Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

Resumen

En ensayos in vitro para medir la replicación del virus se han mejorado en gran medida por el desarrollo de virus de ARN recombinantes que expresan luciferasa u otras enzimas capaces de bioluminiscencia. A continuación te detallamos una tubería de cribado de alto rendimiento que combina dichas cepas recombinantes de virus del sarampión y chikungunya para aislar a los antivirales de amplio espectro de bibliotecas químicas.

Resumen

Los virus de ARN son los responsables de las principales enfermedades humanas como la gripe, la bronquitis, el dengue, la hepatitis C o el sarampión. También representan una amenaza emergente debido al aumento de los intercambios en todo el mundo y las poblaciones humanas que penetran en los ecosistemas cada vez más naturales. Un buen ejemplo de una situación tan emergente es epidemias de virus chikungunya de 2005-2006 en el Océano Índico. Avances recientes en nuestra comprensión de las vías celulares que controlan la replicación viral sugieren que los compuestos destinados a funciones de la célula huésped, más que el propio virus, podrían inhibir un gran panel de virus de ARN. Algunos compuestos antivirales de amplio espectro han sido identificados con ensayos orientados a objetivos de acogida. Sin embargo, la medición de la inhibición de la replicación viral en cultivos celulares utilizando la reducción de los efectos citopáticos como una lectura todavía representa una estrategia de cribado de suma importancia. Tales pantallas funcionales se han mejorado en gran medida por el desarrollo de los virus recombinantes que expresan reportero enzimas CAPable de bioluminiscencia tal como luciferasa. En el presente informe, detallamos una tubería cribado de alto rendimiento, que combina el sarampión recombinantes y virus chikungunya con ensayos de viabilidad celular, para identificar compuestos con un perfil antiviral de amplio espectro.

Introducción

Los virus de ARN son responsables de una gran variedad de infecciones humanas, y tienen un gran impacto en las poblaciones de todo el mundo, tanto en términos de salud pública y el coste económico. Vacunas eficaces se han desarrollado contra varios virus de ARN humano, y son ampliamente utilizados como tratamientos profilácticos. Sin embargo, todavía hay una falta crítica de fármacos terapéuticos contra las infecciones de virus de ARN. De hecho, las vacunas eficaces no están disponibles frente a las principales patógenos humanos, tales como el virus del dengue, virus de la hepatitis C o el virus sincitial respiratorio humano (VRSh). Además, los virus de ARN son responsables de la mayoría de las enfermedades emergentes, que han aumentado en frecuencia a causa de los intercambios mundiales y el impacto humano sobre los sistemas ecológicos. Contra esta amenaza que representan los virus ARN, nuestro arsenal terapéutico es muy limitado y relativamente ineficiente ^1-3. Las terapias actuales se basan esencialmente en el tipo recombinante I interferones (IFN-α / β) para estimular la inmunidad innata,o la administración de ribavirina. Aunque el modo de acción de este análogo de ribonucleósido es controvertido y probablemente se basa en diversos mecanismos, la inhibición de la IMPDH celular (inosina monofosfato deshidrogenasa), que agota piscinas GTP intracelulares, es claramente esencial ^4. La ribavirina, en combinación con pegilado IFN-α, es el principal tratamiento contra el virus de la hepatitis C. Sin embargo, los tratamientos de IFN-α / β y ribavirina son de relativamente poca eficacia in vivo contra la mayoría de los virus de ARN, ya que de manera eficiente contundente IFN-α / β señalización a través de la expresión de factores de virulencia ⁵ y, a menudo escapar ribavirina ^3. Esto sumado al hecho de que el tratamiento con ribavirina está planteando problemas de toxicidad importantes, a pesar de que recientemente se aprobó contra la enfermedad VRSh grave con beneficios controversiales ^6. Más recientemente, algunos tratamientos específicos para el virus se han comercializado, en particular, contra el virus de la gripe con el o desarrolloinhibidores de la neuraminidasa f ^3. Sin embargo, la gran diversidad y la aparición permanente de los virus de ARN se opone al desarrollo de tratamientos específicos contra cada uno de ellos en un futuro relativamente cercano. En conjunto, esto subraya la necesidad de estrategias eficaces para identificar y desarrollar moléculas antivirales potentes en un futuro próximo.

Es trivial decir que un inhibidor de amplio espectro activo frente a un gran panel de virus de ARN podría resolver este problema. Aunque tal molécula sigue siendo el sueño de un virólogo, nuestro conocimiento de los mecanismos de defensa celular y el sistema inmune innato sugieren que existen algunas posibilidades ^7,8. Varios laboratorios académicos e industriales están buscando moléculas que estimulan facetas específicas de los mecanismos de defensa celular o rutas metabólicas para embotar la replicación viral. Aunque tales compuestos probablemente mostrar efectos secundarios significativos, tratamientos contra las infecciones virales agudas serán administrarcado desde hace relativamente poco tiempo, lograr que sean aceptables a pesar de cierta toxicidad potencial en el largo plazo. Varias estrategias se han desarrollado para identificar tales moléculas antivirales de amplio espectro. Algunos programas de investigación tienen por objeto la búsqueda de moléculas que se dirigen a las vías de defensa o metabólicas específicas. Esto incluye, por ejemplo, receptores de reconocimiento de patógeno para provocar la expresión de genes antivirales ⁹ y activar factores antivirales tales como RNaseL ^10, maquinaria autofagia para promover la degradación de virus de ^11, la síntesis de nucleósido vías ^12,13, o cascadas apoptóticas para precipitar la muerte de las células infectadas por virus ^14. Otros grupos han desarrollado pantallas fenotípicas que no son objetivo basadas en ^13,15-17. En ese caso, las moléculas antivirales son simplemente identifican por su capacidad para bloquear la replicación viral en un sistema celular dado. La suposición general es que un compuesto inhibidor 2-3 virus ARN sin relación tendría un perfil adecuado para una amplia-spectrum molécula antiviral. El modo de acción de los compuestos seleccionados de golpe con un enfoque empírico sólo se determina en un segundo tiempo y, finalmente, puede conducir a la identificación de dianas celulares nuevos de antivirales. Curiosamente, un análisis retrospectivo de los nuevos medicamentos aprobados por la Food and Drug Administration de EE.UU. entre 1999 y 2008 ha puesto de manifiesto que, en general, dichas proyecciones fenotípicas tienden a obtener mejores resultados que los enfoques basados ​​en metas de descubrir drogas ¹⁸ de molécula pequeña primero en su clase .

La replicación viral en ensayos basados ​​en células de alto rendimiento se determinará a partir de los efectos citopáticos del virus. Las células se infectan y se cultivaron en 96 - o placas de 384 pocillos en presencia de compuestos ensayados. Después de pocos días, las capas celulares se fijaron y se tiñeron con colorantes tales como violeta cristal. Por último, se determina la absorbancia con un lector de placas y los compuestos que inhiben la replicación viral se identifican por su capacidad para conservar capas celulares lado a otrom de virus inducida por efecto citopático. Por otra parte, los efectos citopáticos mediadas por virus que se determina utilizando ensayos estándar de viabilidad como la reducción de MTS. Tales ensayos son altamente manejable y rentable, pero sufren de tres importantes limitaciones. En primer lugar, requieren una combinación virus-célula, donde la replicación viral es citopático en sólo unos pocos días, pero esto no siempre es posible, por lo que exigen enfoques alternativos ^19. En segundo lugar, son poco cuantitativa, ya que se basan en una medida indirecta de la replicación viral. Finalmente, los compuestos tóxicos pueden ser calificados como positivos hits, y por lo tanto deben ser eliminados con una pantalla de contador que mide la viabilidad celular. Para superar algunos de estos obstáculos, virus o replicones recombinantes han sido diseñados por la genética inversa para expresar proteínas informadoras, tales como EGFP o luciferasa, desde una unidad de transcripción adicional o en el marco con genes de proteínas virales (algunos ejemplos son ^20-23). Cuando estos virus se replican, pr reporterooteins se producen junto con las propias proteínas virales. Esto proporciona un ensayo muy cuantitativo para medir la replicación viral y evaluar la actividad inhibidora de las moléculas candidatas. Esto es particularmente cierto para los virus recombinantes que expresan luciferasa (u otras enzimas capaces de bioluminiscencia) ya que este sistema reportero exhibe un amplio rango dinámico con una alta sensibilidad y prácticamente sin fondo. Además, no hay una fuente de luz de excitación, evitando así la interferencia con fluorescencia compuesto ^24.

Aquí, nos detalle un protocolo de alto rendimiento para examinar bibliotecas químicas para los inhibidores de amplio espectro de virus de ARN. Los compuestos se ensayan primero en células humanas infectadas con un virus recombinante sarampión (MV) que expresa luciferasa de luciérnaga ²⁵ (rMV2/Luc, la Figura 1, la pantalla principal). MV pertenece a MONONEGAVIRALES orden, y es a menudo considerado como un miembro prototípico de virus de ARN de cadena negativaes. Como tal, MV genoma se utiliza como una plantilla por la polimerasa viral para sintetizar moléculas de ARNm que codifican para las proteínas virales. En la cepa recombinante MV llamado rMV2/Luc, la expresión de luciferasa se ​​expresa a partir de una unidad de transcripción adicional insertado entre los genes P y M (Figura 2A). En paralelo, los compuestos se ensayaron para determinar su toxicidad en células humanas utilizando un reactivo basado en luciferasa comercial que evalúa, mediante la cuantificación de ATP, el número de células metabólicamente activas en el cultivo (Figura 1, la pantalla principal). Bibliotecas químicas enteras pueden ser fácilmente evaluados con estos dos ensayos con el fin de seleccionar compuestos que no son tóxicos y bloquean eficazmente la replicación del MV. Luego, los golpes se volvieron a ensayar para la inhibición dosis-respuesta de la replicación del MV, la falta de toxicidad, así como por su capacidad de alterar el virus Chikungunya (CHIKV) replicación (Figura 1, la pantalla secundaria). CHIKV es un miembro de la familia Togaviridae y su genoma es apositive molécula de una sola cadena de ARN. Como tal, es completamente no relacionado con el sarampión y compuestos que inhiben tanto MV y CHIKV destacan una gran oportunidad para inhibir un gran panel de los virus ARN. Proteínas no estructurales CHIKV se traducen directamente desde el genoma viral, mientras que las proteínas estructurales son codificadas por la transcripción y traducción de una molécula de ARNm subgenómico. Nuestro ensayo de replicación in vitro para CHIKV se basa en una cepa recombinante llamado CHIKV / Ren, que expresa enzima luciferasa de Renilla como una parte escindida de la poliproteína no estructural a través de una inserción del gen reportero entre nsP3 y nsP4 secuencias ²⁶ (Figura 2B). La medida de la actividad de luciferasa de Renilla permite la monitorización de la replicación viral en la primera etapa del ciclo de vida CHIKV.

Este protocolo de alto rendimiento se utiliza para identificar de forma rápida los compuestos con un perfil adecuado de antivirales de amplio espectro en una biblioteca comercial de 10.000 molecdulos enriquecida por la diversidad química. Los compuestos fueron esencialmente siguiendo la regla del cinco de Lipinski, con pesos moleculares que van desde 250 hasta 600 daltons, y registrar valores de D por debajo de 5. La mayoría de estas moléculas eran nuevas entidades químicas que no están disponibles en otras bibliotecas comerciales.

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Protocolo

1. Preparación de placas de 96 pocillos hija con compuestos

1. Mueva placas madre de 96 pocillos que contienen 10 mM de soluciones madre de los compuestos químicos en DMSO de -20 ° C a temperatura ambiente. Diluir compuestos 5x en DMSO para obtener placas de dilución de 96 pocillos intermedios a 2 mM. La dilución se logra con la pipeta 5 l en 20 l de DMSO y la mezcla.
2. Pipetear 1 l de placas de dilución en pocillos secos de blanco, de cultivo de tejidos con código de barras placas de 96 pocillos. Este primer conjunto de placas hijas (D1) se puede utilizar para evaluar la toxicidad de los compuestos a una concentración final de 20 mM. Tienda placas hijas a -20 ° C hasta su uso.
3. Diluir 1:10 compuestos de nuevo pipeteando 4 l de placas de dilución en 36 l de DMSO y la mezcla. Pipetear 1 l en los pozos secos de color blanco, de fondo plano, cultivo de tejidos con código de barras placas de 96 pocillos. Este segundo conjunto de placas hijas (D2) se utiliza para evaluar la inhibición de la MV replication por los compuestos a una concentración final de 2 mM. Tienda placas hijas a -20 ° C hasta su uso.

2. Preparación de cultivos celulares para determinar la toxicidad Compuesto

1. Se cultivan las células HEK-293T a 37 ° C y 5% de _CO2 en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con estabilizado L-glutamina y complementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS), estreptomicina (100 mg / ml) y penicilina (100 UI / ml). Las células se pasan por tripsinización cada 4-5 días, y se diluyeron 1:10 en un frasco de dulce. Las células deben estar en fase de registro para los experimentos.
2. En el día del experimento, recuperar las células por tripsinización y realizar el recuento de células. Precipitar las células por centrifugación y resuspender en 3 x 10 ⁵ células / ml en medio de cultivo. Considere que se requieren 12,5 ml de suspensión de células para cada placa de cribado.
3. Células de transferencia a un canal, y prescindir de 100 l de suspensión celular en placas D1 contienen componentes químicos de pinchosunds. Suspensión celular dentro de la cubeta se agita con regularidad para evitar la sedimentación.
4. Adicionar de control de los pocillos A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 y G12 con 1 l de DMSO. Pocillos correspondientes se utilizarán como referencia para las células vivas (sin toxicidad). Pico de control de pozos B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 y H12 con 1 l de DMSO y 2,5 l de una solución IGEPAL 0,5% para eliminar las células. Pocillos correspondientes se utilizarán como referencia para las células muertas (de mayor toxicidad).
5. Se incuban las células durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO _2.

3. Preparación de cultivos celulares infectados por rMV2/Luc

1. Crecer y recuperar las células como se describe en 2.1 y 2.2. Una vez más, volver a suspender las células en 3 x 10 ⁵ células / ml en medio de cultivo. Considere que se requieren 12,5 ml de suspensión de células para cada placa de cribado.
2. Opcional: medio de cultivo con suplemento de uridina en 20 g / ml.
   Nota: Cuando la selección de bibliotecas químicas para replicatio viraln inhibidores, parece que compuestos dirigidos primeros pasos de la ruta de biosíntesis de pirimidina se aíslan con frecuencia ^13,16,27,28. La adición de uridina al medio de cultivo se utiliza para filtrar tales moléculas antivirales. De hecho, esto restaura eficazmente la replicación viral cuando las enzimas de aguas arriba de ruta de biosíntesis de pirimidina están bloqueadas.
3. Ahorra 1:10 de la suspensión celular de los pocillos de control con células no infectadas, y proceder a la infección con el volumen restante.
4. Descongele el volumen apropiado de la solución madre rMV2/Luc. Soluciones madre de MT son por lo general a 10 -10 ^{6 8} partículas infecciosas por ml. Cultura debe estar infectada con 0,1 partículas infecciosas de rMV2/Luc por las células diana, lo que corresponde a 0,1 multiplicidad de infección (MOI). Nota: rMV2/Luc se deriva de la vacuna MV (cepa Schwarz) y se manipula en un ambiente BSL2.
5. Añadir el virus a la suspensión de células y mezclar suavemente. Transferir las células infectadas a un abrevadero, y dispensar 100l de suspensión de células infectadas en las columnas 2 y 11 de las placas D2 contienen compuestos químicos con pinchos. Suspensión celular dentro de la cubeta se mezcla suavemente con regularidad.
6. En las columnas 1 y 12, dispense 100 l de células no infectadas una así en dos. Las células infectadas se dispensan en los otros pozos.
7. Se incuban las células durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO _2.

4. Medidas luciferasa Actividad y análisis de datos

1. Retire las placas D1 de la incubadora, y determinar la viabilidad celular mediante la adición de 50 l de reactivo de viabilidad basado en luciferasa directamente a los pocillos de cultivo. Mezclar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Leer las placas con un luminómetro. Tiempo de integración se establece en 100 mseg por pocillo.
2. Retire las placas D2 de la incubadora, y determinar la actividad luciferasa mediante la adición de 50 l de sustrato de luciferasa directamente a los pocillos de cultivo. Incubar durante 6 minutos a temperatura ambiente, y la lectura de las placas con un luminómetro como descrilecho por encima.
3. Calcular una Z '-factor para cada placa de D1 del ensayo de toxicidad para garantizar la calidad de la pantalla ^29. Z '= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), donde μ + y + σ corresponden a los medios de luminiscencia y desviaciones estándar para las células HEK-293T con DMSO solo (sin toxicidad), y μ y σ-son medios de luminiscencia y las desviaciones estándar para los pocillos de cultivo tratados con IGEPAL para matar las células. Se espera que Z 'para estar por encima de 0,5, o la placa correspondiente se descarta.
4. Establecer umbral de toxicidad en μ + / 2. Desechar los compuestos con valores de luminiscencia por debajo de este límite (Figura 3A).
5. Calcular una Z '-factor para cada placa de D2 de la ensayo antiviral. Aquí, μ + y + σ corresponden a los medios de luminiscencia y desviaciones estándar para las células infectadas cultivadas con DMSO solo, y μ-y σ-son medios de luminiscencia y desviaciones estándar para las células no infectadas. Una vez más, placas con Z & #39; valores por debajo de 0,5 se descartan.
6. Calcular la inhibición de la replicación vírica de la siguiente manera: porcentaje de inhibición = (μ + - actividad de la luciferasa para el compuesto X) / (μ + - μ-) * 100. Ajuste del umbral de inhibición a 75%, y seleccionar los compuestos que reduzcan los valores de luminiscencia por debajo de este límite (Figura 3B) y no son tóxicas según los criterios descritos en el punto 4.4.

5. Pantalla secundaria de la toxicidad y de amplio espectro antiviral Actividad

1. Asegúrese de 1:02 diluciones seriadas de cada golpe compuesto en DMSO, a partir de 500 M a 4 M (8 diluciones). Rellene blanco, placas de cultivo de tejidos con códigos de barras con 50 l de medio de cultivo. Añadir 1 l de cada dilución del compuesto en pocillos de cultivo. Repetir dos veces para tener 3 placas de cultivo con diluciones seriadas por duplicado para cada compuesto hit.
2. Preparar 37,5 ml de una suspensión de células HEK-293T en 6 x 10 ⁵ células / ml en medio de cultivo como se describió anteriormente (en 2,1 y 20,2). Dispense 2x 12,5 ml en tubos Falcon e infectar las células, ya sea con rMV2/Luc a MOI = 0,1 o CHIKV recombinante que expresa Renilla luciferasa (CHIKV / Ren) a MOI = 0,2. Mezclar por inversión.
   Nota: CHIKV / Ren se deriva de una cepa de tipo salvaje de CHIKV y por lo tanto debe ser manipulado en un entorno BSL3. Las placas se pueden mover de NBS3 a BSL1 una vez sustrato de Renilla se ha añadido a los pocillos de cultivo (véase a continuación).
3. Dispensar 50 / l de las células infectadas por Ren no infectadas, rMV2/Luc-infected, o CHIKV en placas de cultivo que contienen diluciones en serie de compuestos de ataque. Incubar 24 horas a 37 ° C.
4. Añadir 50 l de sustrato de luciferasa de luciérnaga para determinar la actividad luciferasa de luciérnaga en pozos rMV2/Luc-infected. Añadir 50 l de sustrato de luciferasa Renilla para determinar la actividad de la luciferasa de Renilla en CHIKV / pozos infectados por Ren. Finalmente, añadir 50 l de reactivo de ensayo de viabilidad basado en la luciferasa a células no infectadas para determinar la viabilidad celular.
5. Datos de gráficos (Figura 4) y determinar las concentraciones de compuestos que inhiben afectadas MV y replicación CHIKV en un 50%. No tenga en cuenta compuesto que muestra cierta toxicidad en este ensayo.

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Resultados

Esta tubería de detección se basa en primer lugar en la selección de compuestos que inhiben la replicación de MV y no muestran ninguna toxicidad celular significativa (figura 1, la pantalla principal). Se aprovecha de ensayos basados ​​en la luciferasa para determinar la toxicidad celular y la inhibición de la replicación viral. Todos los pasos de pipeteado y la adquisición de datos se puede realizar en un entorno de alto rendimiento con una plataforma robótica.

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Discusión

La tubería de cribado descrito aquí tiene como objetivo seleccionar compuestos con un perfil adecuado como inhibidores de amplio espectro de virus de ARN. Cuando una biblioteca de 10.000 compuestos se rastreó con este protocolo y se aplicaron los criterios de filtrado antes mencionados, es decir, la inhibición de la replicación del MV superior al 75%, 40 compuestos (0,4%) calificó como positivo. Además, aproximadamente la mitad de ellos mostró cierta toxicidad en el ensayo de viabilidad basado en la luc...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freedom EVO platform	TECAN		Robotic platform
96-well polystyrene cell culture microplates, white	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570	Luciferase-based viability assay
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Reagent containing firefly luciferase substrate
Renilla-Glo luciferase Assay System	Promega	E2710	Reagent containing Renilla luciferase substrate
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity.