petri.
5. Cambie el medio al día siguiente y permiten que las células crezcan hasta que son confluentes los platos. Muchos tipos de células se pueden ver, pero sólo fibroblastos sobrevivirán subcultivo.
6. Dividir las células y les permiten crecer en placas de 35 mm con fondo de cristal (importante para el experimento lapso de tiempo), hasta el 50-70% de confluencia para la transfección. Prueba para Mycoplasma y patógenos del ratón.

2. Cultura Adaptations en el Caso de las neuronas

1. El día anterior a la cultura, la capa 35 mm con fondo de cristal cajas de Petri con poli-L-lisina (200 l de 0,1 mg / ml) en una campana estéril y limpio, y dejar toda la noche.
2. En la mañana siguiente, enjuagar con agua pura estéril, dos veces por 5 min y una vez durante 45 minutos a 1 hora. Reemplace con 2 ml de DMEM más 10% de medio FBS y manténgalo en un incubador a 37 ° C.
3. Diseccionar embriones en el 18,5 dpc. Bajo una campana estéril y limpia, colocar los cuernos con los embriones en frío HBSS estéril (solución salina equilibrada de Hank) en 100 mm de placa de Petri. Cachorros neonatales también se pueden utilizar en lugar de embriones con el fin de preservar la vida de la presa y le permiten producir más descendencia, especialmente en el caso de animales transgénicos que pueden ser difíciles de obtener. En platos individuales Petri, tome cada embrión o el recién nacido y cortar la cabeza con unas tijeras. Sostenga la cabeza mediante la inserción de pinzas curvas en los ojos, cortar la piel y con cuidado abra el cráneo blando de la parte posteriorde la cabeza hasta los ojos, a cada lado de la cabeza. Cortar los nervios ópticos y el tronco cerebral, retire el cerebro, y lo puso en una nueva placa de Petri que contiene HBSS. En virtud de un estereoscopio, quite todas las meninges utilizando dos pinzas finas. Separar el hipocampo, la corteza o cualquier otra parte del cerebro dependiendo de la estructura a estudiar.
4. Sumerja la estructura del cerebro disecado en 4,5 ml de HBSS frío preparado previamente en tubos de 15 ml y mantener en hielo hasta que la digestión con tripsina. Añadir 0,5 ml de 2,5% de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 15 min a 20 min. Enjuague el 3x tripsina con HBSS, siendo extremadamente cuidadoso para no descartar las partes del cerebro digeridos.
5. Resuspender en 500 l (hipocampos) hasta 1 ml (corteza) DMEM más 10% de SFB y pipetear hacia arriba y abajo varias veces con una micropipeta 1 ml equipado con una punta de 1 ml, a continuación, equipada con 1 ml en 200 l consejos, hasta que haya sin agregado visible.
6. Distribuir 100-200 l de suspensión celular a cada 35 mm de vidrio Bottom plato que contiene DMEM más 10% de SFB y dejar que las neuronas se adhieren a 37 ° C durante al menos 3 horas. Reemplazar por medio completo neurona precalentado (medio Neurobasal suplementado con 250 mM de L-glutamina y NS21, preparado como se describe en Chen et al. ¹⁹⁾ y dejar a 37 ° C para permitir el crecimiento neuronal. Transfectar las neuronas en 5 a 14 días in vitro (div) (la eficiencia de transfección es mayor después de un par de conexiones sinápticas div pero son mejores estableció 7-10 div).

3. La transfección de los Constructos EGFP-G3BP1

Transfectar las células con un vector que contiene el ADNc de la proteína de interés (cualquier componente de SGS) fusionado a un marcador fluorescente (GFP, YFP, etc), utilizando 3 g de plásmido purificado por placa de 35 mm.

1. Transfectar las MEFs utilizando un método comercial, siguiendo el protocolo del fabricante (Véase la Tabla de Materiales / Reactivos).
2. Transfectar las neuronas con un calciométodo del fosfato adaptado de Xia et al ²⁰ Brevemente.:
   1. Preparar las soluciones: DMEM-wash: DMEM que contiene 25 mM KCl; solución de transfección: DMEM-lavado que contiene 1x DMKY (HEPES 5 mM, _MgCl2 10 mM, rojo fenol); y la solución de choque: HeBS 1x, 1x DMKY, y DMSO al 2% (v / v); y mantenerlos a 37 ° C.
   2. Retire el papel de las neuronas, filtrado, y la mantendrá a 37 ° C. Lavar con DMEM-wash luego vuelva a colocar con medio de transfección y mantenerse a 37 ° C durante la preparación de los precipitados de calcio en el ADN plásmido de fosfato.
   3. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir (en este orden) de agua Braun (volumen final 50 l), 5 l de _CaCl2 2,5 M, y 3 g de ADN plásmido. Deja esta mezcla en 50 l de HeBS 2x ya introducidos en un tubo de polipropileno de fondo redondo. Mezclar el tubo por rotación junto con la caída. Que la forma precipitado a temperatura ambiente durante 30 min.
   4. Añadir el precipitantee gota a gota sobre las neuronas y dejar a 37 ° C durante 30 a 50 min.
   5. Reemplace con una solución de choque durante 1 minuto y luego enjuague con DMEM-lavado y finalmente reintroducir el medio preacondicionado. Mantener las células a 37 ° C.

4. Visualización de G3BP Contiene Asamblea SG y Dinámica

1. Sustituya el medio de las células que contiene rojo fenol por medio libre de rojo fenol.
2. Utilice un microscopio confocal equipado con fluorescencia para las adquisiciones. Encienda los sistemas de microscopios: lámpara de mercurio, el ordenador y los láseres. Calentar la cámara a 37 ° C al menos 20 min antes del comienzo de las adquisiciones.
3. La expresión más de G3BP induce la formación espontánea de un tipo de SGS. Las células pueden por lo tanto ser observadas para el montaje de SG de 24 horas después de la transfección sin inducción de estrés. Alternativamente, la tensión puede ser inducida para inducir aún más el montaje de SGS. Añadir arsenito de sodio 0,5 mM y la estrellat la adquisición justo después de la adición del compuesto (gránulos serán bien formadas dentro de 1 hora).
4. Añadir aceite al objetivo de inmersión (40X o 63X utilizar objetivos) e instale la placa de Petri sobre el objetivo en el soporte de microscopio adaptado 35 mm, estabilizado en el soporte de la platina. Compruebe que el plato es plana lo contrario las adquisiciones serán alterados. Encienda la luz de fluorescencia de acuerdo con el fluoróforo relevante y visualizar las células transfectadas. Apagar la fluorescencia una vez una célula de interés está en el campo con el fin de minimizar la decoloración y la citotoxicidad.
5. En el "adquirir ficha", seleccione los láseres en función de la longitud de onda de excitación del fluoróforo tag (488 nm en el protocolo que utiliza G3BP etiquetados-EGFP) y seleccionar la longitud de emisión adaptado al PMT (tubo fotomultiplicador). Ajustar la potencia del láser (por lo general no más de 10%) para minimizar el ruido y la sobresaturación, así como la toxicidad, y establecer la ganancia y el desplazamiento para modificar la relación señal a ruido.Escaneado rápido (1000 Hz) con el fin de reducir al mínimo la duración de la exposición láser (línea media 2, promedio cuadro 1). Si lo desea, configure los parámetros de la pila de Z a ser capaz de reconstruir la imagen en 3D (un paso Z de 1 micra es generalmente muy bien con las células). Determinar el tiempo de intervalo entre cada adquisición: intervalos más pequeños permiten obtener una película más coherente pero esto puede inducir fotoblanqueo y la toxicidad (un intervalo de 20 seg se usó en los experimentos descritos). Duración de adquisición total puede variar dependiendo del tipo de estrés. Muchos SGS contiene G3BP-se forman muy rápidamente bajo tratamiento arsenito y son bien visibles después de 1 hora de tratamiento: en ese caso, elegir rápidamente las células para filmar y comenzar las adquisiciones justo después del estrés, con una duración total de las adquisiciones de 15 - 20 min más que suficiente para observar el montaje de varias Comisiones de Estudio.
6. Guardar las imágenes y la reconstrucción de las pilas y la película utilizando el software ImageJ.

Resultados

La formación de estrés gránulo es importante en la respuesta de las células al estrés, lo que permite una adaptación celular con traducción estancado, hasta que la tensión ha despejado, asociado a la prevención de la apoptosis. Permisos de este ensayo para estudiar los SG en células primarias, siguiendo la localización de los componentes clave de proteínas SGs (Figura 1). G3BP, un factor clave de reunión SG, está presente en lugar de modo difuso en el citoplasma de neuronas o MEFs ...

Discusión

Los pasos más importantes en el Protocolo se refieren a la transfección y más particularmente las adquisiciones de lapso de tiempo, que tienen que ser cuidadosamente monitoreados para bajar abajo de la citotoxicidad.

Cultivo de células primarias no es una parte difícil, siempre y cuando se mantengan las condiciones estériles y la precaución se toma con el fin de evitar daños durante las etapas de disección y disociación celular. MEFs se puede mantener congelado a principios de los ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Gibco	21331	Prewarm at 37 °C
Sodium pyruvate	Gibco	11360
Nonessential amino acids	Gibco	11140
L-Glutamine	Gibco	25030
Trypsin	Gibco	15096
Glass bottom B-35	Greiner	627860/627861	Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	Prewarm at 37 °C
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal	Gibco	21103	Prewarm at 37 °C
2-mercaptoethanol	Gibco	31350
Forceps	Biotek	DU-110-A	Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)
Curved forceps	Biotek	P-110-BUF	Very thin, tips 0.1 mm
Small scissors	Biotek	CM-85-BS	Can be useful to remove hippocampi
Polyplus transfection JetPEI reagent	Ozyme	101-10	MEFs transfection, follow the forward protocol
Inverted laser scanning confocal microscope	Leica	SP5