El uso de un enlace del sitio Tag α-Bungarotoxina para el Estudio de GABA A receptor de membrana localización y el Tráfico

Resumen

Aquí se demuestra el uso de colorante fluorescente Alexa acoplado a α-bungarotoxina para medir GABA A localización en la superficie del receptor y endocitosis en las neuronas del hipocampo. A través del uso de construcciones que tienen una etiqueta extracelular corta que se une α-bungarotoxina, análisis de membrana de tráfico endocítica de proteínas de plasma se puede lograr.

Resumen

Cada vez es más evidente que los receptores de neurotransmisores, entre ellos los receptores ionotrópicos GABAA (GABAAR), exhibición tráfico altamente dinámico y la movilidad de la superficie celular ^1-7. Para estudiar receptor de células localización en la superficie y la endocitosis, la técnica descrita aquí combina el uso de fluorescente α-bungarotoxina con células que expresan construcciones que contienen un-bungarotoxina α (Bgt) sitio de unión (BBS). El BBS (WRYYESSLEPYPD) se basa en la subunidad α del receptor nicotínico de la acetilcolina del músculo, que se une con alta afinidad Bgt ^8,9. Incorporación del sitio BBS permite la localización de la superficie y mediciones de la inserción del receptor o la retirada con la aplicación de fluorescente exógeno Bgt, tal como se describe anteriormente en el seguimiento de GABAA y metabotrópicos GABAB receptores ^2,10. Además del sitio de BBS, insertamos una GFP sensible al pH (pHGFP ¹¹⁾ entre los aminoácidos 4 y 5 de la subunidad madura GABAAR por m estándarestrategias de biología y de clonación PCR olecular (ver figura 1) ^12. El BBS es 3 'de la GFP reportero sensible al pH, separadas por un enlazador alanina / ácido prolina 13-amino. Para el tráfico de los estudios descritos en esta publicación que se basan en muestras fijas, la pHGFP sirve como reportero del total etiquetado GABAAR los niveles de proteína de la subunidad, permitiendo la normalización del etiquetado Bgt población receptora de población total al receptor. Esto minimiza célula a célula Bgt tinción variabilidad de la señal resultante de la mayor o menor expresión basal de las subunidades GABAAR etiquetados. Además, la etiqueta pHGFP permite una fácil identificación de las células que expresan constructos para experimentos de imagen en vivo o fijos.

Introducción

El uso de acoplado con fluorescencia α-bungarotoxina para estudiar la localización del receptor y la dinámica fue pionera en los estudios del receptor de acetilcolina nicotínico ^13-15, diana endógeno de la toxina. Posteriormente, la incorporación del péptido mínima Bgt de unión (BBS) se ha utilizado para estudiar el tráfico de ambos canales de iones excitatorios e inhibitorios mediados por ligandos y receptores acoplados a proteína G ^2,10,16-21. Esta técnica basada en BBS ofrece ventajas a otros enfoques utilizados para estudios de tráfico, como los métodos de biotinilación superficie, el etiquetado de anticuerpos de células vivas con anticuerpos frente a epítopos extracelulares, y la recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP). Durante superficie celular biotinilación aminas libres están covalentemente modificados, con el potencial de afectar la actividad celular. Los estudios basados ​​en anticuerpos a menudo se han visto obstaculizados por la agrupación antígeno de superficie o de nivelación, lo que puede alterar los eventos de tráfico. Debido a la etapa de blanqueo para FRAP sos estudios, un asunto importante es dañar la estructura celular subyacente. Una ventaja adicional es que BBS etiquetada construcciones también se pueden utilizar para metodologías bioquímicas con el tráfico de biotina acoplada bungarotoxina a asnos del receptor. Esta técnica es fácilmente aplicable a líneas celulares y células primarias. Para uso en células que expresan nicotínicos de acetilcolina (nAChR), los receptores, el antagonista de nAChR tubocurarina debe ser utilizado en todo el protocolo como se indica. Realización de una Bgt etiquetado simple superficie (equivalente al punto de tiempo T = 0 para el protocolo de endocitosis) en las células no transfectadas en ausencia de tubocurarina proporcionará pruebas de nAChR endógeno.

Una consideración importante para el uso de esta técnica es la inserción apropiada de la BBS de modo que está presente en una localización extracelular cuando la proteína de interés se entrega a la membrana plasmática. Por ejemplo, los dominios N-terminales de las subunidades GABAAR residen en el lumen vesiculares durante el tráficofico y convertirse extracelular después de la inserción del receptor en la membrana plasmática, lo que permite un etiquetado específico de los receptores de la superficie celular y evaluación de su eliminación de la superficie celular por eventos endocítica. Hemos demostrado anteriormente que la adición de GFP, myc, o BBS epítopos a este dominio de subunidades GABAAR es funcionalmente silenciosa. Los controles estándar se deben realizar para asegurar que la proteína marcada se expresa en niveles similares a una construcción sin etiquetar, que localiza apropiadamente, y que no afecta a la función del receptor. Esta caracterización de las construcciones transfectadas también ayudará en las preocupaciones de sobreexpresión de solución de problemas.

Protocolo

Todos los protocolos descritos a continuación son de acuerdo con la IACUC e IRB juntas de revisión institucional de la Universidad de Pittsburgh Facultad de Medicina.

1. Preparación de los cultivos neuronales del hipocampo en cultivo de tejidos Capucha

Nota: Utilice una técnica estéril y reactivos a lo largo Protocolo 1.

1. Preparar poli-D-lisina (0,1 mg / ml en _H2O) cubreobjetos de vidrio revestido como un sustrato para el cultivo neuronal.
   1. Coloque 4-5 cubreobjetos de vidrio redondos dentro de cada 3,5 cm de tejido placa de cultivo.
   2. Punto 70 l de poli-D-lisina en cada cubreobjetos de 12 mm. Nota: para imágenes en vivo, un fondo de cristal de 3,5 cm placa de cultivo de tejido se puede utilizar (detectar 200 l de poli-D-lisina en incrustado cubreobjetos de 14 mm).
   3. Deja los platos preparados en el cultivo de tejidos capó O / N. Para minimizar la poli-D-lisina evaporación y mantener las superficies estériles en la campana de cultivo de tejidos, cerrar la hoja de la ventana y apague ªe soplador de O / N. Nota: Las luces UV no se utilizan durante la incubación O / N.
   4. A la mañana siguiente, lavar los platos 3 veces con 2 ml de H ₂ O.
   5. Después de quitar el último _H2O lavado, añadir 2 ml de medio a cada placa 3,5 cm y dejar los platos en la incubadora hasta que esté listo a la placa de las neuronas en el paso 1.4.
2. Las neuronas del hipocampo se preparan a partir del día embrionario 18-19 (E18-19) ratas (modificado de Goslin ^22).
3. Transfectar neuronas recién disociados en el día de cultivo con 1-4 g de ADN de constructo maxiprepped.
   Nota: típicamente 3 g de ADN se transfecta en 1-2 Millón neuronas, con una viabilidad de 50% y una eficiencia de transfección del 60% (por ejemplo, a partir de 2 millones de neuronas: ((2 x 10 ⁶ neuronas x 0.5) 0.6) proporciona aproximadamente 1 millón de neuronas,.. 600.000 de los cuales son transfectadas ¹ cantidades diferentes de construcción de ADN se pueden transfectar la hora de solucionar los posibles problemas desobre-expresión, seguido por la caracterización apropiada de localización y función constructo.
4. Placa de las neuronas transfectadas sobre los cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina a una densidad final de aproximadamente 200.000 neuronas por 3,5 cm plato. Nota: para un fondo de cristal plato, placa 40.000-50.000 neuronas en el área del cristal 14 mm.
5. Sustituya el soporte 4-24 horas después de la preparación de cultivos neuronales, a continuación, permiten que las neuronas se desarrollan en la incubadora hasta 14-17 días in vitro (DIV) o de la etapa deseada.

2. Ensayo Endocitosis

PRECAUCIÓN: Nota sobre la α-bungarotoxina y residuos tubocurarina y dirección:

1. Manejo de todas las neurotoxinas de péptidos se recomienda dentro de los lineamientos de Bioseguridad Nivel 2 (BL-2) los protocolos de investigación. Todo el equipo de protección personal adecuado que se debe usar. Polvos liofilizados toxina debe reconstituirse siguiendo las instrucciones del fabricante. Toxina shou residuosld eliminarse siguiendo las normativas de salud y seguridad ambiental directrices de la institución de gobierno.
2. Para eliminar posibles agregados de péptidos que se puedan haber formado durante el almacenamiento, alícuotas de α-bungarotoxina deben ser centrifugadas brevemente antes de su uso, y el sobrenadante se deben utilizar para el experimento.
3. α-bungarotoxina (Bgt) las existencias se resuspenden a una concentración de 1 mg / ml en _H2O estéril y se almacenan en 10 ml de alícuotas a -20 ° C. Existencias Bgt fluorescencia acoplados se utilizan a 3 g / ml. Tubocurarina se utiliza a una concentración final de 150 mM.

1. Banco Set top bloque calentador a 16 ° C en cámara frigorífica con aluminio delgado o placa de acero inoxidable en la parte superior. Alternativamente, si está disponible, un alto dispositivo de refrigeración / calefacción banco se puede utilizar para cada paso que requiere 16 ° C.
2. Enfriar extracelular solución salina tamponada con Hepes (HBS contienen en mM: 135 NaCl, 4,7 KCl, 10 HEPES, 11 de glucosa, 1,2 MgCl ₂ y 2,5_CaCl2, pH 7,4) a 16 ° C en un baño de agua.
3. Transferencia de los platos de la neurona a la placa de aluminio a 16 ° C y enfriar durante 5 min.
4. Retire los medios de comunicación (mantener medios condicionados y reserva en la incubadora para el paso 2.8, endocitosis puntos de tiempo de ensayo) y reemplazar con 1 ml de 16 ° C HBS + tubocurarina (150 M) durante 2 min.
5. Eliminar HBS + tubocurarina al contenedor de desperdicio etiquetado y sustituir con 1 ml de 16 ° C HBS + tubocurarina (150 M) + α-bungarotoxina Alexa 594 [3 g / ml], incubando a 16 ° C durante 15 min.
6. Eliminar HBS + tubocurarina + α-bungarotoxina Alexa 594 a la etiqueta contenedor de residuos y lavar platos 3 veces con 2 ml de 16 ° C HBS (los lavados se pueden recoger a través de aspiración en un matraz de vacío que contiene 50 ml de 50% de lejía).
7. Para los experimentos de series temporales de imágenes en vivo siguientes endocitosis del receptor utilizando un fondo de cristal 3,5 cm placa de cultivo, realice los pasos 2.1 hasta 2.6, a continuación, llevar la cápsula a la etapa de calefacción(Dispositivo Peltier) en el microscopio, y comenzar de imágenes con un microscopio confocal o configuración TIRF.
8. La transferencia de T = 0 cubreobjetos de punto de tiempo en un plato de la RT 4% de paraformaldehído / 4% de sacarosa durante 20 minutos, continuando con otros cubreobjetos en el paso 2.9.
9. Para otros momentos de la hora, sustituya HBS con condicionados equilibró 37 ° C Medios (reservado en el paso 2.4) y volver a la incubadora por endocitosis a 37 ° C. Nota: sugirieron puntos adicionales de tiempo de T = 15, 30 y 60.
10. En los puntos de tiempo necesario, tomar los platos de la incubadora, lave rápidamente dos veces con 2 ml de RT DPBS (DPBS sin calcio, magnesio) a continuación, fijar en paraformaldehído al 4% / 4% de sacarosa durante 20 min.
11. Después de 20 min de fijación, retire paraformaldehído al 4% / 4% de sacarosa que perder envase y lavar los platos dos veces con 2 ml RT DPBS.
12. Incubar cubreobjetos a TA durante 10 min en solución de bloqueo de inmunofluorescencia (solución de bloqueo = 5% de suero de caballo, 0,5% de BSA en DPBS) que contiene 0,2% de Triton X-100 a la permeabilidadize las neuronas y permitir inmunotinción anti GFP de la piscina receptor intracelular y / o etiquetado de las otras proteínas de interés.
13. Extraiga el bloque de + 0,2% Triton X-100 y se incuba cubreobjetos en solución de bloqueo inmunofluorescencia sin Triton X-100 durante 20 a 30 min.
14. Realice las incubaciones de anticuerpos primarios de cubreobjetos en bloque durante varias horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Nota: la incubación de cubreobjetos con primarios a 4 ° CO / N produce rutinariamente mejores resultados de inmunofluorescencia.
15. Lave cubreobjetos 3 veces con DPBS (5 min para cada etapa de lavado).
16. Incubar cubreobjetos con anticuerpos secundarios en solución de bloqueo durante 1 hora a TA.
17. Lave cubreobjetos 3 veces con DPBS (5 min para cada etapa de lavado).
18. Cubreobjetos montaje, manejo cada cubreobjetos de forma individual: eliminar el exceso de líquido de la parte posterior del cubreobjetos con papel de laboratorio, luego invierta cubreobjetos en 4 l de medio de montaje sobre un portaobjetos de vidrio.
19. Permita que se sequen a temperatura ambiente cubiertos durante 30 minutos y luego stmineral a 4 ° C hasta el momento de la microscopía.
20. Adquisición y análisis de experimentos con microscopía confocal (ciegos a condición experimental) Imagen. 60X petróleo NA 1.49 objetivo de inmersión con los siguientes láseres: gas argón de 488 nm, 561 diode, diodo 640.
    1. Utilizando los mismos parámetros de adquisición de imágenes, la obtención de imágenes de sección Z individuales con el cuerpo celular neuronal y varios procesos dendríticas en foco.
    2. Cuantificar α-bungarotoxina Alexa señal de fluorescencia de GFP y la inmunotinción a lo largo de 20 micras de 3-4 dendritas proximales por neurona, utilizando el mismo umbral para el análisis de todos los datos de endocitosis.
    3. Analizar los datos de 10 a 12 neuronas para cada punto de tiempo, repitiendo el experimento con varios cultivos neuronales independientes.

Resultados

Caracterización de una construcción de BBS etiquetado incluye controles importantes tales como la determinación de si la proteína expresada se ensambla correctamente (en particular con los receptores de compuestos de múltiples subunidades), trafica a la superficie celular y se localiza apropiadamente. Las sinapsis inhibitorias se componen de GABA A cúmulos superficiales receptor que colocalize con el inhibidor gephyrin andamio de proteínas y están adosados ​​a los terminales presinápticos inhibitorios, iden...

Discusión

Las técnicas fijas y basadas BBS descritos aquí pueden ser utilizados para rastrear receptor u otra proteína de membrana de plasma trata de líneas de células, neuronas y otras células primarias. Este método ha sido utilizado con éxito para estudiar inserción en la membrana y la eliminación de canales iónicos activados por ligando y GPCR y evaluar los cambios en el tráfico debido a la presencia de agonistas de los receptores y moduladores. Los aspectos clave incluyen la localización apropiada de la etiqueta ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
P3 Primary Cell 4D kit	Lonza	V4XP-3024
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate	Molecular Probes	B35450
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate	Molecular Probes	B13422
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probes	B13423
(+)-Tubocurarine chloride	Tocris	2820
Mounting medium	DAKO	cS703
DPBS no calcium, magnesium	Invitrogen	14190-136
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
Gephyrin antibody	Synaptic Systems	147 011	1:300
VIAAT/VGAT antibody	Synaptic Systems	131 002	1:1,000
anti GFP	Life Technologies	A6455	1:2,000
Glass bottom tissue culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes
Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm	Warner Instruments	640-0702