Captura compuesto Espectrometría de Masas - Una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-GMP efectoras Proteínas

Resumen

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Resumen

Se ha logrado un progreso considerable en la última década hacia la identificación y caracterización de las enzimas implicadas en la síntesis (guanilato diguanylate) y degradación (fosfodiesterasas) del segundo mensajero c-di-GMP. Por el contrario, hay poca información disponible acerca de los mecanismos moleculares y componentes celulares a través del cual esta molécula de señalización regula una amplia gama de procesos celulares. La mayoría de las proteínas efectoras conocidas pertenecen a la familia Pilz o se degeneró guanilato diguanylate o fosfodiesterasas que han renunciado a la catálisis y han adoptado la función efectora. Por lo tanto, para definir mejor la red de c-di-GMP celular en una amplia gama de bacterias se requieren métodos experimentales para identificar y validar nuevos efectores para el cual fiable en las predicciones in silico fallar.

Recientemente hemos desarrollado una novela de captura compuesto Espectrometría de Masas (CCMS) tecnología basada como una poderosa herramienta parabioquímicamente identificar y caracterizar proteínas de unión a c-di-GMP. Esta técnica ha sido previamente informado para ser aplicable a una amplia gama de organismos ^1. Aquí se da una descripción detallada del protocolo que utilizamos para investigar tales componentes de señalización. Como un ejemplo, usamos Pseudomonas aeruginosa, un patógeno oportunista en la que c-di-GMP juega un papel crítico en el control de la virulencia y la biopelícula. CCMS identificó 74% (38/51) de los componentes conocidos o previstos de la red de c-di-GMP. Este estudio explica el procedimiento CCMS en detalle, y lo establece como una herramienta potente y versátil para identificar nuevos componentes que participan en la señalización de pequeña molécula.

Introducción

c-di-GMP es un segundo mensajero clave usada por la mayoría de las bacterias para controlar varios aspectos de su crecimiento y comportamiento. Por ejemplo, c-di-GMP regula la progresión del ciclo celular, la motilidad y la expresión de exopolisacáridos y adhesinas de superficie ^2-4. A través de la coordinación de tales procesos de c-di-GMP promueve la formación de biofilm, un proceso que está asociado con infecciones crónicas de una gama de bacterias patógenas ^5. c-di-GMP se sintetiza por enzimas llamadas guanilato diguanylate (PED) que albergan un dominio catalítico GGDEF ^4. Algunos PED poseen un sitio de inhibidor que regula hacia abajo la actividad de la adenilato sobre c-di-GMP de unión. La degradación de c-di-GMP está catalizada por dos clases distintas de las fosfodiesterasas (PDE) que alberga ya sea un EAL catalítica o HD-GYP de dominio ^6,7.

La mayoría de las proteínas efectoras conocidas que se unen directamente c-di-GMP pertenecen a una de las tres clases de proteínas: catalíticaGGDEF o EAL dominios aliado inactivos y dominios Pilz, pequeños interruptores moleculares que experimentan cambios conformacionales a vinculantes c-di-GMP ^8. PED, PDE y Pilz proteínas están bien caracterizados y sus dominios se pueden predecir en silico relativamente segura. Un especial interés se centra ahora en la identificación de nuevos tipos de efectores c-di-GMP. Algunos efectores de c-di-GMP con diferentes motivos de unión se describieron recientemente como el CRP / FNR Bcam1349 familia de proteínas en Burkholderia cenocepacia o la FleQ regulador transcripcional en P. aeruginosa ^9,10. Además, riboswitches-GMP-específico c-di han sido recientemente identificados y muestran para controlar la expresión génica de una manera ^c-di-GMP-11 dependiente. Los motivos c-di-GMP de unión de diferentes efectores son sólo mal conservadas hacer predicciones bioinformáticas de tales proteínas difícil. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un método bioquímico, que se basa en el uso de un spe c-di-GMPcaptura compuesto espe- combinada con espectrometría de masas ^1,12,13.

Hemos diseñado recientemente una captura compuesto c-di-GMP novela trivalente (CDG-CC, la Figura 1) ^1. Este andamio química se compone de: 1) un resto de c-di-GMP utilizado como cebo para capturar c-di-GMP proteínas de unión, 2) un grupo reactivo fotoactivable-UV utiliza para reticular el CDG-CC a las proteínas unidas y 3) una biotina para aislar las proteínas capturadas usando perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. El CDG-CC se puede utilizar para capturar directa y específicamente efectores de c-di-GMP a partir de una mezcla compleja de macromoléculas como lisados ​​celulares. Compuesto de captura basada y han sido previamente informado enfoques químicos proteómica basadas ser aplicable a una amplia gama de organismos, por ejemplo, Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium y P. aeruginosa ^1,14.

En este trabajo metodológico,proporcionamos una descripción en profundidad del procedimiento CCMS utilizando extractos de P. aeruginosa como un ejemplo. Este estudio establece CCMS como una herramienta poderosa y versátil para identificar bioquímicamente nuevos componentes que participan en la señalización de pequeña molécula.

Protocolo

1. Preparación de lisado

1. Crecer P. aeruginosa células en LB a la DO deseada.
   NOTA: Para obtener orientación: utilizar ≈ 100 ml de cultivo / muestra para cultivos en fase estacionaria y ≈ 500 ml cultur / muestra para cultivos en fase log (OD _{600 nm} = 0,5).
2. Pellet por centrifugación durante 20 min a 5000 x g.
3. Resuspender 0,5-1 g de sedimento en 1 ml de tampón de lisis (MES 6,7 mM, 6,7 mM de HEPES, NaCl 200 mM, 6,7 mM Kac, DDT 1 mM, pH 7,5) y se añade inhibidor de la proteasa (mini completo, libre de EDTA), así como DNaseI.
4. Lisan las células mediante 3 pasos a través de una célula de presión francesa, a 20.000 psi (ver Lista de Materiales).
5. Ultra-centrifugar el lisado celular a 100.000 x g durante 1 hora a 4 ° C.
6. Guardar el sobrenadante (vaya al paso 2).
7. Lavar el sedimento con 1 ml de 1x tampón de lisis pipeteando arriba y abajo.
8. Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 1 hora a 4 ° C.
9. Flash congelar el sedimento ennitrógeno líquido y se almacena a -20 ° C hasta su utilización para la captura de las proteínas de membrana (ver paso 3).

2. La eliminación de los nucleótidos libres c-di-GMP y Otros (Fracción Soluble solamente)

1. Lavar una columna de desalación PD10 (ver Lista de Materiales) con 10 ml de tampón de lisis frío.
2. Verter el sobrenadante (≈ 1 ml) en el PD10 con el fin de eliminar los nucleótidos.
3. Se eluye con 4 ml de tampón de lisis frío (500 l pasos).
4. Seleccione las fracciones más concentradas como se determina mediante el ensayo de Bradford, y los mismos se agrupen.

3. Pellet resuspensión y solubilización (fracción de membrana solamente)

1. Resuspender el precipitado en 500 a 1.000 l de búfer de captura 1x (sin detergente) (ver Tabla 1).
   NOTA: El pellet es difícil para volver a suspender. Se aconseja primera pipeta de arriba abajo con una pipeta para volver a suspender el sedimento o menos, luego de usar una jeringa de 27 G para así homogeneizar la solución.
2. Añadir 1% (w / v) n-dodecil-β-D-maltopiranósido (DDM).
3. Incubar a 4 ° C durante al menos 2 horas (o O / N) en una rueda giratoria.
4. Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 1 hora a 4 ° C.
5. Se recoge el sobrenadante.

4. Proteína de medición de concentración

1. Medir la concentración de proteína por el ensayo de Bradford (mediante ensayo BCA para la fracción de membrana).
2. Ajuste la concentración de proteína total a 10 mg / ml.

5. Captura

1. Mezclar 300 g de proteína con 1 mM del PIB, GTP, ATP, CTP, y 20 l de tampón de captura de 5x (mM HEPES 100 mM, KAc 250 mM, MgAc 50, 5% de glicerol, pH 7,5) (Tabla 1). Ajuste el volumen de reacción de 100 l con H ₂ O.
   NOTA: el volumen total incluye el volumen del CDG-CC y c-di-GMP en el caso del control de la competencia (véase el paso 5.3 y la Tabla 2).
   NOTA: todos los experimentos se llevaron a cabo en 200 y# 181; l tiras de PCR de 12 tubos (Thermo Scientific).
   NOTA: para la fracción de membrana, asegúrese de mantener siempre la concentración DDM encima de la concentración micelar crítica (0,01% w / v) hasta la etapa de solubilización de proteínas en urea 8 M (Paso 7.1).
2. Incubar a 4 ° C durante 30 min en una rueda giratoria.
3. Añadir 10 mM CDG-CC (concentración final).
   NOTA: incluir un control sin CDG-CC (referido como "el control del grano"), y un control suplementado con 1 mM de c-di-GMP ("control de la competencia") (ver Tabla 2).
   NOTA: la concentración CDG-CC se puede ajustar de 1 a 10 mM.
4. Incubar a 4 ° C durante al menos 2 h (O / N para la fracción de membrana) en una rueda giratoria, en la oscuridad.
5. Después de un giro corto, cross-link mediante la activación del resto reactivo de la CDG-CC con luz UV durante 4 min, utilizando un CaproBox (ver Lista de Materiales, λ = 310 nm, irradiancia ≥10 mW / cm², distancia de la fuente = 2 cm). Nota: Retire la tapa de las tiras de reticulación previa.
6. Añadir 25 l de 5x tampón de lavado (NaCl 5 M, Tris 250 mM, pH 7,5) y 50 l de perlas magnéticas de estreptavidina así resuspendidos, homogeneizar suavemente.
7. Incubar a 4 ° C durante 1 hora en una rueda giratoria.

6. Los pasos de lavado

NOTA: (Imán: ver Lista de Materiales). Comience con una captura de las perlas magnéticas en la tira tapa PCR, con el imán. A continuación, reemplace la tira de PCR por uno nuevo que contenga la siguiente solución de lavado. Retire el imán y volver a suspender las perlas, y se incuba 2 min. Centrifugar y reemplazar la tapa por una tapa fresco.

1. Las etapas de lavado (fracción soluble únicamente)
   1. Lavar 6 veces en 200 l de tampón de lavado 1x.
   2. Lavar una vez en 200 l de calidad HPLC H ₂ O.
   3. Lavar 6 veces en 200 l 80% de acetonitrilo.
   4. Lavar 2 veces en 200 l de calidad HPLC H ₂ O.
2. Las etapas de lavado (membrafracción ne solamente)
   1. Lavar 5 veces en 200 l de tampón de lavado 1x + 0,1% DDM.
   2. Lavar 2 veces en 200 l de tampón de lavado 1x + 0,05% DDM.
   3. Lavar una vez en 200 l de tampón de lavado 1x + 0,025% DDM.
   4. Lavar una vez en 200 l de tampón de lavado 1x + 0,0125% DDM.
   5. Lavar 3 veces en 200 l mM ABC 100 (bicarbonato de amonio, NH ₄ CO ₃₎ + 2 M urea.

7. MS Preparación de la muestra

1. Resuspender las perlas (directamente en la tapa) en 20 l mM ABC 100 (mM ABC 100 + 8 M urea para la fracción de membrana) y transferir a tubos de 1,5 ml.
2. Fracción de membrana única: se incuba a 60 ° C durante 5 min, agitando a 500 rpm.
3. Añadir 0,5 l mM TCEP 200 (tris (2-carboxietil) fosfina) y se incuba a 60 ° C durante 1 hora, con agitación a 500 rpm. Enfriar a 25 ° C.
4. Añadir 0,5 l de 400 mM recién preparada yodoacetamida y se incuba a 25 ° C durante 30 minutos, agitando unaT 500 rpm y en la oscuridad.
5. Añadir 0,5 l 0,5 M N-acetil-cisteína y se incuba a 25 ° C durante 10 min, agitando a 500 rpm.
6. Fracción de membrana única: añadir 1 l Lys-C e incubar a 37 ° C, O / N.
7. Añadir 2 g de tripsina y se incuba O / N a 37 ° C, agitando a 500 rpm (wrap en Parafilm para evitar el secado).
   NOTA: las muestras se pueden almacenar a -20 ° C en esta etapa.
   NOTA: fracción de membrana solamente: añadir mM ABC 100 para ajustar la concentración de urea a <2 M antes de la adición de tripsina.
8. Brevemente centrifugar los tubos y recoger bolitas con el imán.
9. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml (repita este paso si los granos se dejan).
10. Añadir 5 l 5% de TFA (ácido trifluoroacético) + 1 l 2 M HCl (15 l 5% TFA + 5 l 2 M HCl para la fracción de membrana).
11. Condición columnas C18 MicroSpin (El Grupo Nest, MA, EE.UU.) con 150 l de acetonitrilo (spin 20 segundos a 2.400 rpm).
12. Equilibrate las columnas C18 2 veces con 150 l 0,1% TFA (giro 20 s, 2400 rpm).
13. Cargue la muestra y girar 2 min, 2000 rpm.
14. Actualizar el flujo a través en la columna y repetir la etapa de hilatura (2 min, 2000 rpm).
15. Lavar 3 veces con 150 l 0,1% de TFA, 5% de acetonitrilo (20 segundos, 2400 rpm).
16. Tomar un tubo nuevo y se eluye dos veces con 150 l 0,1% de TFA, 50% de acetonitrilo (2 min, 2000 rpm).
17. Seque los péptidos en una velocidad-vac.
18. Resuspender en 40 l 98% H ₂ O, 2% de acetonitrilo, ácido fórmico 0,15%.
19. Sonicar 20 seg (ciclo de pulso 0,5, amplitud 100%; ver Lista de Materiales) y centrifugar 5 seg, 12.000 rpm (centrífuga de mesa). Vortex 10 seg, y de girar 5 seg, 12.000 rpm. Transferencia en un vial de HPLC para el análisis de LC-MS / MS.
20. Congelar a -20 ° C.
    NOTA: las muestras se pueden almacenar a -20 ° C en esta etapa.

8. LC-MS / MS Analysis

1. Ejecutar un nano-LC (sistemas nano-LC) equipped con una columna RP-HPLC (75 m x 37 cm) rellena con resina C18 (magia C18 AQ 3 m) usando un gradiente lineal de disolvente A (ácido fórmico al 0,15%, 2% de acetonitrilo) 95% y 5% de disolvente B ( 98% de acetonitrilo, ácido fórmico 0,15%) a 35% de disolvente B durante 60 min a un caudal de 0,2 l / min.
2. Analizar los péptidos utilizando LC-MS / MS (doble presión LTQ-Orbitrap Velos espectrómetro de masas, conectado a una fuente de iones de electrospray).
   NOTA: El modo de adquisición de datos se creó para obtener una alta resolución MS Analizar en la parte FT del espectrómetro de masas con una resolución de 60.000 FWHM seguido por MS / MS de las exploraciones en la trampa de iones lineal de los 20 iones más intensos. Para aumentar la eficiencia de los intentos de MS / MS, el modus proyección estatal encargada estaba habilitado para excluir sin asignar y solitariamente cobra iones. Colusión disociación inducida se desencadenó cuando el precursor superó los 100 recuentos de iones. La duración dinámica de exclusión se fijó a 30 seg. El tiempo de acumulación de iones se fijó a 300 mseg (MS) y 50mseg (MS / MS).

9. Base de datos de búsqueda

1. Descargue el P. aeruginosa NCBI-base de datos a través de la página de NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
2. Convertir los espectros MS prima en archivos genéricos de la mascota (MGF) utilizando la herramienta de conversión MassMatrix ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
3. Buscar en este archivo mgf usando MASCOTA versión 2.3 contra la P. aeruginosa NCBI-base de datos que contiene adelante y entradas de proteínas inversa señuelo.
4. Realizar una en la digestión de tripsina silico después de lisina y arginina (a no ser seguido por prolina) tolerando dos perdidas divisiones en péptidos plenamente tríptico.
5. Establezca los parámetros de búsqueda de base de datos para permitir metioninas oxidado (15.99491 Da) como variable modificaciones y carboxiamidometilación (57.021464 Da) de residuos de cisteína como fijo modificación. Para MASCOTA nos buscaing escaneos de alta resolución, establecer la tolerancia de masa precursor de 15 ppm y establecer la tolerancia de masa fragmento de 0,6 Da. Por último, establezca la proteína FDR al 1%.
6. Importe las búsquedas de la mascota de P. experimentos aeruginosa CCMS en Andamios (Proteomesoftware, Versión 3), establecen los parámetros para obtener una proteína FDR cercano al 1%, y extraer los recuentos espectrales totales.
7. Para que los resultados representativos presentan en este documento, se utilizó una prueba t pareada para comparar el experimento con el control de la competencia, y sólo se consideran golpes con un valor de p inferior a 0,1, y un índice de recuento espectral por encima del 2 (experimentar recuentos espectrales / espectral control de la competencia recuentos).
8. Los datos se pueden exportar en cualquier software de hoja de cálculo para su posterior análisis.

10. Cuantificación-Label gratis

1. Importe los archivos RAW en el software progénesis LC-MS (Dinámica no lineal, versión 4.0).
2. Realizar LC-MS alineación y detección de características en setti defectoNGS.
3. Exportación de los datos en formato mgf de progénesis LC-MS.
4. Buscar en los espectros MS / MS utilizando la mascota contra el NCBI P. base de datos que contiene aeruginosa hacia adelante y entradas de proteínas inversa señuelo.
5. Importe los resultados de búsqueda de base de datos en progénesis LC-MS y un mapa de los péptidos identificaciones a características MS1.
6. Para la evaluación de datos (cálculo de los niveles de significación, plegables cambio proporciones) se utilizó el guión ProteinSQAnalysis de SafeQuant (umbral: el valor q por debajo de 0,1, índice de recuento espectral superior a 2).

Resultados

Para identificar nuevos efectores c-di-GMP en P. aeruginosa se ​​utilizó sistemáticamente CCMS para analizar las fracciones solubles y de membrana de P. aeruginosa cepa PAO1 de un cultivo en fase log (OD ₆₀₀ = 0,5). Aquí resumimos y discutimos los resultados representativos de esta expedición de pesca. Se utilizaron cuatro réplicas biológicas independientes. Para cada experimento se utilizaron dos concentraciones CDG-CC diferentes (5 mM y 10 mM). Para investigar la especificidad, l...

Discusión

Especial cuidado se debe tomar en varias etapas del protocolo. La concentración de proteínas es un parámetro crítico con una concentración de 10 mg / ml siendo difícil de alcanzar cuando las células se cultivan bajo condiciones de crecimiento específicas (por ejemplo biofilms o pequeñas variantes de colonias). Por lo tanto, la resuspensión de pellets se debe realizar en un bajo volumen de tampón de lisis. Las concentraciones de proteína se pueden reducir a 8 mg / ml. En comparación con el método p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
caproBox	caprotec bioanalytics	1-5010-001 (220 V)	UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation
caproMag	caprotec bioanalytics	included in the CCMS Starter Kit	For easy handling of magnetic particles without pipetting
c-di-GMP caproKit	caprotec bioanalytics	upon request	The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer
Disposable PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01
12-tube PCR strips	Thermo Scientific	AB-1114
UIS250v sonicator with VialTweeter	Hielscher ultrasound technology	UIS250v and VialTweeter
Miniature French Pressure Cell	Thermo Electron Corporation	FA-003