Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

Resumen

La retina de roedores ha sido reconocida como una ventana de acceso al cerebro. En este documento técnico se proporciona un protocolo que emplea el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno para estudiar los mecanismos que conducen al fracaso de la regeneración vascular en el sistema nervioso central después de la lesión isquémica. El sistema descrito también se puede aprovechar para explorar estrategias para promover el nuevo crecimiento de vasos sanguíneos funcionales dentro de la retina y sistema nervioso central.

Resumen

La retina de roedor es tal vez el sistema de mamífero más accesible en el que para investigar la interacción neurovascular dentro del sistema nervioso central (SNC). Se está reconociendo cada vez más que algunas enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, la esclerosis múltiple y la esclerosis lateral amiotrófica elementos presentes de compromiso vascular. Además, las causas más importantes de ceguera en la población de edad pediátrica y de trabajo (retinopatía del prematuro y la retinopatía diabética, respectivamente) se caracterizan por una degeneración vascular y la insuficiencia de recrecimiento vascular fisiológico. El objetivo de este documento técnico es proporcionar un protocolo detallado para estudiar la regeneración vascular del SNC en la retina. El método puede ser empleado para dilucidar los mecanismos moleculares que conducen a la insuficiencia de crecimiento vascular después de la lesión isquémica. Además, las posibles modalidades terapéuticas para acelerar y restaurar plexos vasculares sanas se pueden explorar. Hallazgos obtaineD utilizando el enfoque descrito puede proporcionar vías terapéuticas para retinopatías isquémicas tales como el de la diabetes o la prematuridad y posiblemente beneficiar a otros trastornos vasculares del SNC.

Introducción

A lo largo del desarrollo del SNC, los nervios, las células inmunes y los vasos sanguíneos establecer redes notablemente acoplados a garantizar una adecuada perfusión tisular y permitir la transmisión de información sensorial ^1-5. El detalle de los resultados de los sistemas vasculares en la oxigenación tisular insuficiente y suministro metabólico comprometido y está cada vez más reconocido como un importante contribuyente a la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas ^6. Deserción vascular y el deterioro de la unidad neurovascular dentro del cerebro, por ejemplo, se asocia con demencia vascular, lesiones vasculares de la materia blanca del cerebro ⁷ y la enfermedad de Alzheimer con estenosis de las arteriolas y los vasos pequeños ^8. Además, se cree alteración de la función barrera vascular para contribuir esclerosis múltiple ⁹ y la esclerosis lateral amiotrófica ^10.

De importancia directa para el modelo de la retina se describe en este protocolo, el cegamientoenfermedades tales como la retinopatía diabética ¹¹ y la retinopatía de la prematuridad ^{12, 13} se caracterizan por una fase de degeneración vascular temprano. El estrés isquémico posterior sobre la retina neurovascular desencadena una segunda fase de la neovascularización excesiva y patológica que probablemente se origina como una respuesta compensatoria a oxígeno restablecerá y suministro de energía ^14-16. Una estrategia atractiva para superar el estrés isquémico que es central a la progresión de la enfermedad es restaurar redes vasculares funcionales específicamente en las zonas isquémicas de la neuro-retina (Figuras 2 y 3). Provocar una respuesta angiogénica controlada puede venir a través como contra-intuitivo para una condición en la que los tratamientos anti-angiogénicos tales como anti-VEGF son considerados como tratamientos adaptados. Sin embargo, la evidencia de la validez de este enfoque es el montaje. Por ejemplo, la mejora de recrecimiento vascular "fisiológica-like" en ischemretinopatías ic se ha demostrado elegantemente a través de la introducción de las células precursoras endoteliales ^17, la inhibición de VEGF de células de Müller-expresado regulación a la baja inducida de otros factores angiogénicos, ¹⁸ de inyección de progenitores mieloides ^19, la inhibición de NADPH oxidasa inducida por la apoptosis ^20, el aumento de la dieta ω-3 grasos poliinsaturados la ingesta de ácido ^21, el tratamiento con un fragmento carboxilo-terminal de triptófano ARNt sintetasa ^22, y la administración directa de VEGF o FGF-2 para la protección de las células gliales ^23. Por otra parte, hemos demostrado que la modulación de las señales de orientación neuronales clásicas tales como Semaphorins o netrinas en retinopatías isquémicas acelera la regeneración vascular de los vasos sanos dentro de la retina y, en consecuencia reduce la angiogénesis patológica ^{24, 25.} De relevancia clínica directa, varios de los estudios en animales antes mencionados proporcionan evidencia de que la promoción de re vasculargeneración durante la fase isquémica temprana de retinopatías puede reducir significativamente la neovascularización que ponen en peligro la vista previa de la retina ^{19, 23, 24, 26,} probablemente a través de la reducción de la carga isquémica.

La elaboración de estrategias terapéuticas que estimulan la regeneración de los vasos funcionales sigue siendo un reto importante para los biólogos vasculares. Aquí se describe un sistema experimental que emplea el modelo de ratón de la retinopatía inducida por oxígeno (OIR) para explorar estrategias para modular el recrecimiento vascular en la retina. Desarrollado por Smith et al. En 1994 ^27, este modelo sirve como sustituto de las retinopatías proliferativas humanas y consiste en la exposición de las crías P7 ratón al 75% de O ₂ hasta el P12 y, posteriormente, la reintroducción de las crías al ambiente de la sala _O2-tensión (Figura 1). Este paradigma imita débilmente un escenario en el que se ventila un bebé prematurocon O _2. La exposición de las crías de ratón a hiperoxia provoca degeneración de los capilares de la retina y de la microvasculatura, y produce una superficie reproducible de vaso-obliteración (VO) suele evaluarse a la salida de O ₂ en P12, aunque el área de VO máxima se alcanza a las 48 horas (P9) después exposición a O ₂ ^28. En el ratón, las zonas avasculares VO regeneran espontáneamente en el transcurso de la semana siguiente a la reintroducción de aire de la habitación y finalmente zonas VO están completamente re-vascularizados (Figura 2). La reintroducción de aire de la sala de ratones sometidos a OIR también provoca la neovascularización de la retina antes de la (NV) (máximo a P17) que se evalúa típicamente para determinar la eficacia de los paradigmas de tratamiento anti-angiogénicos. En su forma más pura, el modelo OIR proporciona una herramienta altamente reproducible y cuantificable para evaluar la degeneración vascular inducida por el oxígeno y determinar el grado de destrucción neovascularización pre-retinal ^29-31.

Varios paradigmas de tratamiento exploratorio que modulan la regeneración vascular del SNC puede ser investigada mediante el modelo de OIR, incluyendo el uso de los compuestos farmacológicos, la terapia génica, la supresión de genes y más. La propensión de un enfoque dado para influir en el nuevo crecimiento vascular se evaluó paso a paso en la ventana entre P12 (VO máxima después de la salida de la hiperoxia) y P17 (NV máxima). Evaluación de los resultados del tratamiento en NV patológica se puede determinar rápidamente y fácilmente en paralelo y ha sido descrita a fondo por Stahl y colegas ^{30, 31.} Aquí le ofrecemos una forma sencilla y paso a paso para investigar la modulación de revascularización fisiológica dentro de la retina neural por compuestos farmacológicos, terapéuticos potenciales, vectores virales o para estudiar la influencia de los genes candidatos en los ratones manipulados genéticamente.

Protocolo

Declaración de Ética: Todos los experimentos con animales se adhiere a los lineamientos de cuidado animal establecidas por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Visión Investigación y el Consejo Canadiense de los Animales.

1. Oxígeno inducido Retinopatía (OIR)

1. Fecha de apunte de nacimiento de crías de ratón como P0.
2. Registre todos los pesos de los animales a la entrada en O ₂ para asegurar una variedad de peso adecuado. Nota: Para C57BL / 6 ratones a P17, peso corporal debe oscilar entre 5 y 7,5 g para NV máxima ^32. Con el fin de mantener la coherencia del medio ambiente, se recomienda utilizar como compañeros de camada de control (para los ratones modificados genéticamente, así como los ratones que recibieron tratamientos experimentales). Al evaluar los efectos de un vector viral, se debe considerar el tropismo del virus y dar tiempo suficiente para la plena expresión de transgenes viralmente entregados. Viral rápidamente expresandovectores tales como los lentivirus 3 ^ª generación ^{24, 25,} se recomiendan ^33.
3. Cachorros Place ratón en P7 (C57BL / 6 o deseado cepa) y una CD1 fomentar madre en una cámara de oxígeno fijado en el 75% de O ₂ durante 5 días ^27. La humedad del ambiente y la temperatura se mantienen constantes a lo largo de O ₂ de la exposición. Nota: Las instalaciones de investigación equipados con una fuente central de O ₂ son ideales y limitan la sustitución engorroso de O ₂ tanques vacíos. Si se trabaja con ratones manipulados genéticamente, es importante asegurarse de que los ratones control y experimental se adquieren del mismo proveedor para limitar las derivas genéticas dentro de las mismas cepas ^{30, 29.}
4. En P12, eliminar a los ratones de la cámara de oxígeno y devolver los animales al ambiente de O _2.

2. Inyección intravítrea de Entrega de los compuestos de la retina interna (Whes evaluar los efectos de un compuesto farmacológico o Proteína Recombinante)

1. En P14, anestesiar a los ratones con 2% de isoflurano en oxígeno 2 L / min (o comité de protección de los animales aprobado anestésico de elección). Con el fin de verificar la eficacia de la anestesia, secuencialmente pellizcar la cola, pata trasera y el oído con pinzas.
2. Coloca el ratón sobre su vientre.
3. Usando una jeringa estéril de 10 l equipado con una aguja de vidrio tirado biselado, realizar una inyección de un volumen máximo de 1 l de solución que contiene el compuesto que está siendo investigado o vehículo (solución salina fisiológica) en el limbo posterior del ojo, con un 45 ° ángulo de evitar la lente. Nota: El-aguja de vidrio arrastrado está unido a la jeringa utilizando una gota de resina epoxi.
4. Aplique una gota de ungüento oftálmico lubricante (idealmente con antibióticos) con un hisopo para el ojo del ratón.
5. Devuelva el ratón de nuevo a la jaula con el fomento de la madre. Los ratones son entonces monitoreados cuidadosamente hasta que recubierto y totalmente ambulatoria.

3. Evaluación de la perfusión de buques y la función de barrera (Integridad) mediante angiografía con fluoresceína

1. Anestesie ratones con 2% de isoflurano en oxígeno 2 L / min (o comité de protección de los animales aprobado anestésico de elección). Con el fin de verificar la eficacia de la anestesia, secuencialmente pellizcar la cola, pata trasera y el oído con pinzas. Nota: Esto se realiza típicamente a P17 cuando se evalúa la regeneración. También llevar-a cabo el análisis en P19 y P21 para determinar si la integridad vascular se conserva en el tiempo.
2. Una vez anestesiado, se pesa el ratón.
3. Haga una incisión en la línea media del abdomen con unas tijeras de disección. Nota: Los instrumentos de disección se deben revisar y afilados con regularidad.
4. Cortar las costillas lateralmente y elevar la caja torácica con la ayuda de fórceps. Nota: Es necesario cortar como lateralmente como sea posible para evitar daños en el corazón.
5. Después de retirar periptejido heral desde el corazón, pinza la aorta descendente con unas pinzas hemostáticas.
6. Inyecte lentamente con fluoresceína dextrano al ventrículo izquierdo con una aguja 25. Nota: Si la función de barrera vascular se investiga, se emplea 70 kDa fluoresceína-dextrano, ya que se saldrá de los vasos cuando se ve comprometida la integridad del vaso. Si el investigador quiere lanzar vasos sanguíneos, se utiliza 2 MDa fluoresceína-dextrano. Los pasos críticos: 1) Para asegurar un reparto homogéneo, centrifugar fluoresceína dextrano e inyectar el sobrenadante, 2) Con el fin de prevenir la constricción de vasos, inyectar solución de fluoresceína dextrano calentado, 3) su tiempo de circulación no debe exceso de 4 min.
7. Decapitar a los ratones 2 min después de la inyección con unas tijeras de funcionamiento.

4. Enucleación y fijación de los ojos

Nota: Al evaluar las posibilidades de regeneración vascular, primero recoger retinas en P12 y P14 y, además, al P17. Aumentar el número de punto en el tiempo de muestreos para una determinación más precisa de las tasas de revascularización ^24.

1. Incline la cabeza del ratón y colocarlo en su lado.
2. Quite la piel y los párpados cubren los ojos con unas tijeras de disección.
3. Coloque fórceps curvados debajo del ojo y suavemente tire hacia arriba hasta que el nervio óptico se corta.
4. Gire la cabeza del ratón hacia el otro lado y realizar los mismos pasos (pasos 4.2 y 4.3).
5. Para asegurar una mejor penetración de fijador, perforar un agujero en la cámara anterior del ojo utilizando aguja de 30 g.
6. Transferencia de ojos a un tubo que contiene 4% de paraformaldehído (PFA) y fijar durante 1 hora a temperatura ambiente.
7. Eliminar PFA y lavar los ojos 4 veces con una solución de PBS enfriado en hielo.

5. Disección de retina

1. Coloque los ojos de ratón en una placa de Petri que contiene PBS frío y realizar la disección de las retinas bajo un microscopio estereoscópico.
2. Quite la grasa / tejido adicional que rodea el ojo con ciencia microdisecciónssors.
3. Cortar la córnea con tijeras micro-disección.
4. El uso de dos pares de pinzas, minuciosamente la cáscara de la esclerótica de distancia desde la periferia hacia el nervio óptico y desechar.
5. Apriete la lente (bola blanquecina debajo de la córnea) con unas pinzas y extraerlo de la caja del visor. Use un par de pinzas como soporte, y la otra para agarrar y levantar con cuidado y retire el objetivo.
6. Separar los vasos hialoideos desde el lado interior de la retina utilizando cepillos pequeños (tamaño 0) y fórceps.
7. Retire los bloques de vasos hyaloid conectados al disco óptico utilizando fórceps.
8. Transferencia diseccionó la retina a 2 ml de tubos de microcentrífuga que contiene PBS y lugar en hielo antes de comenzar el procedimiento de tinción.

6. Retiniana vascular tinción

1. Incubar las retinas disecadas durante la noche con agitación suave a 4 ° C en una solución de fluorescencia B4-isolectina acoplado (rodamina-lectina u otra) en PBS que contenía 1 mM de _CaCl2 (se recomienda una dilución de una solución B4 2 mg / ml isolectina 1:100). Durante todo el procedimiento de tinción, cubrir los tubos con papel de aluminio o una lámina opaca para protegerlo de la luz.
2. Al día siguiente, eliminar la solución de tinción y lavar las retinas 3x en PBS durante 10 min a temperatura ambiente.

7. Preparación de la retina Flatmounts

1. Traslado retinas, del lado de los fotorreceptores hacia abajo, en un portaobjetos de microscopio y hacer cuatro profundas incisiones radiales equidistantes utilizando un bisturí quirúrgico para dividir la retina en cuatro cuadrantes de igual tamaño. Durante las incisiones, prepararse la retina con un cepillo de modo que no se mueve.
2. El uso de dos cepillos empapados en PBS, aplane cuidadosamente la cuadrantes fotorreceptor boca abajo y sumergir la retina en medio de montaje para evitar la foto-blanqueo. A continuación, coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre la superficie de la retina montado sin la aplicación de presión y asegurarse de que las burbujas de aire no se acumulan debajo de la hoja de la cubierta.

8. Imaging y Cuantificación de Vasoobliteration (VO) y neovascularización (NV), como se ha descrito previamente ³¹

1. Tomar imágenes de retinas-todo ello montado con un microscopio de epi-fluorescencia con un aumento de 10X.
2. Abre la imagen en la retina en software de edición fotográfica, hilvanar y medir el área total de la retina, y la zona avascular. Área puede expresarse en píxeles.
3. Determinar la extensión del VO dividiendo el número de píxeles en la zona avascular por el número de píxeles en el área total de la retina.
4. Determinar la extensión de NV dividiendo el número de píxeles de NV por el número de píxeles en el área total de la retina tal como se describe ^31.

Resultados

El modelo OIR es ampliamente utilizado para estudiar la degeneración vascular inducida por el oxígeno y la neovascularización patológica inducida por isquemia en la retina y ha sido instrumental en el desarrollo de tratamientos anti-angiogénicos que trabajan actualmente para las enfermedades oculares ^{27, 29, 30.} Los resultados obtenidos con este modelo pueden ser libremente extrapolar a retinopatías isquémicas tales como la retinopatía diabética proliferativa y retinopatía del prematuro ^30.

Discusión

¿Cuál es la forma más eficaz para estimular el crecimiento de nuevos vasos sanos en el tejido nervioso isquémico? ¿Es terapéuticamente válida para interferir con y acelerar origen natural recrecimiento vascular? En patologías neuro-isquémica como retinopatías isquémicas o derrame cerebral, degeneración vascular se asocia con una reducción de la función neuronal ^35-38. Por lo tanto para hacer frente a la lesión inicial, el restablecimiento de la microcirculación regional durante la fase inmedia...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers	Vendor of choice
Operating Scissors straight	World Precision Instruments	14192
Dissecting Scissors straight	World Precision Instruments	14393
Vannas Eye Scissors	Harvard Apparatus	72-8483
Iris Forceps, curved, serrated	World Precision Instruments	15915
Brushes 362R size 0	Dynasty
Dumont Forceps #3; straight	World Precision Instruments	500338
Surgical Blade, size 10	Bard-Parker	371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Laboratories, Inc	RL-1102
Microscope slides	VWR	16004-368
Fluoromount G	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope	Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope	Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000	Sigma-Aldrich	46945