Nanopodia - Proyecciones membrana delgada y frágil con papeles en Movimiento Celular y intercelulares Interacciones

Resumen

Nanopodia son los canales de membrana delgada pero frágiles que se extienden hasta 100 micras de los principales delantero o trasero trasero de una célula y perciben el entorno celular. La fijación directa a 37 ° C, lavado suave, y la evitación de disolventes orgánicos como etanol, metanol, o acetona y de mayores Triton X-100 concentraciones están obligados a observar estas estructuras celulares.

Resumen

Las células adherentes en cultivo mantienen un estado polarizado para apoyar el movimiento y las interacciones intercelulares. Nanopodia son delgadas, alargadas, en gran parte proyecciones de membrana F-actina negativos en las células endoteliales y de cáncer que se pueden visualizar a través TM4SF1 (transmembrana-4-L-seis-familia-1) la tinción de inmunofluorescencia. Racimos TM4SF1 en 100-300 micras de diámetro TMED (TM 4SF1 e nriched micro omains d) que contiene 3 a un máximo de 14 TM4SF1 moléculas individuales. TMED están dispuestas intermitentemente a lo largo nanopodia con una separación regular de 1 a 3 TMED por μ m y anclar firmemente nanopodia a la matriz. Esto permite nanopodia extender más de 100 μ m de la parte delantera o trasera que conduce trasera del endoteliales tumorales o células polarizadas, y hace que los residuos de la membrana a quedar atrás en matrIX cuando la célula se aleja. TMED y nanopodia han pasado por alto debido a su extrema fragilidad y sensibilidad a la temperatura. Lavado de rutina y fijación interrumpen la estructura. Nanopodia se conservan por fijación directa en paraformaldehído (PFA) a 37 ° C, seguido por una breve exposición a 0,01% de Triton X-100 antes de la tinción. Nanopodia abrir nuevas perspectivas en la biología celular: prometen a remodelar nuestra comprensión de cómo las células perciben su entorno, detectar e identificar otras células a distancia, iniciar interacciones intercelulares en estrecho contacto, y de los mecanismos de señalización que participan en el movimiento, la proliferación celular y la comunicaciones en células. Los métodos que se desarrollan para el estudio nanopodia derivados de TM4SF1 pueden ser útiles para los estudios de nanopodia que se forman en otros tipos de células a través de la agencia de tetraspanins clásicos, especialmente el CD9 expresión ubicua, CD81, CD151 y.

Introducción

Durante la polarización para el movimiento, las células animales se extienden una variedad de salientes, de membrana dinámicos de sus superficies, incluyendo filopodios, lamelipodios, fibras de retracción, y volantes ^1. Recientemente añadido a esta lista fueron nanopodia, un tipo recién reconocido de fina (100-300 m de diámetro), alargadas (hasta 50-100 m de largo) de proyección de la membrana que proporcionan los canales de membrana para la extensión de las estructuras de actina F, como filopodios y retracción de la fibra, y que la mancha positivamente con TM4SF1 (transmembrana-4-L-seis-familia-1) en endoteliales y tumorales células cultivadas ^2,3.

TM4SF1 es una proteína con topología de tetraspanin como que se conocía originalmente como un antígeno de célula tumoral ⁴ antes de que el descubrimiento de que la molécula es un biomarcador de células endoteliales que desempeña un papel esencial en la proliferación celular endotelial y la migración ^2,3. La tinción de inmunofluorescencia reveló que TM4SF1 se localiza en perinucLear y vesículas a la membrana plasmática, y se enriquece en TM 4SF1 e nriched omains d micro (TMED). TMED nanopodia anclaje a la matriz y el presente en un patrón de bandas espaciadas regularmente de 1-3 longitud TMED / m de nanopodia. Nanopodia típicamente se extienden desde delante líder de una célula y de salida trasera durante la polarización de las células para el movimiento. Debido a la naturaleza adherente firme de TMED, nanopodia son incapaces de retraer de nuevo en la celda de medida que se aleja; por tanto, los residuos abandonados nanopodia trazan la trayectoria de movimiento celular. Nanopodia proporcionar canales de membrana para la extensión F-actina y la retracción, y son los sitios de las interacciones intercelulares y comunicaciones ^2,3. Estas características hacen que nanopodia proporcionan una oportunidad única para estudiar los mecanismos subyacentes conjunto de F-actina durante la polarización celular, la detección celular del medio ambiente, la determinación de la ruta de acceso y la dirección de movimiento de la célula, y las interacciones intercelulares unND comunicaciones.

Debido a la naturaleza altamente hidrofóbica de TMED y la naturaleza membranosa delgada y frágil de nanopodia, especial cuidado debe tomarse con el fin de preservar la TMED y nanopodia. La destrucción de nanopodia y remoción de TMED por métodos comunes de laboratorio es una posible razón por la que sólo sesenta y tres publicaciones han aparecido en TM4SF1 desde su primer descubrimiento en 1986 ¹ y por la falta total de conocimiento de enriquecimiento TM4SF1 en 100-300 micras microdominios en la superficie de la célula hasta que el informe de TM4SF1 en las células endoteliales en 2009 ^2.

Métodos de inmunotinción convencionales suelen utilizar disolventes orgánicos como etanol, metanol, o acetona para fijar las células y el uso de 0,1% o mayor concentración de Triton X-100 para permeabilizar las células ^5. Los estudios aquí descritos implementaron tres grandes cambios con el método convencional para revelar TMED y nanopodia: (i) utilizan 37 ° C 4% PFA y fijar las células en un 3776; incubadora, (ii) aplicar el lavado de PBS temperatura ambiente suave, y (iii) el uso de menos de 0,03% de Triton X-100 sólo brevemente para permeabilizar las células antes de la adición de anticuerpo primario, como X-100 mayor que 0,03% extraerá Tritón TM4SF1.

Todos los tetraspanins forman microdominios en la membrana de la célula ⁶ y algunos colocalize con TMED en endoteliales y células tumorales ^2,3. Como tetraspanins como CD9, CD81, CD151 y se expresan de manera ubicua, el protocolo de tinción descrito aquí se puede extender a muchos tipos diferentes de células que carecen de TM4SF1 para los estudios de la función nanopodia.

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Protocolo

1. Cultivo de células en el disco de vidrio recubierto de colágeno

1. Lugar discos de vidrio (12 mm de diámetro) en un frasco de vidrio (4 oz) y autoclave para esterilizar los discos.
2. Ponga etanol 25 ml de 70% en un tubo Falcon de 50 ml y colocarlo en una campana de cultivo celular. Esta solución puede ser reutilizado varias veces hasta que el nivel de la solución se reduce a 20 ml.
3. Coloque unas afiladas pinzas con un punto extra fino en el etanol al 70% durante 5 minutos antes de usarla para manejar el disco de vidrio.
4. Retire con cuidado la pinza del tubo y cerrar la tapa, a continuación, coloque suavemente la pinza de etanol tratada en la parte superior del tubo se seque al aire durante 2 min. No permita que la punta del fórceps tocar nada en la campana.
5. Utilice las pinzas estériles para agarrar uno de los discos de vidrio estéril del frasco de vidrio y lo coloca en un pozo de la placa de cultivo celular de 24 pocillos. Repita hasta que el número deseado de pozos se ha rellenado con los discos.
6. Ponga 500 l de solución de colágeno bovino (50 ng / ml) en cada pocillo que contiene un disco de vidrio y colocarlo en un 37 ° C, 5% de CO ₂ de células cultura incubadora durante al menos 30 min. No hay ningún daño en una incubación más largo.
7. Harvest HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana) o PC3 (células de tumor de próstata) que ya se cultivan en 150 mm placa de cultivo celular mediante tripsinización y bloquean la actividad de la tripsina utilizando su medio de cultivo completo. Recoger las células en un tubo Falcon de 15 ml.
8. Contar el número de células y asegúrese de que la viabilidad es superior al 90%.
9. Sedimentar las células por centrifugación a 200 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
10. Utilice el medio de cultivo para diluir las células a 10 ⁵ células / ml. Coloque las células en hielo.
11. Aspirar el colágeno en la campana de cultivo de células y colocar suavemente 500 l de suspensión celular a cada pocillo en el que los discos de vidrio se recubrieron previamente con colágeno. 5 x 10 ⁴ células / pocillo en la placa de 24 pocillos darán 60% confluency para HUVEC y 30% de confluencia para células PC3. Nota: añadir más suspensión de células de más alta densidad celular.
12. Cultura de las células en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora durante 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, o de 24 horas para realizar un seguimiento de las actividades nanopodia y pase celular. Normalmente, las células se adherirán a la disco de vidrio en los primeros 30 minutos, y luego comienzan a polarizarse y migrar en la primera hora, y llevar a cabo las interacciones intercelulares y la división celular en las horas siguientes.

2. La fijación de la célula

1. Cada pozo tendrá 500 l 4% PFA (paraformaldehído) para fijar las células. De cualquier fabricado comercialmente o recién hecho PFA al 4% puede ser utilizado. Calcular la cantidad de PFA necesario basado en el número de pozos preparados, y colocar PFA en un tubo Falcon de 15 ml. PRECAUCIÓN: paraformaldehído es un posible carcinógeno.
2. Coloque el tubo de halcón en un soporte de espuma de poliestireno que ya estaba en su lugar en un 37 ° C incubadora. Deje el tubo en la incubadora durante 30 min a la guerram hasta la PFA a 37 ° C.
3. Coloque una almohadilla térmica en la campana de cultivo y vuelva a encenderlo.
4. Saque la placa de cultivo celular de 24 pocillos y la PFA precalentado de la incubadora y colóquelo en la parte superior de la almohadilla.
5. Utilice una mano para aspirar el medio de un pozo, e inmediatamente después de usar la otra mano para deslizar suavemente 500 l PFA en el pozo a través del borde también. Para la aspiración más fácil, la inclinación de la placa de cultivo a aproximadamente 45 º, que se inclina contra el soporte de espuma de poliestireno de modo que es estable en ese ángulo. Esto facilitará la aspiración y la adición de solución de PFA al pozo sin molestar a las células en cultivo. Este es el paso más importante para preservar la estructura celular original de actividades celulares.
6. Repita el proceso hasta que todos los pozos con un disco de vidrio han recibido PFA. Nota: todos los pasos que hay que cambiar la solución pre-existente del pozo se aplicarán mismos procedimientos de aspiración.
7. Colocar la placa en 37 ° C durante 5 min.
8. Tome la placa posterior de la campana de cultivo y la inclinación en contra de espuma de poliestireno, como se describe en el paso 2.5. Utilice una mano para transferir suavemente la PFA desde el pozo en un tubo de recogida; utilizar la otra mano para colocar inmediatamente después de al menos 500 l temperatura de PBS habitación en el pozo. Después de todos los pozos se han lavado, volver y repetir el lavado PBS una vez más en todos los pozos. Vacíe la PFA recogido en un contenedor de residuos peligrosos.
9. Prepare el tampón de bloqueo ICC mediante la adición de 2% de suero bovino fetal al PBS. Azida de sodio 0,04% (diluir de 20% solución de reserva) se añade como conservante. ATENCIÓN: La azida de sodio es un compuesto tóxico. El tampón puede ser almacenado en 4 ° C durante un largo período de tiempo sin la contaminación bacteriana.
10. Con la placa de cultivo todavía inclinado en contra de un stand, una vez más, pasar por cada pozo de aspiración para eliminar PBS e inmediatamente después de añadir 500 l de tampón de bloqueo de la CPI. Las células están listas para la tinción de inmunofluorescencia. Si es necesario, lacélulas fijadas se pueden almacenar en un refrigerador a 4 º C durante una semana sin pérdida significativa de proteína TM4SF1.

3. TM4SF1 Inmunofluorescencia La tinción de Nanopodia

1. En cada pocillo, reemplace el amortiguador de bloqueo 500 l ICC con un nuevo tampón de bloqueo que contenía 0,01% de Triton X-100 y se deja reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. No utilice más alta que 0,03% de Triton X-100 ya que eliminará TM4SF1 de las membranas celulares. PBS lavó las células de la etapa 2.10 puede ser movido directamente al tampón de bloqueo que contenía Triton si la tinción está listo para ser empezar de inmediato.
2. Diluir el anticuerpo primario anti-TM4SF1 (o anti-CD9) a 0,5 g / ml en tampón de bloqueo CPI.
3. En cada pozo, eliminar el tampón Triton ICC/0.01% y reemplazarlo con 300 l de la solución anti-TM4SF1-anticuerpo. Incubar 2 horas a temperatura ambiente o dejar toda la noche a 4 ° C.
4. Lavar cada pocillo con no menos de 500 l de PBS. Repita 3 veces; cada vez que dan en least 5 min de tiempo de incubación.
5. Preparar una solución de anticuerpo y faloidina secundaria en CPI tampón de bloqueo, utilizando una dilución de 1000 veces de Alexa 488 anticuerpo secundario de burro anti-ratón marcado (/ ml de concentración final 2 g) y 1000 x dilución de faloidina (50 ng / ml de concentración final).
6. Retire PBS y añadir 300 l de la solución de anticuerpo secundario y phalloidin a cada pocillo y se incuba durante 2 horas o deja toda la noche a 4 ° C.
7. Repita los pasos de lavado PBS con al menos una incubación de 5 min por lavado. En el último lavado, deje cada pocillo en PBS durante 1 hora.
8. Caída de una sola gota (~ 10 l) de montaje anti-fade medios en un portaobjetos de vidrio.
9. Doble la punta de un 19 G 1 ½ en jeringa de aguja 90 ° presionando suavemente sobre una superficie dura. Utilice una mano para sostener la aguja doblada y suavemente levante un disco de vidrio del pozo, y con la otra mano para agarrar el disco con las pinzas cortantes.
10. Gire el disco y vidrio# 160; boca abajo dejando que el contacto con las células del medio de montaje en la placa de vidrio. Coloque con cuidado el disco de vidrio y deje que se seque durante la noche en un lugar oscuro a temperatura ambiente.
11. Proceder a la imagen de la inmunofluorescencia manchado nanopodia o almacenar las diapositivas de una caja de portaobjetos a -20 ° C. Las diapositivas permanecerán visibles durante unos meses en -20 ° C.

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Resultados

Para el Paso 1:

Si las células (como HUVEC y PC3 utilizado en este estudio) son capaces de crecer normalmente, las células se unen al disco revestido con colágeno dentro de 30 minutos después de que se siembran, se polarizan y se convierten en móvil poco después, y se extienden nanopodia por delante de su camino de movimiento. Figuras 1A y 1B, respectivamente, muestran un polarizada y la proliferación de HUVEC. Figura 2A muestra células...

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Discusión

Nanopodia son canales de la membrana celular delgadas que se adhieren firmemente a la matriz a través de TMED y pueden extenderse a más de 100 m de una célula móvil polarizada para detectar el medio ambiente y mediar en las interacciones intercelulares ^2,3. Nanopodia adherirse a la matriz tan firmemente que los residuos se quedan atrás ya que los celulares se aleja (Figuras 1 y 2). Así Nanopodia permite el estudio de cómo las células perciben su entorno y determinar l...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass disks	Fisher Scientific	12-545-82	12 mm diameter
Glass jar	Fisher Scientific	02-912-310	Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz
Glass slide	Fisher Scientific	12-544-1	Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides
50 ml Falcon tube	BD Falcon	352070	50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.
15 ml Falcon tube with Styrofoam rack	Corning	430790	Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes
Sharp forceps	Fisher Scientific	13-812-42	Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps
24-well Cell culture plate	BD Bioscience	353047	24-well Cell Culture Plate
150 mm Cell culture plate	BD Bioscience	353025	150 mm cell culture plate
19 G 1 ½ Syringe needle	BD Bioscience	309635	19 G 1 ½
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2701	Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Collagen solution	BD Bioscience	354249	Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0.25% Trypsin-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Solution, pH 7.4
PFA (paraformaldehyde)	Affymetrix	19943 1 LT	4% in PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Fetal Bovine Serum
EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.
Mouse anti-human TM4SF1 antibody	Millipore	MAB3127	Epitope is located in extracellular domain
Mouse anti-human CD9 antibody	BD Bioscience	555370	Epitope is located in extracellular domain
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
Phalloidin	Chemicon	90324	Rhodamine-conjugated Phalloidin
Anti-fade mounting media	Life Technologies	P-36931	ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI
70% Ethanol			17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water
10x PBS (make 200 ml)			20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water
20% Triton X-100 (make 20 ml)			4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water
4% NaN3 (make 25 ml)			1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water
50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)			Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS
ICC Blocking Buffer (50 ml)			49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3)
ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)			50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
Cell culture hood	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet
37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator
Heating pad	K&H Manufacturing	1020	K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com)
Centrifuge	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemocytometer