Inducida por láser Breakdown Spectroscopy: un nuevo enfoque para el mapeo y cuantificación de nanopartículas en tejidos de órganos

Resumen

Desglose espectroscopia inducida por láser se realiza en órgano fino y tejido del tumor con éxito detectado elementos naturales y gadolinio inyectado artificialmente (Gd), emitidas a partir de nanopartículas a base de D-os. Imágenes de los elementos químicos alcanzaron una resolución de 100 micras y la sensibilidad cuantitativa sub-mM. La compatibilidad de la instalación con el microscopio óptico estándar enfatiza su potencial para proporcionar múltiples imágenes de un mismo tejido biológico.

Resumen

Espectroscopía de emisión de plasma inducida por láser se aplicó a análisis elemental de las muestras biológicas. Espectroscopía de descomposición inducida por láser (LIBS) realizado en secciones finas de tejidos de roedores: riñones y el tumor, permite la detección de elementos inorgánicos tales como (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, y Fe, presente de forma natural en el cuerpo y (ii) Si y Di-s, detectados después de la inyección de nanopartículas a base de gadolinio. Los animales fueron sacrificados 1 a 24 horas después de la inyección intravenosa de partículas. Una exploración bidimensional de la muestra, lleva a cabo utilizando una micrométrico-etapa 3D motorizado, permite el haz de láser infrarrojo explorar la superficie con una resolución lateral de menos de 100 μ m. Imágenes químico cuantitativo de elemento de Di-s en el interior del órgano se obtuvieron con sensibilidad sub-mM. LIBS ofrece un método simple y robusto para estudiar la distribución de materiales inorgánicos sin ningún labeli específicang. Por otra parte, la compatibilidad de la instalación con el microscopio óptico estándar enfatiza su potencial para proporcionar múltiples imágenes del mismo tejido biológico con diferentes tipos de respuesta: elemental, moleculares o celulares.

Introducción

El amplio desarrollo de las nanopartículas para aplicaciones biológicas instó a la mejora paralela de técnicas analíticas para su cuantificación y de formación de imágenes en muestras biológicas. Por lo general, la detección y el mapeo de las nanopartículas en los órganos son hechas por fluorescencia o microscopía confocal. Desafortunadamente estos métodos requieren el etiquetado de las nanopartículas por un colorante de infrarrojo cercano que puede modificar la biodistribución de las nanopartículas, especialmente para nanopartículas muy pequeñas debido a sus propiedades hidrófobas. La detección de nanopartículas marcadas, y en especial las nanopartículas muy pequeñas (de tamaño <10 nm), por lo tanto podría interferir con su biodistribución en toda la escala del cuerpo, sino también en los tejidos y de células niveles. El desarrollo de nuevos dispositivos capaces de detectar las nanopartículas sin ningún etiquetado ofrece nuevas posibilidades para el estudio de su comportamiento y la cinética. Por otra parte, el papel de los elementos traza tales como hierro y cobre en el cerebro enfermedades Und enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer ^1, de Menkes ^2,3, o Wilson ⁴ sugieren el interés para estudiar y localizar estos elementos en los tejidos.

Diversas técnicas se han utilizado para proporcionar el mapeo elemental o microanálisis de diferentes materiales. En su artículo de revisión publicado en 2006, R. lobinski et al. Proporcionan una visión general de las técnicas estándar disponibles para microanálisis elemental en el entorno biológico, uno de los entornos más difíciles para las ciencias analíticas ^5. La microsonda de electrones, que se compone de energía dispersiva de microanálisis de rayos X en un microscopio electrónico de transmisión, se puede aplicar a numerosos estudios si la concentración elemento es suficiente (> 100-1.000 mg / g). Para llegar a los límites de detección más bajos, se han utilizado las siguientes técnicas:

• microsonda haz de iones usando partículas inducida por rayos X de emisión μ-PIXE (1-10 mg / g) ⁶
• synchrotron microanálisis radiación μ-SXRF (0,1-1 mg / g) ⁷
• espectrometría de masas de iones secundarios SIMS (0,1 mg / g) ⁸
• la ablación con láser acoplado inductivamente espectrometría de masas LA-ICP-MS (hasta 0,01 mg / g) ^9,10

Las técnicas mencionadas anteriormente-proporcionan una resolución micrométrica como se muestra en la Tabla 1 extraído de lobinski et al.

Reconstrucción 3D de las investigaciones en 2D de serie también se podría proponer para la reconstrucción de los tejidos más profundos ^11. Sin embargo, todos los dispositivos y sistemas requieren tanto de los profesionales cualificados, moderados a equipos muy caros y los experimentos de larga duración (por lo general más de 4 h para una 100 m x 100 m para μ-SXRF y 10 mm x 10 mm de LA-ICP-MS ) ^12. En conjunto, estos requisitos hacen microanálisis elemental muy restrictivo e incompatible con los sistemas de imagen óptica convencionales,microscopía de fluorescencia o microscopía no lineal. Otro punto que se puede mencionar es que la capacidad de medición cuantitativa es aún bastante limitado y depende de la disponibilidad de las normas de laboratorio con ajuste matricial. La mayor generalización del uso de microanálisis elemental en procesos de la industria, la geología, la biología y otras áreas de aplicaciones generará avances conceptuales y tecnológicos significativos.

El propósito de la presente manuscrito es proponer soluciones para el mapeo elemental cuantitativo (o microanálisis elemental) en los tejidos biológicos con una instrumentación mesa totalmente compatible con la microscopía óptica convencional. Nuestro enfoque se basa en la espectroscopía de descomposición inducida por láser (tecnología LIBS). En LIBS, un pulso de láser se enfoca en la muestra de interés para crear la descomposición y la chispa del material. La radiación emitida atómica en el plasma se analizó posteriormente por un espectrómetro y la elementalconcentraciones mentales se pueden recuperar con las medidas de calibración realizados previamente ^13,14. Las ventajas de LIBS incluyen sensibilidad (g / g para casi todos los elementos), la compacidad, la preparación de la muestra muy básico, ausencia de contacto con la muestra, respuesta instantánea y precisamente localizada (micro) análisis de superficie. Sin embargo, la aplicación de imagen química del tejido sigue siendo un reto ya que la ablación con láser de tejido debe ser controlado finamente para realizar mapas con alta resolución espacial, junto con la sensibilidad en el rango g / g ^15,16.

Con esa solución, no se necesita la adición de trazadores o agentes de etiquetado, que permite la detección de elementos inorgánicos directamente en su entorno nativo en los tejidos biológicos. El instrumento LIBS desarrollado en nuestro laboratorio ofrece una resolución de corriente inferior a 100 micras con una sensibilidad estimada para Di-s por debajo de 35 g / g, equivalente a 0,1 mM de ^16, lo que permitela asignación de muestras grandes (> 1 cm ²⁾ dentro de 30 min. Además, el software hecho en casa facilita la adquisición y explotación de los datos. Este instrumento se utiliza para detectar, cartografiar y cuantificar la distribución tisular de gadolinio nanopartículas (Gd) basados ​​en ^{17 a 18} en los riñones y muestras de tumores de animales pequeños, de 1 a 24 horas después de la inyección intravenosa de las partículas (tamaño <5 nm) . Elementos inorgánicos, que son intrínsecamente contenidas en un tejido biológico, tales como Fe, Ca, Na, y P, también se han detectado y fotografiado.

Protocolo

1. Preparación de la muestra biológica

Todos los experimentos descritos en este estudio fueron aprobados por el Comité del CECCAPP (Lyon, Francia) (autorización # LYONSUD_2012_004) Cuidado de Animales y el empleo, y los experimentos se llevaron a cabo bajo la supervisión de las personas autorizadas (L. Sancey, DDPP autorización # 38 05 32).

1. Añadir 1 ml de H ₂ O a 100 mol de nanopartículas a base de gadolinio (Gd), esperar 15 minutos y añadir 20 l de HEPES 50 mM, NaCl 1,325 M, _CaCl2 20 mM a 100 l de H ₂ O y 80 l de la solución primaria de nanopartículas a base de Di-s para obtener una solución de 200 l de 40 mM listas para inyectar (Ciudad: Villeurbanne, en el laboratorio).
2. Se inyecta la solución de nanopartículas a base de Di-s 200 l por vía intravenosa en los roedores portadores de tumores anestesiados (Ciudad: Lyon Sud (Oullins), a 15 km de laboratorio).
3. 1-24 horas después de la inyección, sacrificar a los ratones unad Vuelva a colocar las muestras biológicas en isopentano enfriado con nitrógeno líquido. Almacene las muestras a - 80 ° C (Ciudad: Lyon Sud (Oullins), a 15 km desde el laboratorio).
4. Cortar la muestra (Ciudad: generalmente Grenoble, a 100 km desde el laboratorio, voy a tratar de tener un acceso en Lyon Sud) en 100 diapositivas micras de espesor y poner las diapositivas biológicas en platos de plástico específicos (plato de Petri). Almacenar a -80 ° C.
   Nota: Los platos de plástico son básicamente una muestra de polímero de alta pureza. Se utilizan para evitar la interferencia con los elementos contenidos en el tejido.

2. Preparación de muestras para la calibración

1. Preparar viales con dosis crecientes de nanopartículas a base de Gd en agua (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 500 mM, 1 mM y 5 mM).
2. Ponga un l-gota de cada solución de separación constante de 3 mm en la placa de Petri 5.
3. En seco a temperatura ambiente durante 20 min.

3. Experimento LIBS

1. La inicialización del programa de instalación LIBS
   1. Configuración de láser. Después de conectar los instrumentos, espere 10-20 minutos para la estabilización de la energía del pulso láser y el enfriamiento de la cámara ICCD hasta -20 ° C. Ajuste la energía de pulso con el atenuador.
      Nota: Los parámetros del láser óptimas para tejidos de mapeo son 5 ns de duración de impulsos, 1064 nm de longitud de onda y la energía de pulso de aproximadamente 4 mJ. El láser utiliza un típico Nd: YAG láser de nanosegundos.
   2. LIBS Configuración. Establecer la posición de enfoque del láser (con respecto a la superficie de la muestra) para obtener el diámetro del cráter más pequeño (alrededor de 50 micras o menos).
      Nota: Esto corresponde a una focalización pulso de láser 100 micras por debajo de la superficie de la muestra.
   3. Configuración del espectrómetro. Utilice el espectrómetro de Czerny-Turner combinado con un 1200 líneas / mm rejilla y una cámara de alta resolución ICCD temporal. Controlar todos estos dispositivos por ordenador. Establezca el valor de hendidura de entrada a 40 micras. Ajuste el rango espectral reGårding el elemento a analizar. Utilice el rango espectral que cubre 325-355 nm para detectar Di-s con alta sensibilidad, así como de Na, Cu y Ca. Establezca los parámetros ICCD con un retraso de 300 nanosegundos, una puerta de 2 microsegundos, y una ganancia de 200.
2. Medición Mapping
   1. Coloque la muestra biológica en el soporte de la muestra LIBS motorizados.
   2. Ajuste la altura de la muestra de acuerdo con la posición de enfoque del láser.
   3. Tome una fotografía de alta resolución de la rebanada de la muestra.
   4. Ajuste el módulo de mapeo del software de adquisición de LIBS para realizar un mapa con los típicos 100 x 100 puntos de medición separados por una resolución de alrededor de 100 micras.
   5. Inicie la adquisición. Desde este punto de automatizar todo; la secuencia, así como la grabación del espectro en movimiento y el ahorro. Se requieren 40 minutos para una cartografía de los 10.000 puntos (equivalente a 1 cm ² para una resolución de 100 m). Reagrupar todos los espectros registrados en un mismo archivo.
   6. Cuando finished, tomar una segunda fotografía de la rebanada de la muestra
3. Medición Calibración

Con los mismos parámetros experimentales, medir las muestras de calibración (para los detalles de preparación, ver sección 2). Realizar un mapa o ficha 25 espectros (obtenido a partir de los sitios de medición en la parte central de la gota) en cada una de las gotas de calibración.

4 Análisis de espectro LIBS:. Construcción de Imágenes Químicas

1. Grabar todos los espectros LIBS del mapeo del tejido y cargarlos en el análisis de software LIBS. Reste la línea de base para cada espectro y construir las imágenes químicas con escala de intensidad relativa usando un color falso.
   Nota: Un algoritmo recupera intensidad de las líneas específicas, tales como Gd, Cu, Na, o Ca.
2. Realice la misma operación en el espectro medido de la muestra calibrada para permitir el cálculo de las curvas de calibración (relación entre la intensidad y la concentración) y construir aqmapa cuantitativas a o imagen de Di-s (u otro elemento de interés).
3. Aplicar los tratamientos adecuados para las imágenes químicos, tales como la interpolación o suavizado. Guarde los mapas de intensidad o concentración en formato de imagen (mapa de bits).

Resultados

Como se muestra en la Figura 1, el haz de un láser de Nd: YAG en la longitud de onda fundamental de 1064 nm se centra verticalmente hacia abajo sobre la lámina de tejido por una lente de cuarzo de 50 mm de distancia focal. La energía de pulso fue de 4 mJ y la tasa de repetición de 10 Hz. Con el fin de evitar la generación de plasma en el aire, el haz de láser se enfoca alrededor de 100 micras bajo la superficie de la muestra. No plasma de aire se observó en esta condición. Durante los experiment...

Discusión

Aplicado a la muestra biológica, esta técnica permite que la imagen química, es decir, el mapeo y cuantificación, de Di-s y Si a partir de nanopartículas basadas-Di-s inyectados en diferentes órganos. A partir de los ajustes principales críticos, el control de las propiedades de láser (longitud de onda, la energía de pulso, de enfoque, y de estabilidad) es crítico para una ablación del tejido preciso y fino (es decir, una resolución de mapeo), así como para la sensibilidad. Trabajar en la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser nanosecond Nd:YAG	Quantel	Brillant	5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm
Spectrometer	Andor Technology	Shamrock 303	with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating
Detector ICCD	Andor Technology	Istar	2 nsec temporal resolution
LIBS Unit	ILM		Homemade Instrumentation
Gd-based nanoparticles	Nano-H		particles
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	for particle's dilution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21108	for particle's dilution
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	for particle's dilution
Mice	Charles River	depending of animal breeding
Isoflurane	Coveto / Virbac		for anaesthesia - Isofluranum
Isopentane	Sigma-Aldrich	59060	to froze the sample  slowly
Liquid nitrogen	Air Liquide		to cool down the isopentane
Cryostat	Leica	CM-3050S	to slide the samples
Petri dishes	Dutscher	353004	to stick the sample