Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos

Resumen

Las células dendríticas (DCs) secretan IL-1β en respuesta al reconocimiento TLR8 de purina sintética, R848, seguido por la activación inflamasoma NLRP3 con nigericina, por lo tanto, la IL-1β se puede utilizar para medir la actividad inflamasoma NLRP3. Tinción intracelular de citoquinas, inmunotransferencia, ELISA y se utilizan para medir con precisión NLRP3 inflamasoma el cebado y la activación a través de la expresión de IL-1β.

Resumen

Los procesos inflamatorios resultantes de la secreción de interleucina (IL) -1 citocinas de la familia de las células inmunes conducen a la inflamación local o sistémica, remodelación y reparación de tejidos, y el control virológico ^{1, 2.} La interleucina-1β es un elemento esencial de la respuesta inmune innata y contribuye a eliminar los patógenos invasores al tiempo que evita el establecimiento de la infección persistente ^1-5.

Inflamosomas son la plataforma de señalización clave para la activación de la interleucina 1 de la enzima convertidora (ICE o caspasa-1). El inflamasoma NLRP3 requiere al menos dos señales en los países en desarrollo para hacer que la secreción de IL-1β ^6. Pro-IL-1β expresión de la proteína se limita en las células en reposo; por lo tanto, se requiere una señal de cebado para la transcripción de IL-1β y expresión de la proteína. Una segunda señal detectada por los resultados NLRP3 en la formación de la inflamasoma NLRP3 multi-proteína. La capacidad de las células dendríticas para responsabilidadd para las señales requeridas para la secreción de IL-1β se puede probar usando una purina sintética, R848, que es detectado por TLR8 en monocitos humanos derivados de células dendríticas (moDCs) a las células principales, seguido por la activación de la inflamasoma NLRP3 con la toxina bacteriana y ionóforo de potasio, nigericina.

Monocitos DCs derivadas son fácilmente producidos en la cultura y proporcionan significativamente más células que purificados mieloide países en desarrollo humano. El método presentado aquí se diferencia de otros ensayos inflamasoma en que se utiliza en humanos in vitro, en lugar de ratón derivada, permitiendo así que los países en desarrollo para el estudio de la inflamasoma en la enfermedad humana y la infección.

Introducción

Se requiere Activación del sistema inmune innato para dirigir la respuesta inmune adaptativa durante la infección, la enfermedad y la vacunación ^7. Las células dendríticas son el antígeno más potente que presenta células del sistema inmune innato; están especializados para la captación de antígenos, la migración a los ganglios linfáticos, y la activación de citolítica CD8 ⁺ T-células ^8-10 ingenuo CD4 ⁺ y. Para habilitar la detección de patógenos rápida del sistema inmune innato utiliza numerosos receptores de reconocimiento de patrón de la línea germinal codificada (PRR) que reconocen patógenos motivos conservados derivados o marcadores de acogida derivado de estrés celular y el daño. Receptores tipo Toll (TLRs) son los receptores de reconocimiento de patrones unidas a la membrana que reconocen ciertos patógeno fagocitado extracelular patrones asociados molecular (PAMP) y los patrones moleculares de peligro asociado (apaga). Por el contrario guiño como receptores (NLRs) son citosólicas y responder a una amplia gama de PAMP y DAMPS. Nod como receptores representar una segunda línea de defensa contra los patógenos que evaden superficie celular y PRRs endocítica. La interacción de los patógenos derivada, o "peligro" asociada, factores con TLR y NLR ligandos conduce a un estado de maduración de las DC que resulta en una mayor interacción DC con otras células inmunes y la promoción de las células T y activación de las células asesinas naturales ^11.

La interleucina-1β es un componente crucial de la defensa del huésped contra la infección. A partir del reconocimiento de un microorganismo, la citoquina altamente proinflamatorias, IL-1β, se secreta y funciona como un atrayente de quimioterapia y activador de las células inmunitarias innatas y adaptativas. In vivo de IL-1β es en gran parte responsable de la respuesta de fase aguda incluyendo fiebre y citoquina inflamatoria síntesis ^12.

La mayoría de NLRs contienen un dominio rico en leucina repetir el terminal C que se cree que funcionar en la detección de ligando, un dominio de unión de nucleótidos central (NACHT) que es importante para la oligomerización NLRP3, y un dominio efector terminal de N (PYD en NLRP3) que media la transducción de señales a través de objetivos de abajo interacciones proteína-proteína. La proteína NLRP3 define el complejo más intensamente estudiado inflamasoma. Esta proteína es un miembro de la familia de NLR y tiene la capacidad para formar un complejo de proteínas múltiples molecular compuesta de NLRP3, la PYCARD proteína adaptadora (también conocido como ASC), y el ICE. Después de la activación inflamasoma PYCARD une al terminal de dominios NLRP3 N y recluta a través de ICE (tarjeta) dominios de activación de caspasas y contratación de dominio. La interleucina-1 de la enzima convertidora se genera inicialmente como un zimógeno que contiene un motivo TARJETA en su extremo N-terminal. Resultados de formación inflamasoma en la unión de dos moléculas de ICE suficientemente cerca para inducir su activación autocatalítica. El complejo inflamasoma es necesaria para la activación de ICE por lo tanto lo que le permite convertir citoplásmica Pro-IL-1β para madurar citoquina.

El éxito de la secreción de la IL-1β en los países en desarrollo requiere la detección de dos señales de peligro distintas e independientes. En primer lugar, TLR detección de PAMP, DAMPS, o la señalización de citoquinas (TNF o IL-1β) causa una regulación positiva de la expresión de la proteína citoplasmática pro-IL-1β. Se requiere una segunda frecuencia diferente, señal, para la formación de complejos inflamasoma aguas arriba de la maduración del ICE. Algunos inflamasoma estimular señales incluyen toxinas de los poros de la membrana bacteriana que forman (como nigericina), lisosomales interrumpir cristales (tales como cristales de urato monosódico, MSU) y ATP extracelular. El mecanismo ascendente que conduce a la activación NLRP3 inflamasoma por estos diversos activadores no está claro. Estudios de investigación de aguas arriba de señalización de la formación de inflamasoma propone que los eventos intracelulares, tales como la inducción de la hipopotasemia o especies reactivas de oxígeno (ROS) activan indirectamente la inflamasoma ^13-28.

Entre los diferentes activadores virales del inflamasoma NLRP3 es la influenza, que proporciona banto la señal primaria y secundaria requerida para la secreción de IL-1β ^{3, 29-33.} Utilizando modelos knockout NLRP3 ratón se encontró que la secreción de IL-1β en los países en desarrollo es NLRP3 dependiente ^32. Además, los ratones knockout NLRP3 atraídos menos leucocitos al sitio de la infección y experimentaron una mayor mortalidad ^{2, 5.} Dos estudios recientes sugieren un mecanismo para la activación inflamasoma NLRP3 durante la infección por el virus de la influenza; primero, el cebado a través del reconocimiento de ARN viral por TLR7 o TLR8 (dependiendo de TLR expresión de la célula de responder) o a través de sensores de las bacterias comensales por otro TLR para inducir la expresión en favor de la IL-1β citoplásmica, seguido por una segunda señal, la activación de NLRP3 formación inflamasoma por la proteína viral del canal iónico M2 en la red trans del Golgi ^{33, 34.} En este último paso, la activación del inflamasoma NLRP3 se logra mediante la alteración de la iónica intracelular entorno que conduce a la producción de ROS, que es, simplemente, detectada por NLPR3 como una señal para formar el inflamasoma. Sin embargo, el mecanismo exacto de la activación aguas arriba inflamasoma de la actividad de ICE durante la infección por influenza sigue siendo poco clara.

Este trabajo describe una técnica valiosa para el estudio de la inflamasoma NLRP3 en moDCs humanos que se puede utilizar como una base para la investigación adicional de la vía subyacente DC basado secreción de IL-1β en respuesta a TLR8 ligadura con R848 seguido por la activación de la inflamasoma por un pozo conocido activador de la NLRP3, nigericina. Las variaciones de este método se puede utilizar con otros tipos de células incluyendo, pero no limitados a: los monocitos, macrófagos, otros subconjuntos de DC, y células epiteliales.

Protocolo

Declaración de Ética: se obtienen y se almacenan para la investigación con el consentimiento de los donantes de muestras de investigación. Todas las muestras deben ser codificadas o anónimos antes de su uso. Este protocolo sigue las directrices de nuestra Junta de Revisión Institucional.

1. La diferenciación de los monocitos de sangre periférica humana en células dendríticas derivadas de monocitos.

Nota: capas leucocitarias humanas sirven como la fuente de las células de sangre periférica humana (PBMC) y se obtuvieron del Centro de Sangre de Nueva York (Nueva York, Nueva York). Los donantes de sangre son voluntarios sanos. El procedimiento de 5 días comienza con el forro de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en matraces de cultivo de tejidos ^35,36. Diferencias notables de los protocolos publicados son los siguientes:

1. Utilice 225 cm ² frascos de cultivo de tejidos de poliestireno no pirogénicos con una tapa de filtro para adherir un total de 2x10 ⁸ PBMCs por frasco en lugar de 10 cm de poliestireno placa de cultivo de tejidoss (58 cm ²⁾ (paso 1).
2. Preparar los medios de comunicación con 5% de suero humano combinado (PHS; 30 ml) en 500 ml de RPMI-1640 + L-glutamina, tampón 5 ml de HEPES 1 M, y 1,4 ml de 50 mg / ml de gentamicina (5% de PHS medios de comunicación) seguido por filtración a través un filtro de 20 mM. Añade un total de frasco de cultivo de 50 ml 5% PHS medios por 225 ^cm2 de tejido.
3. Lavar las células adheridas tres veces con 25 ml de RPMI-1640. Agitar enérgicamente durante 5 segundos durante cada lavado y aspirar las células no adherentes (paso 4).
4. Añadir 190 l de 400 UI / mu l de IL-4 y 380 l de 100 UI / l de GM-CSF por matraz (etapa 3) en el día 0, 2, y 4. Día 0 se define como el día PBMC se siembran inicialmente en el paso 1 (Paso 8).
5. Día de la Cosecha 5 moDCs a una concentración de 1x10 ⁶ células / ml (paso 15).
6. Utilice moDCs inmediatamente en su estado de reposo. Pasos 17-22 nunca se llevan a cabo. Nota: Las muestras deben ser procesadas tan pronto como sea posible después de la recolección para obtener mejores resultados.
7. MoDCs alícuotas a una concentraciónción de 2x10 ⁵ células / pocillo (200 l / pocillo de la 1x10 ⁶ células / ml) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (western blot, ELISA, FACS) o sobre una chamberslide poli-L-lisina tratado (microscopía) para la experimentación . Nota: Hay por lo menos 4 condiciones: Completamente sin estimular (control negativo), el cebado sólo, sólo la activación, y cebado seguido de activación. Las condiciones pueden ser expandidos para incluir controles de diluyente para R848 y nigericina si se desea. Si el ensayo es aguas abajo del ICS, los duplicados son necesarios para los controles de isotipo.

. 2 Cebado inflamasoma - Señal 1

1. Reconstituir liofilizado R848 en DMSO de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diluir solución de trabajo a TA con RPMI-1640.
2. Añadir R848 a una concentración final 10 mM a los pocillos durante 18 horas apropiarse. Coloque las células en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.

3 Activar la NLRP3 inflamasoma -. Señal2

1. Reconstituir nigericina liofilizado en etanol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diluir solución de trabajo a TA con RPMI-1640 antes de añadir a las condiciones apropiadas.
2. Añadir nigericina a una concentración final 20 mM y volver a la incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 6 horas. No hay etapas de lavado se producen entre el cebado y durante la activación. Nota: la secreción de IL-1β se incrementa por la presencia de ionóforos de calcio, brefeldina clorofenilhidrazona A, monensina, dinitrofenol, o cianuro de carbonilo ^{37, 38.} Por lo tanto, la adición de estos inhibidores de secreción no son recomendables cuando se analiza el cebado o actividad inflamasoma ya que altera la secreción de IL-1β.

4. IL-1ß Sample Collection

1. Centrifugar la placa con las células y los sobrenadantes a 974 xg durante 3 min.
2. Sin alterar el sedimento celular, aspirar el sobrenadante y transferir a comoSeparadas fondo redondo de placa con el fin de medir la secreción de citoquinas de los sobrenadantes. Nota: Los sobrenadantes se pueden almacenar temporalmente a -20 ° C o -80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
3. Lavar los pellets celulares tres veces con 200 l de 1x PBS a 974 xg durante 3 minutos para eliminar cualquier extracelular de IL-1β de las muestras celulares. Nota: Al lavar los sedimentos celulares de una placa de 96 pocillos, eliminar el lavado de placa por inversión rápida en una bandeja de recogida con el fin de no perturbar la muestra.

5. Medición de IL-1ß a partir de muestras celulares y el sobrenadante

1. Intracelular de citoquinas tinción (ICS): El protocolo ICS se describe a continuación ^{39, 40.} Nota: no suspender las células si el análisis de aguas abajo es la baciloscopia. Todos los lavados y aspiraciones deben hacerse sin alterar la capa de células / pellet (dependiendo del ensayo aguas abajo).
   1. Añadir 100 l de 5% de PHS medios en los pozos apropiados. Añadirvolumen apropiado (aproximadamente 1 μl/2x10 ⁵ células, o 1 l / pocillo) de la etiqueta fluorescente α-CD11c y α-CD14 (marcadores de fenotipo; clon B-Ly6 y MφP9, respectivamente) o control de isotipo a las células durante 10 min a RT en la oscuridad.
   2. Lavar tres veces con 1x PBS a 974 xg durante 3 min.
   3. Fijar las células mediante la adición de 100 l de PFA al 4% durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
   4. Pausa Point: Lavar con 100 l de PBS 1x a 974 g durante 3 min y se almacena a 4 ° CO / N en 1 × PBS.
   5. Añadir 100 l de tampón de permeabilización a las células durante 30 min. Nota: tampón de permeabilización se compone de 1x PBS con 0,3% de Triton X-100, y 1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante la permeabilización. No moleste a las células adherentes al ensayo de aguas abajo es la baciloscopia.
   6. Añadir el volumen adecuado (células de aproximadamente 62 ng antibody/2x10 ^5, aproximadamente el 2,5 l / pocillo) de α-IL-1β-FITC (clon 8516) o control de isotipo para2 horas en una incubadora a 37 ° C.
   7. Lavar las células tres veces con 200 l de tampón de permeabilización a 974 xg durante 3 minutos en la oscuridad.
   8. Opcional: Mancha con DAPI, añadir medio de montaje, y colocar cubreobjetos suavemente en la parte superior de un portaobjetos de vidrio. Permitir medio de montaje para curar O / N antes de la captura de imágenes de microscopía.
   9. Adquirir los datos por FACS o microscopía. Nota: Comparar el isotipo para cada condición de la tinción adecuada al analizar por FACS o microscopía.
      1. FAC: Adquirir una muestra a la vez. Establezca el / puerta SSC FSC en las células vivas, seguidas por gating en CD11c ⁺ CD14 ^- células antes de analizar la tinción pro-IL-1β población moDC.
      2. Microscopía: Ajuste el tiempo de exposición utilizando la muestra positiva tinción - R848 tratada. Utilice DAPI ⁺ pro-IL-1β ⁺ y DAPI ⁺ pro-IL-1β ^- para determinar el porcentaje de pro-IL-1β + moDCs expresan.
2. SDS-Página: inmunotransferencia se realiza para detectar pro-IL-1β. Nota: La técnica descrita a continuación combina técnica estándar inmunotransferencia, gradiente de gel de poliacrilamida 4-20%, y la detección fluorescente o quimioluminiscente ^{41, 42.}
   1. Lisar células directamente en 10 l de tampón de lisis de desnaturalización (5 l β-mercaptoethanol/950 tampón de muestra de Laemmli l seguido por dilución de 1:01 con tampón de lisis celular). Se transfiere el lisado a 1,5 ml de tubos de Eppendorf.
   2. Lisado de calor en una placa seca durante 10 minutos a 100 ° C.
   3. Girar lisado a 20.800 xg en un minicentrifuge durante 1 min para concentrar el volumen de líquido. Punto Pausa: las muestras pueden ser congeladas a -20 ° C para el almacenamiento a corto plazo.
   4. Cargue el volumen total en el gel de poliacrilamida. Ejecutar 140 V a través de la caja de gel de aproximadamente 1 hora, o hasta que el frente del colorante se sale de la parte inferior del gel.
   5. Transferencia de la proteína desde el gel de poliacrilamida sobre un membr de PVDF Immobilon-FLane durante 90 min a 100 V. Bloquear la membrana con 5% de BSA en solución salina tamponada de Tris / 0,1% de Tween-20 (TBS-T) durante 1 h. Nota: PVDF Immobilon-FL es el mejor para su uso con detección fluorescente. Se recomienda una membrana con una composición diferente para otras técnicas de detección para aumentar la relación señal a fondo.
   6. Diluir anticuerpos primarios y secundarios en 10 ml de 5% de BSA / TBS-T. Realizar las incubaciones de anticuerpos primarios a 4 ° CO / N mientras se agita y anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hora mientras se agita.
   7. Lavar la membrana 3 veces con TBS-T durante 5 minutos mientras se agita entre incubaciones de anticuerpos primarios y secundarios y de nuevo entre incubaciones secundarias y de formación de imágenes. Nota: Las bandas se pueden detectar usando fluorescente o detección quimioluminiscente. Siga las instrucciones del fabricante para la detección.
3. ELISA: Las muestras que se congelan para su almacenamiento es necesario que se equilibre a temperatura ambiente antes del análisis. Centrifugar las muestras en una centrífuga para consolidar de condensación de sobrenadanteación. Siga las instrucciones del fabricante para la medición de IL-1β. Nota: En este protocolo de IL-1β se mide específicamente; Sin embargo, la medición simultánea de TNFa, IL-6, y la citocina inmunomoduladora IL-10 se cebaron asegurar las condiciones apropiadas.

Resultados

Estas técnicas miden TLR8 cebado con R848. Tinción intracelular de citoquinas para pro-IL-1β permite microscopía y FAC lecturas de CD14 ^- CD11c ⁺ moDCs. Ambas técnicas se pueden cuantificar con relación a un no imprimado, o de descanso, el control celular, así como un control de isotipo (Figuras 1 y 2). Porcentaje de células pro-IL-1β ⁺ tinción se multiplica por la mediana geométrica de esta población para proporcionar la intensidad de fluorescencia media (MF...

Discusión

Las citocinas inflamatorias son integrales en la dirección de la respuesta inmune innata y adaptativa para combatir la infección viral. Secretada de IL-1β se ha demostrado que aumenta durante la infección por influenza ^{3, 43, 44.} Los mecanismos precisos por los que estas citoquinas se procesan en respuesta al reconocimiento viral en células dendríticas humanas no se entienden completamente. Kits de aislamiento DC mieloides son costosos y requerir mucho tiempo. Kits de aislamiento y clasificación FAC pu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
IL-4	R&D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine	Cellgro	10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells	New York Blood Center		PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12 well tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3516
96 well round bottom tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R&D	IC201F
FITC isotype control	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β-Tubulin	Santa Cruz	SC-9014
α-IL-1β	R&D	mab201
PVDF Immobilon-FL membrane	Millipore	IPFL00010
gradient 4-12% polycrylamide gel	Bio Rad	161-1159
Laemmli sample buffer	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30% solution sterile/filtered
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710	16% solution
Human inflammatory cytokine bead array kit	BD	551811
Nigericin	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M Corp.
α-CD14	BD	340436
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			On site stock room
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs	Thermo Scientific	159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units	Thermo Scientific	569-0020
HEPES	Invitrogen	15630080
Goat α-mouse IRDye 800CW	Licor	926-32210
Donkey α-rabbit IRDye 680RD	Licor	926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder	Thermo Scientific	26634
Tris Glycine SDS 10x	Bio Rad	1610732
Tris Glycine 10x	Bio Rad	161-0734
Methanol - 4 L	Fisher Scientific	A433P-4
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide	BD Falcon	354108
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707