Bioenergética y los Oxidativo ráfaga: Los protocolos para el aislamiento y la Evaluación de leucocitos humanos y plaquetas

Resumen

Leucocitos de la sangre y las plaquetas pueden ser utilizados como un marcador bioenergético de la salud general de un individuo y así tienen el potencial para controlar procesos patológicos y el impacto de los tratamientos. Aquí se describe un método para aislar y medir la función mitocondrial y la explosión oxidativa en estas células.

Resumen

La disfunción mitocondrial se sabe que juega un papel importante en un número de condiciones patológicas tales como la aterosclerosis, la diabetes, el choque séptico, y enfermedades neurodegenerativas, pero la evaluación de cambios en la función bioenergética en pacientes es un reto. Aunque las enfermedades tales como la diabetes o aterosclerosis clínicamente presente con insuficiencia órgano específico, los componentes sistémicos de la patología, tales como la hiperglucemia o la inflamación, pueden alterar la función bioenergética en los leucocitos o plaquetas circulantes. Este concepto ha sido reconocido desde hace algún tiempo, pero su aplicación generalizada se ha visto limitada por el gran número de células primarios necesarios para el análisis bioenergético. Esta limitación técnica ha sido superado mediante la combinación de la especificidad de las técnicas de aislamiento de perla magnética, técnicas de adhesión celular, que permiten a las células a ser unidos sin activación para microplacas, y la sensibilidad de las nuevas tecnologías diseñado para micrófono de alto rendimientorespirometría roplate. Un ejemplo de este equipo es el analizador de flujo extracelular. Tal instrumentación normalmente utiliza oxígeno y pH sondas sensibles para medir las tasas de cambio en estos parámetros en células adherentes, que pueden estar relacionados con el metabolismo. Aquí se detallan los métodos para el aislamiento y el chapado de monocitos, linfocitos, neutrófilos y plaquetas, y sin activación, a partir de sangre humana y el análisis de la función bioenergética mitocondrial en estas células. Además, demostramos cómo la explosión oxidativa en los monocitos y los neutrófilos también se puede medir en las mismas muestras. Dado que estos métodos utilizan sólo 8-20 ml de sangre humana que tienen un potencial para el control de generación de especies reactivas de oxígeno y la bioenergética en un entorno clínico.

Introducción

Control de la salud bioenergético de las células inmunes (monocitos, linfocitos, neutrófilos y plaquetas) a partir de sangre ha sido reconocida durante algún tiempo como una herramienta de diagnóstico potencialmente útil para evaluar la salud bioenergético general de un individuo. Hay un cuerpo emergente de la literatura atribuir un número de enfermedades tales como el cáncer, enfermedades cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas a ^1,2 disfunción mitocondrial. Esto es clínicamente importante, ya que la disfunción mitocondrial puede iniciar una serie de eventos celulares que promueven vías de señalización pro-inflamatorias o conducen a la muerte celular. Varios estudios han caracterizado la función mitocondrial de las células mononucleares de sangre periférica y plaquetas en condiciones tales como la fibromialgia, la diabetes, el choque séptico, y la enfermedad de Alzheimer ^3-7. Por ejemplo, un estudio reciente evaluó la bioenergética de plaquetas como un marcador para la función mitocondrial y se encontró que las plaquetas de Tipo 2 Diabetpacientes con CI habían disminuido mitocondrial ^7,8 consumo de oxígeno. A partir de estos hallazgos y otros, está claro que los monocitos, linfocitos, neutrófilos, y las plaquetas pueden servir como marcadores sustitutos de los cambios en la bioenergética bajo condiciones patológicas ya que encuesta de la circulación sistémica y pueden reflejar cambios metabólicos locales y globales. Para determinar si este enfoque tiene un método de alto rendimiento de análisis y se requiere un método consistente para la preparación de células valor pronóstico o de diagnóstico.

Los métodos para medir la función mitocondrial en los leucocitos y las plaquetas previamente han implicado el aislamiento de las mitocondrias o la evaluación de la bioenergética celular en células intactas ^4,9. La ventaja de la evaluación bioenergética celular utilizando un flujo extracelular (XF) analizador es que la función mitocondrial en las células se puede establecer con sustratos endógenos y los parámetros respiratorios tales como fugas de protones y respiratorio máximocapacidad se puede determinar. Nosotros y otros han utilizado esta tecnología para mostrar que los perfiles de bioenergéticos en plaquetas, monocitos y linfocitos aislados de sangre humana se pueden establecer y compararon entre los tipos de células ^8. Además, neutrófilos y monocitos poseen una capacidad de explosión oxidativa en el que se activan oxidasas NADPH y consumen el oxígeno para formar superóxido. Es importante destacar que esta vía es un componente clave de la inmunidad innata y es modulada por la inflamación sistémica. Por ejemplo, se ha demostrado que los cambios en la capacidad de estallido oxidativo se asocian con varias enfermedades autoinmunes tales como la esclerosis múltiple, artritis, infecciones recurrentes y ^10,11. De momento no hay alto rendimiento ensayos cuantitativos disponibles para medir el estallido oxidativo en muestras clínicas. Esto es importante ya que la caracterización de la capacidad de explosión oxidativa de los neutrófilos y los monocitos también puede servir como una herramienta de diagnóstico importante por varias patologíasgías.

Los principales desafíos técnicos han sido baja sensibilidad para la medición del consumo de oxígeno usando técnicas convencionales polarográficos y la necesidad de utilizar células unidas cuando se utilizan técnicas fluorométricos microplaca más sensibles. En este vídeo práctica, se describe la solución técnica a estos problemas. Detallamos los métodos para el aislamiento, la galvanoplastia y la medición de la bioenergética de monocitos, linfocitos, neutrófilos y plaquetas y la explosión oxidativa de los monocitos y los neutrófilos de la sangre humana. Este método es adecuado para la evaluación clínica de la bioenergética y el estallido oxidativo de los investigadores que tienen el acceso a una población de pacientes y la capacidad de obtener muestras de sangre fresca.

Protocolo

Todos los protocolos descritos en este manuscrito para la recogida de sangre, el aislamiento y el análisis han sido revisados ​​y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Alabama en Birmingham.

1. Aislamiento de células (Modificado de Histopaque Sigma-Aldrich Protocolo N º 1119 y Miltenyi Biotec MICROBEAD positiva y protocolos de selección negativa)

1. Centrifugar la sangre total (recogidas en ACD o tubos de EDTA) a 500 xg durante 15 min en una centrífuga con un rotor oscilante-cubo (aceleración = 5-6, y sin freno).
2. Retire la capa superior que contiene el plasma rico en plaquetas (PRP) con una pipeta de transferencia hasta el 1 cm se mantiene por encima de la capa de células (capa de eritrocitos / leucocitaria). Ponga a un lado el PRP a temperatura ambiente para su posterior procesamiento.
3. Transferir la capa leucocitaria a un tubo cónico de 50 ml estéril, se diluye hasta 24 ml con RPMI basal o a por lo menos 4 veces el volumen de partida capa leucocitaria.
   Nota: la mitad superior de la capa de glóbulos rojos puede hAVE a ser incluido, aunque esto se traducirá en aumentar el volumen de RPMI proporcionalmente.
4. Preparar el gradiente de densidad utilizando Ficoll de baja densidad con un peso específico de 1,077 (1,077) para la capa superior y de Ficoll de alta densidad con un peso específico de 1,119 (1,119) para la capa inferior en tres tubos cónicos de 15 ml (3 ml cada una). Para realizar este paso, primero añadir 1,077 a cada tubo. Usando una pipeta de 5 ml estrecha añadir 1119 a la parte inferior del tubo mediante la colocación de la punta de la pipeta por debajo de 1.077 y liberan lentamente el reactivo sin mezclarse con el gradiente superior. Un total de 6 ml de medios de gradiente de densidad debe estar presente en esta fase con una fase visible de separación en la marca de 3 ml.
5. Usando una pipeta automática, añadir 8 ml de sangre diluida (del paso 1.3) suavemente para cada tubo de gradiente utilizando el ajuste de baja potencia para evitar que perturben las capas de gradiente. El volumen total debe ser de 14 ml a este paso.
6. Tubos centrífuga a 700 g durante 30 min a temperatura ambiente (Acceleración 6, sin freno).
   Nota: En esta etapa, tres bandas distintas de células deben ser evidentes (Figura 1A). Las bandas superiores (entre 1077 y plasma) contiene células mononucleares (MNC) y plaquetas, y la banda media (entre 1007 y 1119) contiene células polimorfonucleares (PMN) y banda inferior (por debajo de 1119) contiene los glóbulos rojos.
7. Recoger el MNC y PMN separado mediante pipetas de vidrio estériles sin molestar a las otras bandas celulares. Combinar la población de MNC de cada tubo en un tubo cónico de 50 ml estéril. Repita esto para la población PMN también.
8. Añadir 4 volúmenes de medio RPMI a cada tubo que contiene las fracciones MNC y PMN respectivamente para diluir el gradiente de densidad.
9. Tubos de centrifugar a 700 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
10. Resuspender el sedimento celular y MNC pellet de células PMN en 1 ml de RPMI que contiene 0,5% ultra puro libre de ácidos grasos BSA (RPMI-BSA) y transferir a tubos de 1,5 ml estéril. Sedimenten las células usando un picofuge sobremesa para 30seg.
11. Desechar el sobrenadante y resuspender cada sedimento celular en 80 l de RPMI-BSA.
12. Añadir 20 l de perlas magnéticas anticuerpo marcado con antiCD14 al tubo que contiene la fracción MNC para la selección positiva de los monocitos. Para el tubo que contiene la fracción de células PMN, añadir 20 l de perlas magnéticas anticuerpo marcado con antiCD15 para la selección positiva de los neutrófilos. Incubar cada suspensión celular durante 15 min a 4 º C.
13. Lave cada suspensión de células con 1 ml de medio RPMI-BSA y pellets como antes y resuspender cada pellet en 500 l de RPMI-BSA.
14. Las células marcadas se separan en el campo magnético de la celda activada clasificación magnética (MACS) separador. Preparar las columnas MACS LS (uno para cada suspensión celular) mediante la colocación de la columna en el separador MACS y lavado con 3 ml de medio RPMI-BSA antes de la adición de la suspensión de células.
15. Después de aplicar suspensiones de células, lavar cada columna 3 veces con 3 ml de medio RPMI-BSA (asegúrese de dejar que el dre mediosn completamente entre lavados). Recoger la suspensión de células de flujo a través y lavados de columna en un tubo estéril.
16. Para aislar los monocitos y los neutrófilos, quitar la columna del campo magnético después del lavado final y la elución de las células seleccionadas positivamente en un tubo estéril con 5 ml de medio RPMI-BSA utilizando el émbolo de la columna.
17. Para aislar los linfocitos de pellets de la fracción de flujo a través de lavado de las multinacionales del paso 1,15 a 300 xg durante 10 min. Descartar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 80 l RPMI-BSA. Añadir 20 l de anticuerpos CD61 y CD235a y se incuba la suspensión celular durante 15 min a 4 º C. Repita la separación MACS como antes y se recoge el flujo a pesar de que contiene los linfocitos.
18. Para sedimentar los monocitos, neutrófilos, linfocitos y fracciones, de centrífuga como antes (paso 1.9) y desechar los sobrenadantes. Los sedimentos celulares se deben resuspendieron en 1 ml extracelulares de flujo medio (XF-DMEM) para el recuento.
    Nota: 8 ml de sangre entera deben resultar en 1-5 x 10 ⁶ monocitos / ml, y 5-20 x 10 ⁶ linfocitos y neutrófilos / ml.
19. Para aislar las plaquetas, PRP centrífuga (paso 1.2) para 8-10 min a 1500 x g a temperatura ambiente. Retire el plasma y lavar sedimento celular una vez con estériles 5 ml de PBS suplementado con 1 mg / ml de PGI _2, repellet y suspender sedimento final en 1 ml de PBS-IGP tampón _2.
20. Determinar recuento de plaquetas por turbidimetría una vez que las plaquetas se suspenden en PBS-IGP tampón ₂ por espectrofotómetro tal como se describe por Walkowiak et al uso de la siguiente ecuación: [6,23 / (2,016 - Abs _800)] - 3,09 x factor de dilución = # 10 x ^8. plaquetas / ml ^12.

2. Plating de las células

1. Preparación de Cell-Tak (adhesivo celular): Añadir adhesiva celular 90 l 180 l diH ₂ 0, 540 l de 0,1 N bi sodiocarbonato (pH 8,0), y ajustar el pH a 7.2 a 7.8 con 1 N de NaOH. Preparar placas XF (de 24 pocillos, V7 microplacas) mediante el recubrimiento de cada pocillo con 30 l de adhesivo de células preparada.
   Nota: El adhesivo celular debe prepararse fresca para cada uso.
2. Incubar la placa a 37 º C durante 20-30 min a continuación, adhesivo de células Aspirar y lavar los pocillos dos veces con PBS (1 ml / pocillo).
3. Realizar un recuento de células en monocitos aislados, linfocitos, neutrófilos y plaquetas y llevar a volumen apropiado utilizando XF-DMEM para permitir una densidad de siembra de 250k células / pocillo para los monocitos, linfocitos y neutrófilos, y 25 x 10 ⁶ / pocillo para las plaquetas. Alternativamente, para medir la respuesta de estallido oxidativo, los neutrófilos pueden ser sembradas a 125 K células / pocillo. El volumen de la siembra final para cada suspensión celular debe ser de 200 l / pocillo.
4. Centrifugar la placa a 200 xg durante 1 seg sin freno. Gire la placa de 180 ˚ y centrifugar de nuevo sin freno a 300 x g.
5. Traiga vol pocillo finalUME a 660 l con XF-DMEM y se incuba a 37 º C durante 30 min antes del ensayo XF. Nota: Las fotomicrografías de células cultivadas en placas antes y después del ensayo se puede usar para asegurar chapado adecuado y descartar desprendimiento celular.

3. Preparación de un 24-así placa extracelular Ensayo de flujo (XF24)

1. Hidrato XF sondas con solución de calibrado para un mínimo de 2 horas antes del ensayo.
2. Preparar 10x existencias de 0,5 mg / ml, 0,6 M oligomicina FCCP, y 10 mM antimicina A en XF-DMEM y la carga de 75 l de soluciones madre en los puertos de inyección del cartucho en el orden anterior. Si las mediciones de ráfagas oxidativas se han de obtener, la inyección de 10x de 100 ng ml de PMA / puede inyectarse después antimicina-A.
3. Calibrar el cartucho hidratado y cargada y realizar el ensayo XF. Los métodos detallados para el análisis y la interpretación de tanto el consumo de oxígeno y pH cambios se han descrito en publicaciones previas ^9,13,14 y no se discussed en detalle aquí.
4. Después de ensayo XF, aspirar todo, pero los últimos 50 l de XF-DMEM después de ensayo para prevenir la pérdida de células de la placa y añadir 50 l de tampón de lisis RIPA de células y realizar un ensayo de proteínas para la normalización.

Resultados

Con el fin de evaluar la bioenergética de células de la sangre, la sangre total se obtiene de sujetos humanos por punción venosa en un tubo de recogida de vacutainer con EDTA o ACD. El aislamiento de leucocitos y plaquetas después de la recogida de sangre se visualiza en la Figura 1A como se detalla en el protocolo. Las muestras de sangre se procesan dentro de las 8 horas de la recolección para evitar la muerte celular y la activación. Los tiempos de almacenamiento ampliada de más de 8 horas no han sido evaluados, pero pueden dar lugar a la bioenergética alteradas y ser menos representativa de las condiciones fisiológicas. Tubos de dextrosa citrato ácido (ACD-8 ml) y vacutainer con EDTA se han utilizado para aislamientos de células sin efecto observado en la función bioenergética de células aisladas. Los anticoagulantes son necesarios ya que los coágulos de reducir el número de células obtenidas, interfieren con la formación de fases apropiada durante la centrifugación en gradiente de Ficoll, y dan como resultado poco o nada de plaquetas obtenidos en el suero se centrifugó. Toda la sangre representa un biologpeligro ical y equipo de protección personal deben ser implementadas a lo largo de todo el procedimiento, incluso después de las poblaciones de células se aíslan o lisados ​​celulares se generan. Las muestras deben ser eliminados de acuerdo con las normas de eliminación de residuos humanos de la institución.

La sangre total se centrifuga para separar el plasma rico en plaquetas a partir de la capa leucocitaria, la capa blanca justo por encima de los glóbulos rojos empaquetados que contiene los leucocitos. La capa leucocitaria se aplica a los gradientes de densidad y se centrifugó para obtener las células mononucleares de sangre periférica (monocitos y linfocitos) y células polimorfonucleares (granulocitos). Contaminación de la FC de las fases celulares individuales MNC y PMN es común en esta etapa y debe ser resuelto durante la purificación MACS. Los diversos tipos de células se obtienen entonces por incubación con anticuerpos magnéticas para obtener fracciones puras. Los monocitos se recogen por incubación de la fracción de PBMC con CD14, el flujo a través de Tmonocitos que contienen linfocitos, que a continuación se agotan de glóbulos rojos y plaquetas. Los neutrófilos se obtienen mediante la incubación de la capa de células polimorfonucleares con el anticuerpo CD15 (Figura 1A). A partir de entonces, las plaquetas pueden ser sedimentaron por centrifugación del plasma rico en plaquetas y se lavan para eliminar otros componentes del plasma. Después de estas selecciones las plaquetas, monocitos CD14 +, linfocitos, neutrófilos CD15 + se pueden contar y se sembraron en una placa analizador de adhesión celular recubierto de mediano XF para la bioenergética y el análisis de la explosión oxidativa.

Cada etapa del procedimiento debe realizarse en condiciones estériles y se anima a evitar la activación prematura de la respuesta de estallido oxidativo en monocitos y neutrófilos. Un indicador de menos de condiciones estériles durante el aislamiento es evidente cuando los neutrófilos, que tienen poco o ningún consumo de oxígeno en condiciones basales, comienzan el ensayo de flujo extracelular con mediciones elevadas de OCR queaumentar o disminuir a lo largo del ensayo de forma gradual. Hacemos hincapié en la importancia de imágenes de células mediante microscopía de luz a 200X o más para asegurarse de que no hay signos morfológicos de activación se han producido antes del ensayo. Por ejemplo, los neutrófilos normalmente muestran una redondeada a la forma irregular con límites de las celdas marcadas como se ve en la Figura 1B. Sin embargo, estas células se aplanan contra la superficie de la placa cuando se activa y perder su morfología celular distinta. Hemos informado anteriormente de que los cambios morfológicos de los leucocitos y las plaquetas activadas mediante este protocolo y se deben tomar medidas adicionales para garantizar condiciones estériles si encuentro activación ^8.

Un esquema simplificado del protocolo se ve en la Figura 2 como una tabla de tiempo en el que los pasos principales de la aislamiento de células, XF placa preparación, y ensayo de XF son detallada. El aislamiento consiste en la separación por gradiente de densidad de tipos de células yes seguido por separación magnética. Paralelo al proceso de aislamiento de células, XF placa preparación es necesaria para evitar retrasos en la celda o de chapado de comenzar el ensayo XF. Esto es fundamental, ya que los retrasos significativos pueden conducir a la activación celular y los parámetros bioenergéticos disminuidos.

Concentraciones de células inadecuada después de aislamiento son un problema y la optimización de cada proceso de centrifugación común es necesario para evitar la pérdida de células. Aislamientos exitosos se han realizado en tan sólo 6 ml de sangre pero las alteraciones se pueden hacer en función de las concentraciones del tipo celular deseado en circulación. Si el gradiente de densidad se prepara de forma inadecuada, fases de células diferenciadas podrían no ser visibles y pueden ocurrir pérdida de células (ver JoVE video instructivo para una demostración visual). Plaquetas insuficiente aislado del PRP es rara, pero se ha producido si el buffer de lavado no contiene PGI ₂ o si el aislamiento se lleva a cabo por debajo de la temperatura ambiente. El riesgo de una plaquetasctivation se evita a menudo si las plaquetas son las últimas células que se van aislados, sin embargo, si las plaquetas permanecen en tampón de lavado durante períodos prolongados se verán afectados la bioenergética. Se han dado casos de las poblaciones más pequeñas de plaquetas que no pellet durante la centrifugación 1.500 xg y la bioenergética de estas células no se ha caracterizado ampliamente. Consulte la Tabla 2 para una guía más completa sobre la solución de problemas.

Los perfiles bioenergéticas de los leucocitos y las plaquetas se pueden determinar usando el analizador XF, que mide en tiempo real consumo de O ₂ en las células de forma no invasiva. Cada tipo de célula se cultiva en placa sobre la placa de XF24 con cinco repeticiones como se muestra en la Figura 3A. Tabla 1 indica la valores basales y el estallido oxidativo esperados por tipo de células durante el ensayo y las concentraciones medias de proteína por pozo. Tecnologías de mayor rendimiento están disponibles, tales como el XF96, que permitecuatro donantes a ser evaluadas simultáneamente como se muestra en la Figura 3B. Después del ensayo, los datos se exportan a un ordenador puesto de trabajo para el análisis utilizando el software XF adecuada y Microsoft Excel. Los valores de OCR se normalizaron con el contenido total de proteínas en los pocillos correspondientes y se expresaron como pmol / min / mg de proteína. Los perfiles de ráfaga-bioenergéticos oxidativo representativas de cada tipo de célula se informó recientemente por nuestro grupo de ^8. Un análisis más detallado de los parámetros bioenergéticos del ensayo (basal, el ATP-ligado, de fugas de protones, máxima, no mitocondriales y estallido oxidativo) puede calcularse para pozos individuales como se indica anteriormente y se describe a continuación ^8.

La tasa de consumo de oxígeno basal (OCR) es establecida por los primeros 3 mediciones como se muestra en la Figura 4A. Oligomicina (0,5 g / ml), un inhibidor de la ATP mitocondrial-sintasa se inyecta en el medio XF para estimar el OCR acoplado a la síntesis de ATP y representación Ted como vinculados-ATP. El OCR residual menos el OCR no mitocondriales pueden ser atribuidos a la fuga de protones. Entonces se añade un desacoplador FCCP para determinar la máxima de OCR, seguido de antimicina-A, un inhibidor de la respiración mitocondrial, para determinar las fuentes no mitocondriales de consumo de oxígeno. La capacidad de reserva es una medida de la cantidad de ATP que se puede producir bajo demanda energética y se puede calcular como la diferencia entre el porcentaje máximo de la respiración y la basal. Con el fin de determinar la capacidad de ruptura oxidativa, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) un agonista de la PKC se inyecta para aumentar la actividad de la NADPH oxidasa, y el aumento en la tasa de consumo de oxígeno tras la estimulación con PMA se puede medir usando el analizador XF. Figura 4B mostrar la forma de calcular los distintos parámetros de la función mitocondrial y el estallido oxidativo.

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Figura 1. Aislamiento de leucocitos y plaquetas de sangre entera. A) los especímenes recién recogida se separan en su plasma y componentes celulares por centrifugación y se purificaron mediante gradiente de densidad Ficoll y magnética clasificación de células activadas (MACS) por positivo (monocitos y neutrófilos) o selección negativa (linfocitos), mientras que las plaquetas están aislados por una alta velocidad de la centrifugación del plasma rico en plaquetas. B) Las imágenes de las poblaciones de células aisladas vez resuspendidas en DMEM XF y chapadas en densidades celulares indicadas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Preparación de las placas XF24 para estudios bioenergético de leucocitos y plaquetas. Línea de tiempo detallada para la preparación de una placa de ensayo XF24 por aislamiento de células y de las planchas y la hidratación del cartucho y el puerto de inyección de carga.

Figura 3. Disposición de los leucocitos y las plaquetas en XF24 y XF96 placas analizador. A) Los leucocitos (células 125-250k / pocillo) y las plaquetas (25 x 10 ⁶ células / pocillo) de un solo donante se colocan en la placa de ensayo XF24 entre fondo controles. 75 l de 10x existencias de oligomicina (0,5 g / ml), FCCP (0,6 M), antimicina A (10 mM), y la PMA (100 ng / ml) diluido en medios XF se cargan ena los puertos de inyección indicadas. B) Los leucocitos (células 75-150k / pocillo) y las plaquetas (10 x10 ⁶ células / pocillo) de un máximo de cuatro donantes puede ser plateado en el XF96 en un volumen total de 180 l XF-DMEM. 20 l de 10x existencias de oligomicina (1,0 g / ml), FCCP (0,6 M), antimicina A (10 mM), y PMA (100 ng / ml) diluido en XF-DMEM que se cargan en los puertos de inyección indicados.

Figura 4. Análisis de los índices bioenergéticos. A) traza Representante de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) por las mitocondrias y el estallido oxidativo en los monocitos. Basal OCR se estableció (primeros 3 tipos según lo señalado por los números en círculos). Entonces adiciones secuenciales de oligomicina (o; 0,5 g / ml), FCCP (F; 0,6 M) y antimycin-A (A; 10 mM) se inyectan para determinar la mitocondria y la respiración no mitocondriales de las células no activadas. Finalmente, PMA (100 ng / ml) se añade para medir el estallido oxidativo. B) análisis modular de la función mitocondrial y explosión oxidativa se calculan por las diferencias en las tasas como se indica.

	Densidad de siembra óptima	Promedio. Basal OCR (pmol O 2 / min)	Promedio. Estallido oxidativo OCR (pmol O 2 / min)	Promedio. proteína (g) / pocillo
Los monocitos	250k células / pocillo	83,9 (± 13,0)	300,3 (± 58,8)	19,0 (± 2,4)
Los neutrófilos	250k células / pocillo	6,1 (± 2,2)	1411,8 (± 233.3)	20,6 (± 2,7)
Los linfocitos	250k células / pocillo	52,9 (± 7,7)	15 (± 4,1)	13,2 (± 2,1)
Las plaquetas	25 x 10 6 células / pocillo	199,4 (± 20,3)	24 (± 2,7)	47,5 (± 3,1)

Tabla 1. Parámetros normales para el ensayo XF24: El promedio basal (Tarifa 3), y el estallido oxidativo (Tarifa 7) OCR no corrige a OCR no mitocondriales o proteína se muestran según el tipo de células en placas a las densidades celulares indicadas. El contenido medio de proteína por pozo se muestra como se realizó mediante un ensayo DC Lowry. Estos datos representan los valores medios de6-8 donantes sanos con paréntesis que contiene ± SEM.

Paso	Problema	Posible razón	Solución
1.2	plasma claro	plaquetas sedimentadas durante la centrifugación	disminuir el tiempo de centrifugación de 10 min o lenta a 400 xg
	plasma lechosa	el exceso de lípidos	evitar la recolección postprandial
1.6	bandas celulares incompletas formadas	diablillopreparación gradiente cordelero, reactivo frío	evitar la interrupción de gradiente durante el pipeteado, reactivo de temperatura y utilizarlo habitación
	grupos en bandas celulares	coagulación de la sangre puede haber ocurrido	Recoger la sangre usando anticoagulantes como ACD o EDTA
1.10	No sedimento celular	véase el paso 1.6	Si nebuloso sobrenadante ver más abajo
	sobrenadante turbio	Contaminación gradiente de Ficoll pesado, contaminación por plaquetas	Aumentar la velocidad de la centrifugación a 900 xg, dilaúd con más RPMI
1.16, 1.17	bajo rendimiento de los leucocitos	contaminación grave RBC, no llega suficiente sangre entera, la coagulación	Volúmenes de anticuerpos doble y RPMI-BSA, recoger más sangre, añadir anticoagulante
1.19	la agregación plaquetaria	PGI 2 se omite, la exposición a los medios de comunicación en frío, el almacenamiento prolongado en el plasma	añadir PGI 2 de tampón de lavado de plaquetas, reactivos de temperatura uso de la sala
1.20	bajo recuento de plaquetas	pérdida durante la centrifugación primaria, la agregación plaquetaria	Verpasos 1.2 y 1.19
2.3	Contaminación de la FC		Repita separación MACS

Tabla 2. Leucocitos y plaquetas aislamiento solución de problemas. La tabla muestra los problemas comunes encontrados durante leucocitos y plaquetas aislamiento de células de la sangre y soluciones que pueden orientar a los usuarios a través del proceso de resolución de problemas en general.

Discusión

Este protocolo representa la compilación de varias técnicas comúnmente utilizadas para el aislamiento de células de la sangre en una forma adecuada para el análisis de la bioenergética. Las técnicas contiguos presentados son ventajosas para otros métodos de aislamiento (es decir, análisis de FACS) para su capacidad de aislar grandes números de células en las condiciones de los medios de comunicación controlados con tensiones mínimas colocados en las células aisladas. Tiene la desventaja de largos aislamientos incluso con interrupciones mínimas. Este protocolo sirve como la base para el aislamiento de células de la sangre primarios a partir de sujetos humanos, que pueden ser extrapoladas en entornos clínicos y de investigación traslacional.

MACS separación es una técnica fiable de aislamiento de células que ofrece la posibilidad de aislar las células directamente de la sangre entera, sin embargo, este método requiere mayores cantidades de anticuerpo y no es óptimo para el aislamiento de todos los cuatro tipos de células distintas que se describen en este método. Tiene ybeen hay evidencia para demostrar que la selección positiva de los leucocitos por resultados de separación MACS en la activación utilizando nuestro protocolo de aislamiento. Columnas MACS funcionan mediante el secuestro de células marcadas en un campo magnético utilizando anticuerpos conjugados con 50 partículas superparamagnéticas nm. Las células marcadas se eluyen de la columna. Selecciones positivos y negativos se implementan en este protocolo para garantizar el aislamiento rápido y pureza. Si el número de células inadecuadas se obtienen de aislamiento o pureza está en cuestión, más anticuerpos pueden ser añadidos a la muestra según la instrucción del proveedor y segundo paso a través de la columna de la LS puede resultar en una mayor pureza (Tabla 2). Nuestro laboratorio encontró alta pureza y eficiencia en placas utilizando el protocolo existente mediante el análisis de las suspensiones celulares finales por análisis FACS ^8.

Analizadores de flujo extracelulares tienen la capacidad de controlar tanto el consumo de oxígeno y la acidificación de los medios de comunicación en tiempo real sobre la de OTsus electrodos. El consumo de oxígeno como se observa por la respuesta de estallido oxidativo en neutrófilos y monocitos es dependiente de la NADPH oxidasa como se muestra por la inhibición con el DIP ^8. Hemos visto una pérdida de tiempo depende de la capacidad de ruptura oxidativa con aislamientos prolongados o ensayos XF extendidas. Este protocolo fue diseñado y desarrollado para su uso en la XF24 pero también es compatible con el XF96 en aproximadamente un tercio a la mitad de la célula XF24 siembra de densidades (Figura 3).

En el diseño de este protocolo, se requiere la adhesión a los protocolos existentes para cada técnica para un rendimiento óptimo con las modificaciones realizadas exclusivamente para el control de las condiciones de los medios de comunicación para el análisis bioenergético. Después de dominar técnicas, un protocolo de este tipo se puede utilizar en una amplia gama de aplicaciones de la traducción y de investigación para medir la toxicidad o eficacia de las estrategias de tratamiento, explorar características metabólicas de la enfermedad, y la producción de oxidantes por los monocitos y Neutrophils en condiciones inflamatorias.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
QuadroMACS Starting Kit includes QuadroMACS Separator and MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-094-833
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-501
CD61 MicroBeads, human  for platelets	Miltenyi Biotec	130-051-101
CD14 MicroBeads, human  for monocytes	Miltenyi Biotec	130-050-201
CD15 MicroBeads, human  for granulocytes	Miltenyi Biotec	130-046-601
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes	Fisher	02-684-26
RPMI 1640	Gibco	11835-030	with L-glutamine and without phenol red
Prostaglandin I2, sodium salt	Cayman	18220
1.5 ml semi-micro cuvettes	Phenix Research Products	SC-2410
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077	Sigma	10771
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119	Sigma	11191
Bovine Serum Albumin Fraction V	Roche	3117405001	fatty-acid ultra-free
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma	P8139
XF24 FluxPak	Seahorse Biosciences	100850-001
DMEM	Fisher	MT90113PB	w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate
L-Glutamine, 200 mM (100x)	Invitrogen	25030-081
D-Glucose	Sigma	G7528
Sodium Pyruvate	Sigma	P8574
Cell-Tak (cell adhesive)	BD Biosciences	CB-40242
Oligomycin	Sigma	O4876
Antimycin A	Sigma	A8674
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma	C-2920
DC Protein Assay Reagent A	Bio-Rad	500-0113
DC Protein Assay Reagent S	Bio-Rad	500-0015
DC Protein Assay Reagent B	Bio-Rad	500-0114
Seahorse	Seahorse Biosciences
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-090-976 and 24039
Spectrophotometer