El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

Resumen

Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

Resumen

La cromatina es un complejo de nucleoproteína altamente dinámico hecho de ADN y las proteínas que controla diversos procesos dependientes de ADN. Estructura de la cromatina y la función a regiones específicas está regulada por el enriquecimiento local de la histona modificaciones después de la traducción (hPTMs) y variantes, proteínas de unión a la cromatina, incluyendo factores de transcripción, y la metilación del ADN. La caracterización proteómico de la composición de la cromatina en las regiones funcionales distintos ha sido hasta ahora obstaculizada por la falta de protocolos eficientes para enriquecer tales dominios en la pureza y cantidad apropiada para el posterior análisis en profundidad por espectrometría de masas (MS). Se describe aquí una estrategia proteómica de la cromatina de nuevo diseño, llamado ChroP (roteomics CHRO Matin P), el cual se utiliza una inmunoprecipitación de la cromatina preparativa para aislar las regiones de cromatina distintos cuyas características, en términos de hPTMs, variantes y co-asociados proteínas no histonic, son analizó por MS. Nos ilustran quere la creación de ChroP para el enriquecimiento y el análisis de las regiones heterochromatic transcripcionalmente silentes, marcada por la presencia de tri-metilación de la lisina 9 de la histona H3. Los resultados obtenidos demuestran el potencial de ChroP en la caracterización de fondo el proteoma heterocromatina y probarlo como una estrategia de análisis de gran alcance para la comprensión de cómo los determinantes de proteínas distintas de la cromatina interactúan y sinergia para establecer configuraciones estructurales y funcionales específicos de locus.

Introducción

La cromatina es un complejo altamente dinámico nucleoproteína que está implicado como molde principal para todos los procesos de ADN mediada. El nucleosoma es la unidad básica repetida de la cromatina y se compone de un núcleo octamérico proteínico que contiene dos moléculas de cada histona H2A canónica, H2B, H3 y H4, alrededor de la cual 147 pb de ADN se envuelven ^1,2. Todas las histonas se estructuran como un dominio globular y una "cola" N-terminal flexible que sobresale fuera del nucleosoma. Uno de los principales mecanismos de regulación de la estructura de la cromatina y la dinámica se basa en covalentes modificaciones post-traduccionales (PTMs), que se producen principalmente en los extremos N de las histonas ^3,4. Modificaciones de las histonas pueden funcionar ya sea mediante la alteración de la estructura de cromatina de orden superior, cambiando los contactos entre las histonas-ADN o entre nucleosomas, y controlando así la accesibilidad de las proteínas de unión al ADN (mecanismos cis), o actuando como DockInsitios g de proteínas reguladoras, ya sea como unidades individuales, o incrustado en complejos multiméricos. Tales proteínas reguladoras pueden ejercer su función de diferentes maneras: mediante la modulación de la expresión génica directamente (es decir, proteínas TAF), o mediante la alteración de la posicionamiento de nucleosomas (es decir, la remodelación de la cromatina complejos) o mediante la modificación de otros residuos de histonas (es decir, proteínas con metil-transferasa o acetil- actividad transferasa) (mecanismos trans) ^5. La observación de que distintos PTM clúster patrones en los loci de la cromatina específica condujo a la elaboración de la hipótesis de que diferentes modificaciones en los sitios distintos pueden sinergizar para generar un código molecular mediar el estado funcional del ADN subyacente. El "código de histonas hipótesis" ha ganado amplio consenso en los próximos años, pero su verificación experimental se ha frenado por limitaciones técnicas ^6,7.

Proteómica La espectrometría de masas (MS) con sede en se ha convertido en unpoderosa herramienta para mapear los patrones de modificación de histonas y caracterizar proteínas de unión a la ^cromatina-8. MS detecta una modificación como Δmass específica entre la masa experimental y teórica de un péptido. A nivel de las histonas individuales, MS proporciona un método imparcial y exhaustiva para mapear PTM, lo que permite la detección de nuevas modificaciones y reveladoras interactúa entre ellos ^9-14.

En los últimos años, un número de estrategias han sido desarrolladas para diseccionar la composición proteómico de la cromatina, incluyendo la caracterización de los cromosomas mitóticos intactos ^15, la identificación de proteínas de unión a Hptm-solubles ^16-18 y el aislamiento y análisis de las regiones específicas de cromatina (es decir telómeros) ^19,20. Sin embargo, la investigación de las sinergias locus específicos entre PTM histonas, variantes, y las proteínas asociadas a la cromatina es aún incompleta. Aquí se describe un nuevo enfoque, llamado ChroP (Roteomics matin P CHRO) ^21, que hemos desarrollado para caracterizar eficientemente cromatina dominios funcionalmente distintos. Este enfoque se adapta inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP), un protocolo bien establecido utilizado en la investigación epigenética, para el análisis proteómico basado en MS eficiente de la muestra enriquecida. Hemos desarrollado dos protocolos diferentes, dependiendo del tipo de la cromatina utilizado como entrada y la cuestión abordada por MS; en particular: 1) chip de la cromatina nativa no fijado digerido con MNase se emplea para purificar mono-nucleosomas y para diseccionar los hPTMs co-asociando (N-ChroP); 2) chip de la cromatina reticulada fragmentado por sonicación se utiliza en combinación con un interactómica estrategia basada en SILAC para caracterizar todo cromatina co-enriquecer proteínas (X-ChroP) de unión. Se ilustra aquí la combinación de N-y X-ChroP para enriquecer y estudiando heterocromatina, utilizando H3K9me3 como cebo para los pasos de inmunoprecipitación. El uso de ChroP se puede extenderpara estudiar cualquiera de las regiones distintas en la cromatina, o cambios en la composición de la cromatina dentro de la misma región durante la transición a un estado funcional diferente, allanando así el camino para diversas aplicaciones en la epigenética.

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Protocolo

1. Cultivo Celular

1. Medio estándar para chip nativo
   1. Se cultivan las células HeLa en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de glutamina, 1% penicilina / estreptomicina y 10 mM de HEPES, pH 7,5.
2. SILAC etiquetado para la reticulación de chip
   1. Se cultivan las células HeLa en medio DMEM SILAC, agotado de lisina y arginina, suplementado con 10% de SFB dializados, el 1% de glutamina, 1% penicilina / estreptomicina, 10 mM HEPES pH 7,5 y, o bien la luz L-lisina (Lys 0) y L- arginina (Arg 0) o sus homólogos pesados, L-lisina (Lys 8) y L-arginina (Arg 10) (Tabla de Materiales), a las concentraciones finales de 73 mg / L y 42 mg / L, respectivamente.
   2. Se cultivan las células durante un máximo de ocho generaciones en medio SILAC para garantizar aminoácidos isótopos codificados completas incorporación. Pase células cada dos días, cuando alcanzan una densidad de 1,0 a 1,5 x 10 ⁶ células / ml, la siembra de ellos en aconcentration de 3 x 10 ⁵ células / ml.
   3. Evaluar el crecimiento de las células y la viabilidad en medio SILAC individualizar cualquier posible alteración de la fisiología que pueda resultar de la composición más pobre del medio SILAC; para hacer esto:
      1. Inspeccione visualmente la morfología de células en el microscopio todos los días durante el etiquetado.
      2. Contar las células y las curvas de crecimiento parcela de células que crecen en SILAC frente medio estándar.

2. Nativo de inmunoprecipitación de cromatina (N-CHIP)

1. Preparación núcleos de células cultivadas
   1. Utilice 1-2 x 10 ⁸ células HeLaS3 no marcados por experimento. Las células de la cosecha, hacen parte alícuota de 50 x 10 ⁶ células en tubos de 50 ml y centrifugar a 340 xg durante 10 min a 4 ° C, se lavan con PBS helado.
   2. Resuspender cada sedimento de células en 8 ml de tampón de lisis (Tabla 1) y se incuba durante 10 min a 4 ° C en una rueda giratoria. Vierta carefully cada lisado celular en un colchón de sacarosa (Tabla 1) y se centrifuga en un rotor oscilante, a 3.270 xg durante 20 min a 4 ° C, para separar los núcleos de citoplasma.
   3. Deseche sobrenadantes, mantenga bolitas nucleares y lavar dos veces en helado de PBS por centrifugación, desechar el sobrenadante en cada lavado.
2. Microcócica nucleasa (MNase) Digestión (pequeña escala) y el control de calidad de la cromatina después de la digestión
   1. Resuspender el sedimento nuclear se lavó en 1 ml de tampón de digestión (Tabla 1); dividir en dos alícuotas de 500 l y mantener en hielo.
   2. Medir la densidad óptica (DO) a 260 nm de una alícuota, diluida 1:200 en 0,2% de dodecil sulfato de sodio (SDS) Nota:. OD = 1 corresponde a aproximadamente 50 mg / ml de ADN de la cromatina. Típicamente, a partir de 2 x 10 ⁸ células, el diámetro exterior está en el intervalo de 40-60.
   3. Tome 1% de los núcleos, añadir enzima MNase a una concentración final de 0.005 U de enzima / l de núcleos y se incuba a 37 ° C durante diferentes lapsos de tiempo (0, 10, 20, 40, 60 min).
   4. En cada punto de tiempo, recoger 4 l de núcleos digeridos y añadir EDTA 1 mM para detener la reacción MNase. Mantener en hielo.
   5. Extraer muestras de ADN mediante el kit de purificación de PCR y se eluye en 50 l tampón TE (Tabla 1).
   6. Tomar 20 l de cada muestra de ADN, añadir 10 l tampón de carga (Tabla 1) y cargar las muestras en 1% (w / v) en gel de agarosa que contiene bromuro de etidio, con marcador de PCR como un control de tamaño.
   7. Compruebe la digestión evaluar la escalera nucleosoma cromatina producido por incubación MNase.
   8. Elige el tiempo óptimo para la digestión, basado en la prevalencia de mono-nucleosomas en la preparación. . Típicamente para 0.005 U de enzima / l de núcleos el momento óptimo de la digestión MNase es 60 min (Figura 1B, panel izquierdo) Nota: El MNase óptimo de concentración / tiempo de Digestien puede ser ajustada dependiendo del tipo de célula deseado y del tamaño de nucleosomas estiramiento.
3. La digestión y la recuperación de las fracciones solubles cromatina Large-scale/preparative MNase
   1. Añadir a cada parte alícuota (ver 2.2.1) 5 l MNase, correspondiente a una concentración final de 0,005 U de enzima / l de núcleos; mezclar suavemente y se incuba a 37 ° C durante 60 min (o en general para el intervalo de tiempo optimizado, basado en la prueba a pequeña escala).
   2. Añadir EDTA 1 mM para detener la reacción y mantener en hielo. Se precipitan los núcleos digeridos por centrifugación a 7800 xga 4 ° C durante 10 min. Transferir el sobrenadante (fracción S1) en un tubo nuevo y almacenar a 4 ° C. Nota: S1 contiene la primera fracción soluble de la cromatina, que comprende mono-nucleosomas. Añadir los inhibidores de la proteasa (Tabla 1).
   3. Gránulos Resuspender con cuidado en 1 ml de tampón de diálisis (Tabla 1) y se dializa durante la noche a 4 ° C (Cut fuera del tubo de diálisis es de 3,5 kDa), en 3 L Diálisis Buffer, con constante agitación suave. Recoja el material dializado y centrifugar a 7800 xg durante 10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante (fracción S2) en un nuevo tubo Eppendorf y almacenar a 4 ° C. Nota: S2 comprende di-EPTA-nucleosomas, en función de la medida en la digestión MNase.
4. Control de calidad de la cromatina antes de inmunoprecipitación
   1. Tomar una alícuota correspondiente a 5 g de S1 y S2 fracciones de cromatina (cuantificado mediante la medición de la DO a 260 nm en un sistema de NanoDrop). Extracto de ADN por el kit de purificación de PCR y se eluye en 50 l tampón TE (Tabla 1).
   2. Tomar 20 l de S1 y S2 de ADN, se mezclan con 10 l tampón de carga (Tabla 1) y cargarlos en 1% (w / v) en gel de agarosa. Compruebe la calidad y la eficiencia de la digestión MNase mediante inspección visual de la escalera nucleosomas Nota:. Fracción S1 es altamenteenriquecida en mono-nucleosomas, mientras que la fracción S2 contiene principalmente poli-nucleosomas (Figura 1B, panel derecho).
5. La incubación de la cromatina con el anticuerpo
   1. Almacenar a -20 ° C 50 l de fracción S1 para su posterior análisis de espectrometría de masas.
   2. Añadir 1 volumen de tampón de dilución de chip (Tabla 1) a la fracción S1.
   3. Añadir el anticuerpo contra el Hptm (o proteína) de interés; incubar durante la noche en una rueda giratoria a 4 ° C. Nota: Por lo general, utilizar 10 mg a 20 mg de anticuerpo durante 2 x 10 ⁸ células. La relación óptima entre la cantidad de anticuerpo y el número inicial de células debe ajustarse cuidadosamente caso por caso, en función de la abundancia de la / proteína Hptm utilizado como cebo dentro de la muestra y en la eficiencia de anticuerpos. La optimización es experimental, basado en las siguientes pruebas:
      1. Compare la cantidad de Hptm / proteína de interés entre la entrada y de flujo continuo (FT,ver 2.7.2) por Western Blot o MS para verificar que la inmunoprecipitación enriquece una proporción significativa de la región de la cromatina específica Nota:. Esto se consigue generalmente cuando al menos 50% de la carnada Hptm / proteína se agota en el FT (Figura 1C) .
      2. Compruebe que la proteína inmunoprecipitada de interés es detectable en gel de SDS-PAGE, que asegura que una cantidad suficiente de material está disponible para el análisis de MS Nota:. La presencia en el gel de las bandas correspondientes a las cuatro histonas del núcleo en la estequiometría correcta indica que el nucleosoma intacto ha sido inmunoprecipitada por N-ChroP (Figura 1D). La falta de la estequiometría adecuada es, de hecho, indicativo de una interrupción parcial / desplegado del nucleosoma.
   4. Al mismo tiempo, preparar las perlas magnéticas G acoplados de proteína (ver 2.6).
6. La equilibración y el bloqueo de perlas magnéticas G acoplados a proteínas
   1. Equilibrar 100 l de proteína de perlas magnéticas acopladas-G de la mezcla en disolución de bloqueo (Tabla 1), lavar tres veces y la incubación durante la noche a 4 ° C en una rueda giratoria Nota:. Después de la capacidad de unión de perlas, utilizar 100 l de suspensión para 2-20 mg de anticuerpo.
   2. Lave las cuentas bloqueadas una vez con solución de bloqueo y luego dos veces con chip tampón de dilución (Tabla 1).
7. Aislamiento de la cromatina utilizando perlas magnéticas
   1. Añadir 100 l de perlas bloqueados a la muestra de la cromatina S1 y los incuban en una rueda giratoria a 4 º C durante 3 horas. Centrifugar a 340 xg durante 1 min a girar hacia abajo la muestra de la tapa de la punta. Poner en una rejilla magnética para sedimentar las perlas.
   2. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf. Este es el flujo a través (FT), es decir, la fracción de cromatina que no se unió al anticuerpo.
   3. Lavar las perlas de cuatroveces en Tampón de Lavado (Tabla 1) el aumento de la concentración de sal en cada lavado (75, 125 y NaCl 175 mM).
   4. Para eluir la cromatina inmunoprecipitada, incubar las perlas en 30 l de tampón de muestra de LDS, suplementado con 50 mM de ditiotreitol (DTT) durante 5 min a 70 ° C. Separar las proteínas eluidas en un Bis-Tris acrilamida SDS-PAGE prefabricado en gel con gradiente 4-12% y teñir el gel con el kit de tinción coloidal Coomassie (Figura 1D).

3. La reticulación inmunoprecipitación de cromatina (X-CHIP)

1. La reticulación de las células con formaldehído
   1. Añadir 0,75% de formaldehído a las células marcadas con SILAC, mezclar brevemente e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Se detiene la formaldehído mediante la adición de glicina 125 mM y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
   2. Dividir celdas de 5 x 10 ⁷ alícuotas; enjuagarlos tres veces con helado de PBS por centrifugación a 430xg durante 5 min a 4 ° C y desechar los sobrenadantes después de cada lavado. En el último lavado, eliminar el sobrenadante y mantener el pellet. Nota: Una vez que las células están reticulados, que se pueden almacenar a -80 ° C, si no se utiliza inmediatamente.
2. Preparación Núcleos
   1. Resuspender cada sedimento celular en 10 ml de Tampón de Lisis (Tabla 1). Incubar durante 10 min a 4 ° C con rotación. Se centrifuga a 430 × g durante 5 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante; Mantener los gránulos nucleares.
   2. Resuspender cada sedimento nuclear en 10 ml de tampón de lavado (Tabla 1). Incubar a temperatura ambiente durante 10 min en una rueda giratoria.
   3. Se centrifuga a 430 × g durante 5 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante y recoger las bolitas.
   4. Resuspender cada gránulos nucleares en 3 ml de tampón de incubación chip (Tabla 1). Mantener en hielo.
3. Sonicación cromatina y control de calidad
   1. Sonicar ch. romatin a 200 W (ciclos de 30 segundos "en" y 1 min "off"), en una Bioruptor enfriado, para fragmentar la cromatina Nota: el número de ciclos y los intervalos de sonicación depende del tipo de células y de la duración media de nucleosomal estirar deseada. Típicamente, 30 minutos de sonicación son necesarios para generar fragmentos de ADN de 300-500 pb de longitud, correspondiente a tri-di-y nucleosomas. La elección del tamaño de los fragmentos depende del tipo de dominio de la cromatina bajo investigación.
   2. Tome 2% del total de entrada, invierta el entrecruzamiento de incubación a 65 ° C durante un mínimo de 1 hora en el chip tampón de incubación. Extraer el ADN mediante el kit de purificación de PCR, eluir en 50 l TE Buffer y cargar el ADN en gel de agarosa para comprobar la fragmentación de la cromatina.
4. La incubación de la cromatina con el anticuerpo
   1. Añadir 1/10 de volumen de 10% de Triton X-100 a la cromatina se sonicó. Centrifugar a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar debris.
   2. Ahorra 50 l de entrada de la cromatina de las células pesados ​​para probar el nivel de incorporación de aminoácidos en SILAC células marcadas y de perfiles de proteínas.
   3. Añadir el anticuerpo de elección a la cromatina restante pesada y ligera marcado se sonicó y se incuba durante la noche a 4 ° C en la rueda giratoria. En el canal de luz, añadir también un exceso de pliegue del péptido soluble. Incubar durante la noche a 4 ° C en una rueda giratoria Notas:. La condición óptima entre la g de anticuerpo y el material de partida de células se elige caso por caso, como se discute en 2.5.3. La óptima exceso de molaridad veces del péptido soluble en respecto al anticuerpo debe valorarse cuidadosamente caso por caso.
5. Aislamiento de la cromatina utilizando perlas magnéticas
   1. Equilibrar y bloquear cuentas magnéticas G acoplados de proteínas siguiendo los pasos descritos en 2.6 y el uso de chip tampón de incubación.
   2. Añadir 100 l de bloqueado bEADS a las muestras de la cromatina e incubar en una rueda giratoria durante 3 horas a 4 ° C. Centrifugar a 340 xg durante 1 min a girar hacia abajo la muestra de la tapa de la punta. Poner en una rejilla magnética para sedimentar las perlas. El sobrenadante es el flujo a través de (FT), que contiene nucleosomas unidos. Lavar los granos de cuatro veces en Tampón de Lavado (Tabla 1) con el aumento de concentración de sal (dos lavados a 150 mm y de dos en dos de NaCl 300 mM).
   3. Incubar cuentas en 30 l de SDS-PAGE Loading Sample Buffer (Tabla 1) y durante 25 minutos a 95 ° C para ambos originan y de-reticulación de las proteínas inmunoprecipitadas. Proteínas separadas en el 4-12% Bis-Tris acrilamida SDS-PAGE geles prefabricados (Figura 3D).

4. Preparación de la muestra Antes de MS

1. En la digestión-gel de histonas enriquecidos a partir de N-chip
   Nota: Durante los pasos de digestión de proteínas y extracción de péptidos cuidanpara reducir al mínimo las contaminaciones de queratina que interfieren con LC-MS/MS, como se ha descrito previamente ^{22, 23.}
   1. Cortar rodajas de gel correspondiente a las histonas centrales bandas (Figura 1D). De manchar-las piezas de gel con 50% de acetonitrilo (ACN) en _ddH2O, alternando con 100% de ACN para encoger el gel. Repita hasta que se des-teñidos completamente geles piezas y séquelas en una centrífuga de vacío.
   2. Añadir D _6-acético anhídrido 01:09 (v / v) en bicarbonato de amonio 1 M (NH ₄ HCO ₃₎ (típicamente el volumen final es de 60-100 l) y 3 l de acetato de sodio _(CH3COONa), como catalizador. Incubar durante 3 horas a 37 ° C con fuerte agitación Nota:. La muestra puede generar burbujas en los primeros minutos después de la asamblea de la reacción: es importante manejar con precaución y liberar el gas generado, abriendo de vez en cuando los tubos durante la incubación.
   3. Enjuague las piezas de gel varias veces wITH NH ₄ HCO _3, se alternan con ACN al aumento de porcentaje (del 50% al 100%), con el fin de eliminar completamente los residuos de D anhídrido _6-acético.
   4. Reducir las piezas de gel en 100% de ACN; secarlas en una centrífuga de vacío para asegurar una completa de-hidratación. Re-hidrato de piezas de gel con helado de 100 ng / l de solución de tripsina en 50 mM NH ₄ HCO ₃ y se incuba durante la noche a 37 ° C. Nota: La combinación de la modificación química de lisinas utilizando anhídrido acético deuterado y digestión con tripsina genera un "Arg- C ¿Te gusta "en gel patrón de digestión de las histonas ^21,24.
   5. Deseche el exceso de solución y añadir un volumen de 50 mM NH ₄ HCO ₃ para cubrir completamente las piezas de gel; incubar durante la noche a 37 ° C.
   6. Recoger péptidos digeridos solubles en un nuevo tubo Eppendorf. Liofilizar péptidos. Resuspender en 0,5% acético ácido trifluoroacético acid/0.1% (TFA). Desalar y concentrarpéptidos en una fase inversa C ₁₈ / Carbon "sandwich" y la cromatografía de intercambio iónico (SCX) en microcolumnas hechos a mano (StageTip) ^25.
   7. Preparar las microcolumnas StageTip poniendo discos de la malla de teflón que contienen C inmovilizado ₁₈ / Carbon ("sandwich") y perlas SCX en unos 200 l consejos. Obtenga el "sandwich" al cargar el C ₁₈ microcolumna en la parte superior de una segunda punta cargado con filtro de carbón Nota:. Los péptidos muy cortos, que no son retenidas en el filtro C _18, pase el flujo continuo que se carga directamente en el Consejo de carbono, que por lo general los captura. StageTips SCX pueden enriquecer péptidos específicos, tales como H3 (3-8) de péptidos, no retenido de manera eficiente por cromatografía de fase inversa.
   8. Carga el 50% de los péptidos en la C ₁₈ / Carbon "StageTip sandwich" y el 50% en SCX StageTips. Eluir desde los Consejos C _18/80% de carbono utilizando ACN/0.5% ac acéticoIdentificación y desde el Tips SCX con hidróxido de amonio al 5% (NH ₄ OH) / 30% de metanol. Después de péptidos liofilización, volver a suspender en 0,1% FA y analizar por LC-MS/MS.
2. En-gel digestión de proteínas inmunopurificados
   En-gel de la digestión de las proteínas se lleva a cabo como se describió anteriormente ^22, con modificaciones menores.
   1. Corte cada carril en diez rebanadas (Figura 3D) y cada rebanada en cubitos de 1 mm ^3. De manchar-las piezas de gel con 50 mM NH ₄ HCO _3/50% de etanol y añadir etanol absoluto para reducir el tamaño de los geles. Repita hasta que los geles son completamente manchadas de.
   2. Añadir tampón de reducción (Tabla 1) para las piezas de gel durante 1 hora a 56 ° C, seguido por la adición de tampón de alquilación (Tabla 1) durante 45 min a temperatura ambiente, en la oscuridad. Lave y seque las piezas de gel de centrífuga de vacío.
   3. Rehidratar las piezas de gel con helado de 12,5 ng / sol tripsina llución en 50 mM NH ₄ HCO ₃ e incubar en hielo hasta la rehidratación completa de las piezas de gel. Retire la tripsina en exceso.
   4. Añadir 50 mM NH ₄ HCO ₃ para cubrir completamente las piezas de gel. Incubar toda la noche a 37 ° C.
   5. Recoge la parte líquida. Añadir el tampón de extracción (Tabla 1) para las piezas de gel; incubar con agitación fuerte durante 10 minutos a temperatura ambiente. Repita dos veces.
   6. Incubar las piezas de gel en ACN durante 10 min con agitación fuerte. Repetir dos veces y poner en común todos los sobrenadantes.
   7. Liofilizar los péptidos. Resuspender péptidos secos en 0,5% acid/0.1 acético% de TFA.
   8. Desalar y concentrar los péptidos en una fase inversa C ₁₈ StageTip, como se ha descrito ^{26, 27.}
   9. Eluir péptidos de la C ₁₈ StageTip usando 80% de ácido acético ACN/0.5%. Se elimina el disolvente orgánico por evaporación en una centrífuga de vacío y resuspender los péptidos en 0,1% FA (típicamente 5-10 y# 181; l), cuando esté listo para el análisis de MS.

5. LC-MS El análisis

1. El análisis por cromatografía líquida
   1. Empaque la columna analítica en un 15 cm fusionado emisor de sílice (75 m de diámetro interno, 350 m de diámetro exterior), usando de fase inversa (RP) _C18, 3 micras de resina en metanol, a una presión de helio constante (50 bar) utilizando un dispositivo de bomba-cargador, como se ha descrito previamente ^28.
   2. Pareja el emisor comprimido (C ₁₈ columna RP) directamente a la salida de la válvula de 6 puertos de la HPLC a través de una larga (25 m de diámetro interno) de 20 cm de sílice fundida sin el uso de pre-columna o dispositivo de reparto.
   3. Cargue los péptidos digeridos en la columna C ₁₈ RP al flujo de 500 nl / min fase móvil A (0,1% FA / 5% de ACN en ddH ₂ O).
   4. Después de cargar la muestra, separar los péptidos usando los siguientes gradientes:
      1. Aplicar 0-40% de fase móvil B (0,1% FA/99% ACNen _ddH2O) a 250 nl / min durante 90 min seguido de un gradiente de 40-60% en 10 min y 60-80% durante 5 min, para la elución de los péptidos derivados de las histonas (ver 2).
      2. Aplicar 0-36% de fase móvil B al 250 nl / min durante 120 min seguido de un gradiente de 36-60% en 10 min y 60-80% durante 5 min, para la elución de los péptidos derivados de proteínas inmunopurificados (ver 3).
2. Análisis de espectrometría de masas usando LTQ-FT-ICR-Ultra espectrómetro de masas
   1. Operar en una adquisición de datos que dependen de modo (DDA) para cambiar automáticamente entre la EM y la adquisición MSMS. MS espectros de barrido completo se adquieren, por lo general en el rango de m / z de 200-1,650, se adquiere con la resolución R = 100 000 a 400 m / z. Los cinco (Mejores 5) iones más intensos se aíslan para la fragmentación en la trampa de iones lineal mediante una disociación inducida por colisión (CID) en un valor objetivo de 5000.
   2. Utilice los parámetros indicados en la Tabla 2 for el archivo adquisición "Tuning".
   3. Establezca la configuración de adquisición estándar que se enumeran en la Tabla 2.

6. Análisis de Datos

1. Etiquetar libre cuantificación de las modificaciones de histonas co-enriquecidas en dominios de la cromatina
   1. Convertir los archivos RAW adquiridos a archivos MGF utilizando software Raw2msm (versión 1.10) ^29.
   2. Buscar en las modificaciones de las histonas utilizando Mascot Deamon (versión 2.2.2), el establecimiento de los parámetros que se describen en la Tabla 3.
   3. En la lista de salida de la mascota del péptido, eliminar péptidos con puntuación inferior a 15 o con más de 5 PTMs putativos ²⁹ Nota:. Para cada sola ID péptido, seleccione el péptido con la puntuación más alta de la mascota y filtrar todos los otros péptidos redundantes con el mismo ID .
   4. Construir los cromatogramas de iones extraídos (XIC) para cada precursor correspondiente a cada péptidos modificados, based en el valor m / z, usando el QualBrowser. Calcular el área bajo la curva (AUC) para cada pico (Figura 2A).
   5. Validar cada péptidos identificados contienen modificaciones por inspección visual de los espectros MS / MS utilizando el QualBrowser (Figura 2B).
   6. Calcular la abundancia relativa para cada péptido modificado. Calcular el enriquecimiento relativo de cada modificación en el material de chip-Nota del editor:. Abundancia relativa se calcula como una relación entre la AUC de cada péptido modificado específico sobre la suma de AUC de todas las formas modificadas y no modificadas de la misma péptido, mientras que en relación enriquecimiento como una proporción de la abundancia relativa de la modificación específica en el chip sobre la entrada (Figura 2C).
2. Análisis proteómico cuantitativa de las proteínas co-asociado dentro de los dominios de la cromatina
   1. Para las proteínas de identificación y cuantificación utilizan el paquete MaxQuant(Http://www. Maxquant.org /) ^30. Configurar el motor de búsqueda integrado "Andromeda" utilizando el AndromedaConfig.exe ³¹ y establecer los parámetros de búsqueda que se enumeran en la Tabla 3.
3. Prueba de Incorporación
   1. Estimar el grado de incorporación de aminoácidos en proteínas pesados ​​en la entrada de la cromatina marcado pesado, utilizando el software MaxQuant, de la siguiente manera:
      1. Establezca los parámetros como se describe en el punto 6.2 Desactivación de la opción de re-cuantificar.
      2. Calcular el porcentaje de incorporación de aplicar la siguiente fórmula para ratios de péptidos no redundantes:. Incorporación (%) = relación (H / L) / relación (H / L) + 1 × 100 (Figura 3B) Nota: Aceptar sólo si la incorporación> 95 %.

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Resultados

Inmunoprecipitación de la cromatina es una poderosa técnica utilizada para el perfil de la localización de una proteína o una modificación de las histonas a lo largo del genoma. En una proteómica equivalente, chip es seguido por la proteómica basadas en MS para identificar cualitativa y cuantitativamente los hPTMs, variantes de las histonas y las proteínas de unión a la cromatina que se inmunoprecipitaron junto con la modificación o la proteína de interés, utilizados como "cebo". En el enfoque N-Ch...

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Discusión

Recientemente hemos descrito ChroP, una estrategia cuantitativa para la caracterización a gran escala de los componentes de la proteína de la cromatina. ChroP combina dos enfoques complementarios utilizados en el campo epigenética, CHIP y MS, aprovechando sus fortalezas y superar sus respectivas limitaciones. Chip acoplado a la secuenciación profunda (ChIP-Seq), permite el mapeo de todo el genoma de las modificaciones de histonas en la resolución de unos ³⁵ nucleosomas. Aunque ventajosa por su sensibilid...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Lonza	BE12-614F
FBS	Invitrogen	10270-106
SILAC DMEM	M-Medical	FA30E15086
Dialyzed FBS	Invitrogen	26400-044
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)	Sigma Aldrich	L8662
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)	Sigma Aldrich	A6969
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)	Sigma Aldrich	68041
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)	Sigma Aldrich	608033
Micrococcal Nuclease	Roche	10 107 921 001
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 132 001
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length	Spectrumlabs	132720
QIAquick PCR purification kit	QIAGEN	28104
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade	Abcam	ab8898
Histone H3 peptide tri-methyl K9	Abcam	ab1773
Dynabeads Protein G	Invitrogen	100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0335BOX
Colloidal Blue Staining Kit	Invitrogen	LC6025
LDS Sample Buffer	Invitrogen	NP0007
Formaldheyde	Sigma Aldrich	F8775
Aceti anhydride-d6	Sigma Aldrich	175641-1G
[header]
Formic Acid	Sigma Aldrich	94318-50ML-F
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline	Sigma Aldrich	I6125
DL-Dithiothreitol	Sigma Aldrich	43815
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg)	Promega	V5113
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5	Microcolumn Srl	FS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% C	Dr. Maisch GmbH	r13.aq.
Carbon extraction disk, 47 mm	Agilent Technologies	12145040
Cation extraction disk	Agilent Technologies	66889-U