Captura Glicopéptido Proteómica Superficie Celular

Resumen

Proteínas de la superficie celular son biológicamente importantes y ampliamente glicosilada. Presentamos aquí un enfoque glucopéptidos captura para solubilizar, enriquecer y deglycosylate estas proteínas para análisis proteómicos fáciles LC-MS basados.

Resumen

Proteínas de superficie celular, incluyendo las proteínas de la matriz extracelular, participan en todos los principales procesos y funciones celulares, tales como el crecimiento, la diferenciación y la proliferación. Una caracterización completa de estas proteínas proporciona una rica información para el descubrimiento de biomarcadores, la identificación del tipo de célula, y la selección de medicamentos-objetivo, así como ayudar a avanzar en nuestra comprensión de la biología celular y fisiología. Proteínas de superficie, sin embargo, plantean desafíos analíticos significativos, debido a su inherente baja abundancia, alta hidrofobicidad, y las modificaciones posteriores a la traducción pesados. Tomando ventaja de la glicosilación prevalente en proteínas de la superficie, se introduce aquí un enfoque glicopéptido de captura de alto rendimiento que integra las ventajas de varios medios N-glycoproteomics existentes. Nuestro método puede enriquecer los glicopéptidos derivados de proteínas de la superficie y retire sus glicanos para proteómica fáciles utilizando LC-MS. La N-glicoproteoma resuelto comprende la información de la identidad y la cantidad de proteínas, así como sus sitios de glicosilación. Este método se ha aplicado a una serie de estudios en áreas que incluyen el cáncer, las células madre, y la toxicidad del fármaco. La limitación del método radica en la baja abundancia de proteínas de la membrana de superficie, de tal manera que se requiere una cantidad relativamente grande de muestras para este análisis en comparación con estudios centrados en las proteínas citosólicas.

Introducción

Proteínas de superficie celular interactúan con el medio ambiente extracelular y transmiten señales desde el exterior al interior de una célula. Por lo tanto, estas proteínas, incluyendo las proteínas de la matriz extracelular, desempeñan papeles críticos en todos los aspectos de la biología celular y la fisiología que van desde la proliferación, el crecimiento, la migración, la diferenciación al envejecimiento y así sucesivamente. Proteínas de superficie funcionan mediante la interacción con otras células, proteínas y moléculas pequeñas ^1-3. La caracterización molecular de las proteínas de la superficie celular es de gran interés no sólo para los biólogos sino también para las empresas farmacéuticas, ya que más del 60% de los medicamentos están dirigidos a las proteínas de la superficie celular ^4.

Espectrometría de masas tándem (MS), con su sensibilidad superior, exactitud, y el rendimiento para la identificación de proteínas y péptidos, ha sido una herramienta poderosa para los estudios proteómicos globales ^5,6. Sin embargo, las proteínas de superficie plantean importantes desafíos a la proteómica basadas en MS, comoexisten la mayoría de las proteínas de la superficie en cantidades bajas y con modificaciones pesados. Las regiones que abarcan la membrana de las proteínas de la superficie hacerlos hidrófobo; esto es especialmente el caso para las proteínas transmembrana multipaso. Es por lo tanto difícil de disolver proteínas de membrana en soluciones acuosas sin la ayuda de un detergente; sin embargo, el uso de detergentes generalmente suprime el rendimiento de HPLC y MS ^1,7,8 en la identificación de proteínas. Por lo tanto, las proteínas de membrana han sido mal caracterizada proteómica directas basadas LC-MS.

La glicosilación es una de las modificaciones post-traduccionales más importantes y abundantes que tienen lugar en las proteínas de la superficie celular ^9. La enorme complejidad y heterogeneidad de los glicanos obstaculizan MS señal de péptidos ^"10. Sin embargo, varios métodos proteómicos han utilizado esta modificación única para enriquecer las proteínas de superficie y para eliminar los restos de azúcar a partir de proteínas antes del análisis LC-MS. Estos métodos incluyen a base de la lectina de afinidad de captura ¹¹ y captura química a base de ácido bórico o basado-hidrazida ^12, así como las separaciones de cromatografía hidrófilos ^8,13. La eliminación de los glicanos transforma proteínas de la membrana a las proteínas regulares y simplifica drásticamente la caracterización MS. Debido a que la glicosilación tiene lugar también en las proteínas secretadas que tienen alta solubilidad en contraste con proteínas de la membrana, muchos métodos glycoproteomic están optimizados para proteínas solubles, y tienden a tener menor selectividad glicopéptido y la sensibilidad cuando se realiza el despliegue proteínas de membrana ^8,14. Otros métodos también existen para enriquecer, en particular, las proteínas de la superficie celular, tales como los que utilizan ultracentrifugación ¹⁵ y estrategias de etiquetado ^16. Una comparación detallada entre nuestro método y otros métodos existentes para la caracterización de proteínas de la membrana se llevó a cabo recientemente ^17, y los resultados indicaron que nuestro método puede llevar a cabo igualmente bien, si no semejor, que todos los métodos de proteómica membrana en comparación, pero con una mayor simplicidad.

Para ayudar a los investigadores utilizan este método, detallamos aquí un protocolo general. Este método integra varias ventajas de las estrategias de glycoproteomics existentes y se diseñó específicamente para glicoproteínas de membrana, sin embargo, el método funciona igual de bien para las proteínas secretadas. Las características de este método incluyen: 1) una completa solubilización de proteínas de membrana, 2) un enriquecimiento de glicopéptidos en lugar de glicoproteínas para eliminar el impedimento estérico potencial cuando se utiliza un sustrato sólido de captura, 3) el uso de la química hidrazida para formar enlaces covalentes entre glicopéptidos y el sustrato de captura, de tal manera que los glicopéptidos unidos pueden tolerar lavados rigurosos para alta glycoselectivity, y 4) la capacidad para llevar a cabo todo el procedimiento de captura en un tubo para reducir la pérdida de muestra y se acorta la duración del procedimiento. Después de la aplicación de este método para el estudio de una variabledad de muestras biológicas incluyendo las células y los tejidos, se observó una alta selectividad (> 90%) a las glicoproteínas ^8,17,18.

Protocolo

1. Cosecha Membranas

1. Añadir tampón hipotónico (Tris-HCl 10 mM, KCl 10, 1,5 mM de MgCl _2, pH 8,0) con un cóctel inhibidor de la proteasa en un sedimento de células (~ 10 ⁸ células) y se incuba durante 15-30 min en hielo. Lisar las células haciendo pasar la muestra a través de agujas de jeringa (5-10 pasadas) o la homogeneización de la muestra por un homogeneizador Dounce (15-30 golpes). Utilice un hemocitómetro y tinción con azul de tripano para comprobar la eficiencia de la lisis.
2. Obtener la fracción microsomal por una centrifugación diferencial del lisado a 3.000 gx 15 min y después a 100 000 gx 2 h. La primera centrifugación obtiene un gránulo que es la fracción nuclear, y la posterior centrifugación del sobrenadante genera un segundo gránulo, que es la fracción microsomal que contiene la membrana plasmática, así como orgánulos unidos a la membrana ^8. El sobrenadante final es la fracción citosólica. Guarde las fracciones microsomales de -80 ° C congelador durante más Analyses como se indica a continuación.

2. Disolver, Desnaturalizar, y digerir proteínas de membrana

1. Disolver la fracción microsomal en el tampón de desnaturalización (40 mM de Tris, EDTA 10 mM, TCEP 10, 0,5% Rapigest, pH 8) y a continuación se incuba la solución a 100 ° C durante 10 min.
2. Enfriar la solución se calentó a temperatura ambiente, añadir ultra-alta pureza en polvo urea en la solución a 8 M concentración final y se incuba la muestra a 37 ° C durante 30 min.
3. Añadir solución de yodoacetamida a la muestra a 15 mM de concentración final, y se incuba la solución en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente para alquilar los tioles libres en la muestra. Añadir solución de DTT a la muestra a una concentración final de 10 mM y se incuba la solución durante otros 10 minutos a temperatura ambiente para enfriar rápidamente la yodoacetamida excesiva.
4. Diluir 10 veces la solución obtenida con 40 mM de tampón Tris a pH 8, y, posteriormente, añadir tripsina a la muestra en una proporción 01:20 de trypsin de la proteína total. Mantener la reacción de digestión en un 37 ° C horno durante la noche para asegurar que se complete la reacción.
5. Terminar la digestión por la acidificación de la solución de la muestra a pH 1 con HCl, una condición que también rompe el detergente, es decir, Rapigest. Degradar el Rapigest a 37 ° C durante 1 hora, y retire la precipitación desarrollado por centrifugación.
6. Limpiar el sobrenadante que contiene péptidos de la muestra por un cartucho C-18 de extracción en fase sólida (SPE) y secar la muestra obtenida por SpeedVac.
7. Realizar un análisis de SDS-PAGE de muestras antes y después de la digestión con tripsina para confirmar la eficacia de la digestión.

3. Captura glucopéptidos

1. Disolver los péptidos limpiado en el tampón de acoplamiento (acetato de sodio 100 mM, pH 5,5). Añadir peryodato de sodio en la solución de péptido a una concentración final 10 mM durante 30 minutos en la oscuridad, a temperatura ambiente. Esto se oxida los grupos cis-diol en los glicanos a aldehídos, Que permiten que los glicanos para acoplar a la resina a través de la química hidrazida. Se detiene la peryodato excesiva por sulfito de sodio a una concentración final de 20 mM y pH 5 durante 10 min a temperatura ambiente.
2. Introducir resina hidrazida derivatizado en la solución de péptido en una proporción de 01:04 (resina de solución) a par de glicopéptidos a la resina. Se incuba la reacción a 37 ° C durante 1-2 días con rotación de extremo a extremo para el acoplamiento completo.
3. Retirar los péptidos no unidos por lavado de la resina dos veces con 1 ml de cada uno de los siguientes: agua DI, 1,5 M NaCl, metanol y 80% de acetonitrilo. Finalmente, lavar la resina con 3 x 1 ml de 100 mM NH ₄ HCO ₃ a pH 8 para intercambiar el tampón del sistema a 100 mM NH ₄ HCO _3.
   1. Recoger el sobrenadante y los lavados para el análisis de péptidos no unidos (opcional).
4. Soltar los N-glicopéptidos de la resina por PNGasa F en una incubación durante la noche a 37 ° C con unan de extremo a extremo de rotación. Recoge los péptidos liberados por centrifugación y un lavado con acetonitrilo al 80%. Se seca la solución obtenida en el SpeedVac para el análisis LC-MS.

4. Fraccionamiento adicional (opcional)

Para simplificar aún más la complejidad de la muestra, fraccionar los N-glicopéptidos obtenidos. Por ejemplo, volver a disolver los péptidos secos en 10 mM de formiato de amonio, pH 3 con 20% de acetonitrilo y el uso de intercambio catiónico fuerte (SCX) cromatografía para fraccionar los péptidos. Seque el eluyente obtenido, y luego analizar las fracciones de péptidos obtenidos por fase inversa LC-MS ^8,17,18.

5. Limpieza de los N-glicopéptidos Liberadas (Opcional)

Si se elevan las preocupaciones por la contaminación potencial de los péptidos, redisolver los péptidos secos en ácido fórmico al 0,1% y el uso de una columna de SPE MCX para limpiar aún más los péptidos antes de análisis por LC-MS de fase inversa.

Nota: Los parámetros de búsqueda de base de datos.

Durante la escisión selectiva de N-glicopéptidos de la resina, PNGasa F convierte la asparagina vinculado-N glicano a un ácido aspártico. Por lo tanto, hay un 0,9840 Da desplazamiento de masa de los liberados N-glicopéptidos. Para identificar con precisión estos péptidos, se necesita añadir a los parámetros de búsqueda, junto con modificaciones comunes tales como la carbamidometilación de la cisteína y la oxidación de la metionina de esta modificación.

Resultados

Un diagrama de flujo representativo del procedimiento experimental se resume en la figura 1. El etiquetado y otras etapas de fraccionamiento son opcionales y detalles se describen en una publicación reciente ^18. Otra opción es analizar los péptidos no modificados, que no reaccionan con la resina. Las ventajas de análisis de los péptidos no modificados incluyen el potencial de identificación de péptidos y proteínas no glicosiladas, tales como claudinas en uniones estrechas; Una ventaja...

Discusión

Aquí presentamos una estrategia glucopéptidos captura para perfilar las proteínas de la superficie celular. El método se puede aplicar para estudiar las proteínas secretadas, tales como los de la sangre, así como en otros fluidos corporales o en medios de cultivo celular.

El éxito del método se basa en la digestión completa de las muestras; por lo tanto, una caracterización de SDS-PAGE de la eficiencia de la digestión es necesario, especialmente para el análisis por primera vez d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Sodium periodate	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsin	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor coctail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sodium sulphite	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
α-1 trypsin	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumin	Sigma	A5503
Conalbumin	Sigma	C0755