Etiquetado de la célula y de inyección en Desarrollo de embriones de ratón Corazones

Resumen

Se describe una serie de métodos para inyectar colorantes, vectores de ADN, virus, y células con el fin de supervisar tanto el destino celular y el fenotipo de las células endógenas y injertados derivados de células embrionarias o pluripotentes dentro de embriones de ratón en el día embrionario (E) 9,5 y etapas posteriores de desarrollo.

Resumen

Probando el destino de la célula de vástago derivados embrionarios o pluripotentes en protocolos in vitro ha conducido a resultados controvertidos que no reflejan necesariamente su potencial in vivo. Preferiblemente, estas células deben ser colocados en un entorno embrionario adecuado con el fin de adquirir su fenotipo definido. Por otra parte, el linaje celular rastreo estudios en el ratón después de etiquetar las células con colorantes o vectores retrovirales se ha mantenido mayormente limitada a los embriones de ratón en fase inicial con los órganos todavía poco desarrollados. Para superar estas limitaciones, hemos diseñado protocolos de microinyección estándar y de ultrasonido mediada para inyectar diversos agentes en regiones específicas del corazón en embriones de ratón en E9.5 y etapas posteriores del desarrollo. Explante embrionarias o embriones se cultivan o hacia la izquierda para seguir desarrollando en el útero. Estos agentes incluyen los tintes fluorescentes, virus, shRNAs, o las células madre derivadas de células progenitoras. Nuestros enfoques permiten la preservación de la funciones del órgano mientras se monitorea la migración y el destino de las células marcadas y / o inyectados. Estas tecnologías pueden extenderse a otros órganos y va a ser muy útil para hacer frente a cuestiones biológicas fundamentales en la biología del desarrollo.

Introducción

Hace más de una década, las células madre embrionarias humanas (HuESCs) se han derivado de blastocistos humanos ^1. Desde entonces, estas células han sido objeto de un importante campo de investigación que se ocupa de las cuestiones no cubiertas en la biología del desarrollo humano. HuESCs han proporcionado, además, las esperanzas en la medicina regenerativa. En los últimos años, las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs humanos) se han generado a partir de células somáticas específicas del paciente, proporcionando modelos de enfermedad genética ^2. Muchos en los protocolos in vitro para la diferenciación de células madre embrionarias pluripotentes inducidas o hacia diferentes linajes de células, incluyendo los linajes del corazón ^3, han sido reportados. Las células diferenciadas son a menudo fenotipados por análisis de ARN y la expresión de proteínas, inmunotinción, y / o en las pruebas funcionales in vitro. Sin embargo, los derivados de células madre pluripotentes tienen que ser colocados en un entorno embrionario adecuado con el fin de probar si adquieren plenamente la CELl destino de su contraparte embrionario y si recapitulan la función genuina en vivo en respuesta a las señales regionales. Mientras que la ingeniería de tejidos es prometedor, aún no ofrece todas las señales conocidas y desconocidas de la adecuada in vivo el tejido embrionario en desarrollo ^4,5.

Etiquetado celular con tintes o vectores retrovirales en los embriones, incluyendo embriones de ratón, han traído información importante sobre el origen embrionario de los linajes de células durante el desarrollo cardíaco ^6. Por ejemplo, la inyección de colorante en el espacio pericárdico de embriones de ratón ex vivo, seguido por cultivo in vitro de corazones aislados, se utilizó para marcar las células epicárdicas y sus descendientes ^7. Sin embargo, el tinte y el etiquetado de células retroviral se han aplicado sobre todo a los embriones tempranos de ratón con órganos aún poco desarrolladas, o embriones de pollo, que son de más fácil acceso ^8. Una excepción es el cerebro, que es más fácil de apuntar en la direcciónmbryos ^9,10. Este enfoque aún no se ha aplicado a la superando corazón embrionario de ratón.

Para complementar el marcaje directo con tintes o virus y para realizar el seguimiento en el linaje más avanzados embriones de ratón de la etapa y ratones adultos, el mecanismo de etiquetado de células se ha combinado con el análisis de los ratones transgénicos usando la tecnología Cre / Lox. El enfoque de Cre / Lox ¹¹ sin embargo ofrece algunas limitaciones debido a la especificidad espacio-temporal de las regiones reguladoras genómicas utilizadas para dirigir la expresión de la recombinasa, y la eficiencia de la recombinación Cre / Lox ^12. Además, este enfoque no aborda completamente las preguntas específicas de la adquisición de la migración impulsada por células de destino de la célula, ya que sólo puede etiquetar un precursor después de la activación de la región reguladora utilizada para conducir la expresión de Cre. También no se puede aplicar a los embriones humanos para cuestiones éticas obvias.

Teniendo en cuenta estas limitaciones, hemos diseñado una serie de nuevos protocolos para inyectar una variedad de agentes de marcaje de células, tales como colorantes fluorescentes, virus, moduladores de expresión de genes tales como shRNAs y vectores de etiquetado de células basadas en el ADN, o células en el embrión de ratón en E9.5 y etapas posteriores del desarrollo en regiones seleccionadas de la corazón.

Las inyecciones de ADN / celulares utilizan un microscopio estereoscópico y un dispositivo de microinyección sencillo con ex vivo el cultivo de embriones de hasta 48 horas, o el corazón aislado o cultivo de explantes de embriones de 48 a 72 h. Nos informan también un protocolo de microinyección por ultrasonidos mediado en ratón corazones embrionarios en el útero. Esta técnica permite monitorear el desarrollo de los embriones de ¹³ y permite un seguimiento a largo plazo de los injectates y / o células marcadas.

Hemos encontrado que estos enfoques preservar la función del órgano y proporcionan un entorno más representativo que las pruebas in vitro de potencial de células madre. También proporciona la oportunidad de seguir la migraciónde la etiqueta y / o inyectado células para controlar su destino. En última instancia, esto debería producir una mejor comprensión de los patrones de tejido regional y los procesos biológicos clave.

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Protocolo

1. Preparación

Animal procedimientos

Obtener la aprobación de un comité ético de los animales y seguir las directrices institucionales para el trabajo con virus, HuESC y / o de IPSC (cuando corresponda), así como el manejo del ratón, la obtención de embriones de ratón, y la realización de la cirugía de ratón. Para apareamientos programados, el día de la clavija es considerado el día embrionario (E) 0,5 / 0,5 días post-coito.

1. Agujas de microinyección:
   Para ex utero microinyección, tire de pipetas de vidrio (1,2 mm tubos capilares de borosilicato de diámetro externo) con un extractor de pipeta / beveller conseguir un m diámetro de la punta interna 1 o 10 y una forma cónica y punta afilada para inyectar ADN o células, respectivamente. Para las inyecciones de ultrasonido mediada, un uso personalizado agujas estériles, que tienen un diámetro exterior / interior (OD / ID) de 1,14 mm/0.53 mm, con una punta de 50/35 micras OD / ID.
2. Placas de Petri llenas-Silicio:
   Preparar de silicio como se describe en el manual. Llenarun vaso limpio 60 mm de diámetro placa de Petri con una capa de elastómero de ~ 1 cm. Evite las burbujas de aire.
3. Instrumentos:
   Mantenga todos los instrumentos quirúrgicos estériles, antes y durante el procedimiento.
4. Preparación de ADN:
   Añadir 3 g de ADN y 12 l de Opti-MEM en un solo tubo. Añadir 3 l Lipofectamine 2000 y 12 l de Opti-MEM en otro tubo. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente y mezclar ambas soluciones. Utilizar inmediatamente.
5. Preparación de las células:
   Preparar una suspensión de 10 ⁶ células / ml DMEM (Dulbecco medio Eagle, alta glucosa y 50% de suero de rata). 50 l de la suspensión celular final es suficiente para 8-10 embriones.
6. Teñir el preparado:
   Utilice el verde fluorescente CDCFDA-SE a 25 mg / ml de DMSO. Preparar 20 ml de alícuotas y se almacena a -20 ° C. Diluir 1:100 / 1:200 en solución salina estéril o PBS antes de su uso.
7. Preparación de virus:
   Utilice una PGK-GFP-expresando lentivirus comercial de 3 ^ª generación con un título de ~ 10 ⁹ -10 ¹⁰ transducing unidades / ml de DMEM. Para la preparación de los lentivirus, ver Tiscornia et al. ¹⁴ Llevar equipo de protección personal y de usar y disponer de los virus de forma segura.

2. Colección de E9.5 y E10.5 embriones para ex vivo Inyección

1. La eutanasia a un ratón embarazadas en el día embrionario 9.5 o 10.5.
2. Esterilizar el pecho y el abdomen del ratón con etanol al 70%.
3. Se practica una incisión en la línea media ventral para abrir el abdomen y recuperar el cuerno uterino a TA en PBS y transferirlo después de dos lavados con PBS a una placa de Petri de silicona llena con medio M16.
4. Pin el cuerno uterino con los pins de insectos a la capa de silicona de manera que el lado vascularizado del útero es en la parte inferior.
5. Cortar la superficie del útero con unas pinzas finas, y una tapa de la decidua a 1 mm por debajo de la superficie.
6. Recuperar suavemente el embrión en el saco vitelino mediante la difusión de las paredes de la decidua.
7. Guarde los embriones a los 37 °; C en M16 medio antes de la inyección de células. Para la inyección, cada embrión se transfiere al plato de silicona rellena con medio M16 pre-calentado a 37 ° C.

3. ADN o la inyección de células bajo un estereomicroscopio

1. Llene la pipeta de vidrio de la parte posterior con una jeringa Hamilton y agite la pipeta para eliminar las burbujas en la punta.
2. Establezca la pipeta en el soporte de la microinyección; ajustar la presión de mantenimiento a 50 (ADN) o 30 (células) hPa, y la presión de inyección a 150 (ADN) a 300 (células) hPa. Establezca el tiempo de inyección de 0,2 seg (ADN) o 0,5 segundos (células). Estas configuraciones pueden variar según el tipo de microinyector y pipeta.
3. Pin el embrión a la parte inferior de silicona a través del saco vitelino sin tocar el propio embrión. Ver la región del corazón y abrir el saco justo por encima de esta región.
4. Añadir 4 pins de todo el embrión para evitar cualquier movimiento durante la inyección de células.
5. Usando el micromanipulador (establecido en manual), slowlposición y la punta de la pipeta en un ángulo de 45 ° por encima del pericardio, justo por encima de la región del corazón que se va a inyectar (Figura 1).
6. Mover la pipeta en la región de interés y desencadenar la inyección. Sacar la pipeta lo más rápido posible. Asegúrese de que el corazón está latiendo apropiadamente después de la inyección de ADN / célula.

4. Embryo, Aislado Corazón y explante cultura

1. Cultura los embriones E9.5 en 25% M2 medio y 75% de suero de rata, suplementado con penicilina / estreptomicina, pre-calentado a 37 ° C y oxigenada con 40% de O _2.
2. Añadir 2 ml de medio de cultivo en un tubo de vidrio de 25 ml, añadir suavemente el embrión, y de compuestos oxigenados con 40% de O ₂ antes de atornillar la tapa en el tubo. Incubar hasta 36 horas a 37 ° C, mientras que la rotación o agitación (30 rotaciones / min).
3. En el punto de tiempo deseado (por ejemplo, 24 horas), diseccionar los corazones cuidadosamente con unas pinzas finas, sin tocar los corazones, por primera decapitating los embriones; el corazón es fácil especiales tirando de él con el tracto de salida distal.
4. Cultura del corazón aislado para otro 36-48 h en DMEM con 50% de FCS en un inserto recubierto Matrigel situado en una placa de 12 pocillos. Ver Dyer y Patterson (2013) para un protocolo mejorado de la cultura del corazón ^15.
5. Haga cualquier explante de la región de interés. A modo de ejemplo, diseccionar el canal aurículo-ventricular (AVC) y la cultura que durante 48 horas en el colágeno tipo 1 gel ^16.

5. Inyección guiada por ultrasonido en el corazón de I n utero

1. Configuración de la máquina de ultrasonido y microinyector:
   1. Utilice el sistema de ultrasonido de alta resolución con un transductor de 40 MHz y configuración microinyección en un carril.
   2. Ajuste el volumen de inyección en el microinyector a 69 nl por inyección. Consulte el manual de la microinyección del fabricante para la programación de la microinyector.
2. Preparación de la microiconfiguración njection e inyección:
   1. Coloque una micropipeta de vidrio en el microinyector. Para asegurar la eficiente inyección, primera capa de la parte interior de la pipeta con aceite mineral mediante la aspiración de hasta el volumen máximo. Luego extraiga el aceite nuevo, dejando 1-2 mm de aceite dentro de la aguja.
   2. Aspirar el inyectado hasta que se alcanza el volumen máximo. Tenga cuidado de no tocar ninguna superficie con la punta de la aguja, ya que esto embotar la punta y hacer que la inyección sea más difícil.
   3. Para estabilizar el cuerno uterino que contiene los embriones durante la inyección, utilice un plato de Petri modificado con un agujero en el medio (2.5 cm de diámetro), cubierto por una membrana delgada de silicona con un pequeño corte de la abertura en el centro, y coloque por encima de la zona de la incisión . Estabilizar la placa de Petri en la tabla de gestión de ratón mediante la colocación de 3-4 grupos de arcilla debajo de los bordes del plato.
3. Procedimiento de inyección:
   1. Afeitar el abdomen de una embarazada ratón (en la fase embrionaria se desea) antes de la anestesiasia para eliminar el vello. Tratar el abdomen con un agente de eliminación de pelo química para eliminar el vello residual y esterilizar con etanol al 70%.
   2. Anestesie un ratón embarazadas con oxígeno / isoflurano a través de una máscara facial. Utilice 3-5% de isoflurano en oxígeno al 100% para la anestesia inicial, seguido de 1-1,5% durante el resto del procedimiento. Asegúrese de que el ratón está adecuadamente anestesiado pellizcando suavemente sus patas y / o la cola.
   3. Coloque el ratón en decúbito supino sobre la mesa el manejo del ratón (puesto a calentar a 37 ° C) y cubrir los ojos con lubricante para evitar la deshidratación de la córnea.
   4. Aplique el gel de electrodos en los electrodos y la cinta de las patas a los electrodos para controlar la frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, y ECG. Coloque un termómetro rectal para monitorear la temperatura corporal.
   5. Verifique primero que el ratón está embarazada de visualizar y contar los embriones por ecografía. Aplique el gel de ultrasonido en el abdomen y la posición de la cabeza de la exploración por encima de la vejiga. Para mantener la coherencia, visualizar la vejiga primero,y contar los embriones en la izquierda y derecha cuernos uterinos, partiendo de la posición de la vejiga. Asegúrese de que los corazones de embriones están latiendo normalmente.
   6. Si el ratón está embarazada, coloque la placa de Petri por encima del futuro sitio de la incisión con arcilla. Presione el plato ligeramente en el abdomen para que el plato está en contacto directo.
   7. Quite el plato y esterilizar el abdomen de nuevo. Hacer un 1.5-2 cm de incisión de línea media ventral, aproximadamente 0,75-1 cm por encima de la vagina, para abrir el abdomen y el peritoneo. Evite lesiones en los órganos internos.
   8. Exteriorizar la izquierda o la trompa uterina derecha con pinzas, tire de él a través de la membrana de silicio de la placa, y estabilizar el plato en la arcilla de nuevo. Prevenir extensa tracción o manipulación, ya que esto puede causar sangrado de los vasos uterinos y la muerte prematura de la hembra y / o embriones.
   9. Cuente los embriones de nuevo para garantizar el mantenimiento de registros adecuados de los cuales se inyectaron embriones.
   10. Aplique el gel de ultrasonido en la ucuernos terine a la imagen del corazón y para prevenir la deshidratación.
   11. Imagen de la primera embrión a inyectar. Compruebe latido normal del corazón embrionario y llevar un registro de la orientación-cráneo-caudal y de izquierda a derecha del embrión. Si es necesario, vuelva a colocar el cuerno uterino ligeramente para asegurar la orientación correcta. Si esto resulta difícil, pasar a la siguiente embrión.
   12. Perforar el útero cuidadosamente con la aguja de microinyección para colocar la aguja en un ángulo de 45 ° por encima del embrión, ligeramente fuera del pericardio (Figura 3). Para el marcaje de las células epicárdicas, la imagen del corazón de una de cuatro cámaras y la posición de la aguja de manera que apunte hacia la ranura aurículo-ventricular (Figura 3). Si el ángulo es necesario ajustar, retirar la aguja, y la posición. No ajuste el ángulo con la aguja dentro del útero, ya que esto podría romper la aguja. Evite perforar otros tejidos, tales como los miembros o de la placenta.
   13. Mueva la agujasobre la pared pericárdica y pincharla con un movimiento suave, pero rápida. En general, habrá un poco de resistencia, pero moviendo la aguja demasiado rápido puede causar que la punta de la aguja para perforar el corazón mismo. La punta debe terminar en el espacio pericárdico del surco aurículo-ventricular. En el caso de una hemorragia pericárdica, las células sanguíneas serán visibles como un patrón similar a la nieve blanca. Si este es el caso, dejar de inyectarse el embrión y pasar a otro embrión.
   14. Se inyecta la sustancia inyectada. Inyectar como máximo 700 nl en el espacio pericárdico para evitar efectos adversos sobre el desarrollo de los corazones. Supervisar la correcta inyección por una ligera inflamación, temporal del saco pericárdico.
   15. Después de la inyección, retire la aguja y confirmar que inyectado todavía se puede expulsar a asegurarse de que la aguja no estaba atascado por fragmentos de tejido.
   16. Vuelva a colocar la tabla de gestión de la imagen y se inyecta la siguiente embrión. Mantener el número de embriones inyectados a máxima 3-4 (en un cuerno uterino) para evitaranestesia prolongada, para permitir el control de embriones en el cuerno uterino opuesto, y para garantizar que el procedimiento no perturbó el desarrollo embrionario.
   17. Después de inyectar el número deseado de embriones, eliminar el exceso de gel de ultrasonido y coloque suavemente el cuerno uterino en el abdomen en su posición correcta.
   18. Cierre el abdomen materno mediante el uso de una capa de sutura para el peritoneo y los músculos abdominales, y una segunda capa de sutura para la piel.
   19. Inyectar el ratón con la primera dosis de la medicación para el dolor. Utilice una inyección de 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina 15 minutos antes de poner fin a la anestesia y tres inyecciones adicionales con intervalos de 12 h.
   20. Deje de anestesia y vigilar el ratón para la recuperación adecuada del procedimiento. Casa del ratón embarazada en una jaula individual para la duración deseada de seguimiento.

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Resultados

El uso de los protocolos de inyección descritos anteriormente, las células pueden ser etiquetados y / o inyectados en el corazón embrionario de ratón. Como prueba de concepto, se muestran varios ejemplos en los que el protocolo de inyección y el vivo explante ex AVC, aislado del corazón, o el cultivo de embriones entera se combinaron (Figura 1).

La Figura 1 muestra la preparación del embrión antes de la inyección de células. El em...

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Discusión

Los in vivo protocolos intra-cardíacos ex inyección descritos anteriormente están diseñados para preservar la función miocárdica durante al menos 48 horas a mediados de la etapa (E9.5-E11.5 embriones de ratón). Estos enfoques de inyección permiten para inyección espacialmente selectiva de ADN o células. Los pocos ejemplos que se muestran en las figuras 1-3 proporcionan una prueba de concepto para delinear ex vivo e in vivo los mecanismos moleculares de los p...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Setups/Hardware
40 MHz Transducer	VisualSonics	MS550S
Microinjector	VisualSonics
Microinjector	Eppendorf	5242
Micromanipulator	Eppendorf	5171
Nitrogen			required to pressurize the injector
Rail system	VisualSonics
rotator			to rotate glass tube with embryos inside the incubator
Standard incubator			5% CO2, 37 °C
stereomicroscope	Zeiss	Discovery. V8
Vevo 2100	VisualSonics
Microinjection
Borosilicate capillary tubes	World Precision Instrument	KTW-120-6	1.2-μm external diameter
Pipette puller	Sutter	Model P87
Microinjection needles	Origio-Humagen	C060609	OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip
Hamilton syringes
Petri dishes			10-cm diameter
Mineral oil	Sigma	M8410
Silicon membrane	Visualsonics		4.3 x 4.3 cm
Play-Doh
Isoflurane	Vet One
hair removal agent	Nair
Eye lubricant	Optixcare	31779
Electrode gel (Signa)	Parker
Suture	Sofsilk 5-0	S1173
Ultrasound gel	Aquasonic
Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-1	0.05-0.1 mg/kg in saline
Other
Silicone Elastomer	Dow Corning	Sylgard 184
Glass petridishes	Fine Science Tools		60-mm diameter
Insect pins	Fine Science Tools	26002-20
Media and culture reagents
Optimem medium	Life Technologies	51985026
M2 medium	Sigma	M7167
Dulbecco’s Eagle Medium	Lonza	BE12-640F	high glucose and 50% rat serum
M16 medium	Sigma	M7292
Rat serum	Janvier	ODI 7158
Pennicilin/streptomycin	Life Technologies	15140-12
oxygen 40%	Air liquid		required to oxygenate the embryo culture medium
Fetal calf serum	Fisher	RVJ35882
Matrigel	BD	356230
Collagen type I	BD	354236	to coat culture dishes for explant culture
Culture dishes	Dutcher /Orange	131020
Injectates
CDCFDA-SE	Invitrogen/Molecular Probes	C1165	25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use.
PGK-GFP-expressing lentivirus			~8E9 transducing units/ml DMEM
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019