La reconstitución de la degradación de β-catenina en<em&gt; Xenopus</em&gt; Extracto de Huevo

Resumen

Se describe un método para el análisis de la degradación de proteínas usando radiomarcado y proteínas de fusión luciferasa-en extracto de huevo de Xenopus y su adaptación para la selección de alto rendimiento para moduladores de moléculas pequeñas de la degradación de proteínas.

Resumen

Extracto de huevo de Xenopus laevis es un bien caracterizado, sistema robusto para el estudio de la bioquímica de los diversos procesos celulares. Extracto de huevo de Xenopus se ha utilizado para estudiar el recambio de proteínas en muchos contextos celulares, incluyendo el ciclo celular y las vías de transducción de señales ^1-3. En la presente memoria, se describe un método para el aislamiento de extracto de huevo de Xenopus que se ha optimizado para promover la degradación del componente de la ruta de Wnt crítico, β-catenina. Dos diferentes métodos se describen para evaluar la degradación de proteína β-catenina en el extracto de huevo Xenopus. Un método es visualmente informativo ^([35 S]-radiomarcado proteínas), mientras que el otro se escala más fácilmente para ensayos de alto rendimiento (proteínas de fusión de luciferasa de luciérnaga-etiquetados). Las técnicas descritas se pueden utilizar para, pero no se limitan a, evaluar β-catenina recambio de proteínas e identificar componentes moleculares que contribuyen a su volumen de negocios. Además, el Abildad para purificar grandes volúmenes de extracto de huevo de Xenopus homogénea combinada con la lectura cuantitativa y fácil de proteínas de luciferasa de etiquetado permite que este sistema sea adaptado fácilmente para la selección de alto rendimiento para moduladores de la degradación de β-catenina.

Introducción

Extracto de huevo Xenopus laevis se ha utilizado ampliamente para estudiar muchos procesos biológicos celulares, incluyendo la dinámica del citoesqueleto, ensamblaje nuclear y la importación, la apoptosis, el metabolismo de la ubiquitina, la progresión del ciclo celular, la transducción de señales, y el recambio proteico ^1-17. El sistema de extracto de huevo de Xenopus es susceptible al análisis bioquímico de una legión de procesos celulares debido extracto de huevo representa esencialmente citoplasma sin diluir que contiene todos los componentes citoplasmáticos esenciales necesarios para ejecutar estos procesos y permitir investigación. Grandes cantidades de extracto de huevo se pueden preparar de una sola vez para manipulaciones bioquímicas que requieren grandes cantidades de material (por ejemplo, la purificación de proteínas o cribado de alto rendimiento) ^18-20. Otra ventaja es que la concentración de proteínas específicas en extracto de huevo de Xenopus puede ajustarse con precisión mediante la adición de proteína y / o inmunodepleción de EndoG recombinanteproteínas genas en contraste con la transfección de ADN de plásmido en donde es difícil de controlar la expresión de la proteína de interés. Además, la falta de proteínas recombinantes disponibles puede ser superado por la adición de las transcripciones que codifican la proteína de interés, tomando ventaja de la alta capacidad de la recién preparada de Xenopus de extracto de huevo para traducir ARNm añadidas de forma exógena.

La regulación de la degradación de proteínas es crítica para el control de muchas vías celulares y procesa ^21. Extracto de huevo de Xenopus se ha utilizado ampliamente para estudiar la degradación de proteínas como el sistema permite múltiples formas de controlar el recambio de proteínas y sin influencias de confusión de la transcripción y la traducción. La vía de señalización de Wnt es una vía de señalización altamente conservadas que desempeña papeles críticos en el desarrollo y la enfermedad. El volumen de negocio de β-catenina, el principal efector de la vía Wnt, está muy regulada, y un aumento del estado de equilibrio lEvel de β-catenina es crítica para la activación de los genes diana de Wnt. La importancia de la degradación de β-catenina se pone de relieve por el hecho de que las mutaciones en la vía Wnt que inhiben la degradación de β-catenina encuentran en ~ 90% de todos los casos esporádicos de cáncer colorrectal ^22. degradación de β-catenina por componentes de la vía Wnt puede ser recapitulado fielmente en extracto de huevo Xenopus para estudiar el mecanismo de su volumen de negocios, así como para identificar nuevos moduladores de molécula pequeña de su degradación ^{2, 19, 20, 23-29.}

Los métodos para la preparación de extracto de huevo de Xenopus para estudiar el ciclo celular se han descrito en publicaciones anteriores JoVE ^30-32. El protocolo actual describe una modificación de estos métodos y está optimizado para la degradación de ^[35 S]-radiomarcado β-catenina y luciferasa-etiquetados β-catenina enExtracto de huevo Xenopus. El ensayo de degradación radiomarcado permite la visualización directa de los niveles de proteína a través de la autorradiografía. ^[35 S] metionina se incorpora en la proteína de interés usando una reacción de traducción in vitro que luego se puede añadir directamente a una reacción de degradación. Además, el ensayo de volumen de negocios proteína radiomarcada no requiere un anticuerpo contra la proteína de interés o una etiqueta de epítopo, que puede influir en la estabilidad de proteínas. Debido a que incluso pequeños cambios en los niveles de proteína, tal como se refleja en cambios en la intensidad de la banda de proteína radiomarcada, se visualizan fácilmente por autorradiografía, el ^[35 S]-radiomarcado ensayo de degradación representa un método muy útil para la visualización de rotación de proteínas ^2.

La fusión de β-catenina a luciferasa de luciérnaga (en adelante denominado simplemente "luciferasa") permite mediciones cuantitativas precisas y fáciles de los niveles de proteína, con el finpara determinar las propiedades cinéticas de rotación de β-catenina ^{19, 20.} Una ventaja importante de el ensayo de luciferasa es que proporciona un fuerte sistema cuantitativo que se puede escalar fácilmente hasta. El siguiente protocolo proporciona métodos simples para el ensayo de degradación de β-catenina y un método robusto, eficiente y eficaz para la selección de alto rendimiento de nuevos moduladores β-catenina.

Protocolo

1. Preparación de extracto de huevo de Xenopus

NOTA: Cada rana produce aproximadamente 1 ml de extracto de huevo utilizable. Extractos de 10 ranas se preparan típicamente en un tiempo, y el volumen de tampón se describe a continuación es para la realización de un 10 rana Xenopus extracto de huevo de preparación. El volumen de tampón puede ser ajustada en consecuencia para las preparaciones más grandes o más pequeñas de extracto de huevo. Preps generados de esta manera producen consistentemente concentraciones de proteína ≥ 50 mg / ml. El proceso de recolección de los huevos y su transformación en extracto es más eficaz cuando se realiza por dos personas. (Para conocer las técnicas básicas de cría de la rana, ver Sive et al. ^33).

1. Huevo Colección
   1. Para cebar las ranas, se inyectan cada rana femenina con 100 U de Pregnant Mare Serum gonadotropina (PMSG) de un recién hecho 250 U / ml de valores. Utilice una jeringa de tuberculina 3 ml con una aguja de calibre 27 para inyectar por vía subcutánea, con el bisel dela aguja hacia arriba, en el saco linfático dorsal, que se encuentra aproximadamente a 1 cm de la línea media de los cambios de color con muescas a lo largo de la longitud de las patas de la rana.
   2. Tienda ranas cebados en el agua (además de NaCl 20 mM, ver Sive et al. ³³⁾ a 18 ° C durante 5-10 días. Para sistemas de tanques de agua estancada, la densidad de animales es de aproximadamente 4 litros de agua por la rana hembra. NOTA: El tiempo mínimo requerido para el cebado surta efecto es de 5 días, y los efectos de priming desgaste después de 10 días.
   3. Preparar Modificado Ringers (MMR) solución 0.5x de Marc desde una MMR de stock 20x. 20x MMR consiste de cloruro de sodio 2 M, cloruro de potasio 40 mM, cloruro de calcio 40 mM, cloruro de magnesio 20 mM y 100 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico ácido (HEPES), pH 7,4.
   4. Configure cubos para todas las ranas inyectadas (una rana por 4 L cubeta). NOTA: Aunque más de una rana se puede colocar en la misma cubeta para la recolección de huevos, si una de las ranaspone huevos predominantemente de baja calidad, se requiere una cantidad sustancial de esfuerzo para separar los huevos de mala calidad de los que son adecuados para la fabricación de extracto. Por lo tanto, maximizar el número de ranas en el mismo tanque para minimizar la cantidad de búfer utilizado para el huevo recoge no vale la pena el riesgo.
   5. Inyectar 750 U gonadotropina coriónica humana (HCG) en el saco linfático dorsal de cada rana con una aguja 27 G como se describe en 1.1.1.
   6. Coloque cada una de las ranas de HCG-inyectado en cubos 4 L individuales que contienen MMR 0.5x enfría a 16 ° C.
   7. Coloque los recipientes con las ranas en una incubadora de 16 ° C para recoger los huevos O / N (15-16 h). NOTA: El mantenimiento de la temperatura adecuada es fundamental para todo el proceso, desde la recogida de los huevos para preparar el extracto de huevo.
2. Dejellying Huevos
   NOTA: Los huevos están cubiertos con una capa que debe ser eliminado antes de hacer extracto de jalea. La probabilidad de lisis espontánea de los huevos aumenta como el tiempo between la puesta de huevos y extraer los aumentos de preparación. Por lo tanto, es importante proceder a través de los siguientes pasos tan rápidamente como sea posible.
   1. Preparar 4 l de 1x MMR, 50 ml de 0,1 x MMR, y 400 ml de 2% de cisteína, pH 7,7, hecho en agua destilada. Mantener todas las soluciones a 16 ° C.
   2. Para expulsar huevos adicionales, apriete suavemente la espalda baja y el abdomen de la rana.
   3. Retire las ranas y el grueso de la MMR, a dejar los huevos en aproximadamente 1 a 200 ml de MMR en cada cubo.
   4. Retire los residuos con una pipeta de transferencia, y evaluar la calidad de los huevos: huevos de alta calidad están marcados generalmente por una clara separación entre el hemisferio animal de pigmentación oscura y el hemisferio vegetal de color claro y tienen el mayor contraste de oscuro a claro. Deseche con una pipeta de transferencia de los huevos que aparecen fibrosa, moteado o lisadas (blanco e hinchados), ya que se reducirá la calidad del extracto. Si> 10% de los huevos son de mala calidad, todo ellote debe ser desechada.
   5. Combine los huevos en un vaso de precipitados de vidrio de 500 ml y derramar tanta MMR posible, manteniendo los huevos sumergidos.
   6. Enjuague los huevos agitando suavemente con el doble de volumen del huevo de MMR. Repita dos veces, y eliminar los residuos o los huevos, obviamente, de baja calidad.
   7. Añadir aproximadamente 100 ml de 2% de cisteína al vaso de precipitados vaso, revuelva suavemente para mezclar y dejar los huevos se asienten durante 5 min a 16 ° C. Se retira la cisteína. NOTA: Dejellying está marcada por la aparición gradual de capas jalea flotantes por encima de los huevos y el embalaje más compacto de los huevos ya que ahora ocupan un volumen más pequeño y sin la capa de gelatina.
   8. Añadir otros 100 ml de 2% de cisteína, agite suavemente, espere 5 minutos, y luego verter lentamente la cisteína. Repita hasta que los huevos se han convertido en muy compacto (por lo general por el tercer tratamiento cisteína). Nota: Si los huevos se dejan demasiado tiempo en cisteína, que son propensos a la lisis. Del mismo modo, los huevos dejellied son frágiles y propensos a la lisis mecánica si sese arremolinaba con demasiada fuerza o si se exponen al aire. Una vez que los huevos han sido dejellied, es importante proceder rápidamente a las etapas de centrifugación.
   9. Vierta de cisteína, y enjuagar la capa de jalea y otros desechos lavando suavemente los huevos en 1x MMR. Vierta tampón cuidadosamente a lo largo del lado del vaso de precipitados. Repita dos veces o hasta que la solución MMR ya no está nublado. Al enjuagar con 1x MMR seguir para eliminar los huevos malos utilizando una pipeta de transferencia.
   10. Realizar un enjuague suave final con 30 ml de 0,1 x MMR, y verter suavemente la mayor cantidad de la memoria intermedia como sea posible. Una vez más, sacar las larvas obviamente malas.
3. Embalaje y Aplastamiento huevos por centrifugación
   NOTA: El extracto se describe a continuación que se utiliza para la degradación de β-catenina es una variante del extracto de factor de citostático (metafase II-detenidos). En contraste con el extracto de baja velocidad y alta velocidad que se utiliza para los estudios del ciclo celular, el extracto de velocidad intermedia que funciona mejor para la degradación de β-catenina. Yoextracto nterphase promueve igual de firme degradación β-catenina, aunque es más laborioso de preparar.
   1. Añadir leupeptina, pepstatina, mezcla de aprotinina (LPA, un inhibidor de la proteasa) en 10 g / ml (diluido a partir de una solución de 10 mg / ml en DMSO) y citocalasina D a 20 g / ml (diluido a partir de una solución madre de 10 mg / ml en DMSO) en los restantes 20 ml de 0,1 x MMR.
   2. Añade 0. X SPR con LPA y citocalasina D para los huevos lavados, agitar suavemente e incubar durante 5 minutos a 16 ° C.
   3. Transfiera los huevos en 16 ° C preenfriados 50 ml tubos de centrífuga, permita que los huevos se depositan, y eliminar el tampón residual de la parte superior. Para evitar la exposición al aire, retirar una pequeña cantidad de memoria intermedia en la pipeta de transferencia antes de retirar los huevos para la transferencia. Continuar para transferir los huevos adicionales en los tubos de centrífuga y eliminar el tampón residual de la parte superior del tubo hasta que los huevos llenar el tubo de centrífuga a la parte superior, que va a maximizar el rendimiento deextraer.
   4. Para empaquetar los huevos, tubos de centrífuga de centrifugado a 400 xg durante 60 segundos a 4 ° C usando un rotor de ángulo fijo. Eliminar el tampón residual de la parte superior de los tubos de centrífuga.
   5. Para el giro de trituración, girar los tubos a 15.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
4. Recogida de la Capa citoplásmica de Extracto
   NOTA: El método descrito a continuación difiere del método clásico de perforar el lado del tubo de centrífuga con el fin de recoger la capa citoplasmática. Este protocolo ha sido adaptado para la simplificación y para su uso con tubos de centrífuga particulares, que son reutilizables. No hay diferencias notables en la cinética de la degradación de β-catenina se encuentran con cualquiera de los métodos. En este extracto de punto deben mantenerse fríos durante todo el proceso, y todos los pasos deben realizarse a 4 ° C.
   1. Borrar de un agujero en la capa de lípidos utilizando puntas de pipeta P1000.
   2. Recoger la capa citoplasmática (entre la capa pigmentada oscura y la light capa lipídica) utilizando una nueva punta de pipeta P1000 en tubos de centrífuga previamente refrigerada limpias (Figura 1). Por extracto de alta calidad que degrada fuertemente β-catenina, minimizar la cantidad de capa pigmentada y de lípidos que se retira con la capa citoplasmática.
   3. Girar extrajo capa citoplasmática a 15.000 xg durante 10 min a 4 ° C y de nuevo recoger la capa citoplasmática. Repita el giro y la extracción 1X. NOTA: El extracto debe ser "de color paja." Si hay contaminación sustancial con las capas pigmentadas y de lípidos en este punto, se puede repetir el giro una vez más, a pesar de los giros excesivos pueden disminuir la capacidad del extracto de degradar β-catenina.
   4. Añadir LPA y citocalasina D para el extracto a concentraciones finales de 10 mg / ml cada uno. NOTA: Usando el método descrito produce una concentración bastante consistente de proteína total de aproximadamente 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3 preparaciones separadas) en Xenopus por ejemplo,extractos g.
   5. (Opcional) Para los ensayos de traducción, añadir cubiertas ARNm (0,1 mg / ml), ARNsin (1,5 U / ml), y la mezcla de regeneración de energía (2.2.1) y se incuba la reacción a temperatura ambiente durante 2 horas (para más información ver sálica et . al ² y Sive et al. ^33). Utilice extracto traducido de inmediato para los ensayos de degradación de β-catenina o snap-congelado en nitrógeno líquido para su uso posterior. NOTA: extracto recién preparado tiene una alta capacidad de traducir exógenamente añadido ARNm, pero, por desgracia, esta capacidad se pierde una vez que el extracto se congela. Capsulado ARNm se puede preparar fácilmente usando kits disponibles comercialmente.
   6. Extracto de Snap-congelación en nitrógeno líquido. NOTA: Los extractos se almacenan en pequeños (200 l) alícuotas de un solo uso, ya que pierden rápidamente su capacidad para degradar β-catenina si volver a congelar. Para el almacenamiento a largo plazo, el extracto puede ser almacenado en nitrógeno líquido. Para almacenamiento a corto plazo, extracto puede ser almacenado a -80 ° C, aunque la capacidad de Oextracto de f para degradar β-catenina se puede reducir dramáticamente con el almacenamiento prolongado a -80 ° C (más de 2 meses).

2. Preparación de extracto para Ensayo de Degradación de β-catenina

1. El agotamiento de Xenopus extracto
   NOTA: Una ventaja importante de extracto de Xenopus es la capacidad para agotar fácilmente componentes de una vía y añadir precisamente de nuevo una cantidad definida de una proteína con el fin de determinar sus efectos dependientes de la dosis.
   1. Utilice extracto de huevo Xenopus recién preparada o rápidamente descongelar el extracto y el lugar congelado en el hielo. Realice todas las manipulaciones en el frío.
   2. Añadir extracto a 1/10 el volumen de anticuerpo granulado o perlas de afinidad (por ejemplo, 20 ml de perlas sedimentadas a extracto de 200 ml). Con el fin de minimizar la dilución del extracto, retirar todo el líquido de las perlas como sea posible antes de la adición del extracto utilizando puntas de carga de gel con largos y puntas afiladas.
   3. Gire extracto-mezcla de microesferas a 4 º C durante 1 hora.
   4. Girar mezcla extracto-grano en 12.600 xg en microcentrífuga a 4 ° C durante 30 segundos. Alternativamente, si se utilizan perlas magnéticas, aplicar el campo magnético para recoger los granos.
   5. Transferencia agotado extracto a un tubo de microcentrífuga en hielo. Tenga cuidado de no transferir cuentas con el extracto.
   6. Confirmar eficiencia de agotamiento por inmunotransferencia tanto extracto empobrecido y los granos.
   7. Preparar el extracto para el ensayo de degradación de β-catenina como se describe en 2.2.
2. Optimización de Xenopus Extracto de la degradación de β-catenina
   NOTA: La degradación de β-catenina en el extracto de huevo Xenopus es un proceso dependiente de energía que agota rápidamente las reservas de ATP endógeno. En consecuencia, se requiere un sistema de regeneración de energía para mantener robusta degradación β-catenina.
   1. Preparar un 20x regeneración de energía (ER) de mezcla que consta de 150 mM de fosfato de creatina, ATP 20 mM, 600 mg / ml de la creatina fosfoquinasa,y 20 mM MgCl _2. ER debe dividió en alícuotas y se almacenó a -80 ° C. Evite los ciclos de congelación / descongelación repetidos utilizando pequeñas alícuotas congeladas.
   2. Descongelar rápidamente extracto de huevo Xenopus frotando el tubo congelado entre manos. Coloque el tubo en hielo justo antes de todo el extracto se ha derretido.
   3. Añadir 10 l de mezcla de regeneración de energía (20x ER) en una alícuota (200 l) de extracto de huevo Xenopus. Mezclar bien pulse rápido un tubo y el pulso vórtice. Pulso-spin y colocar inmediatamente en hielo.
   4. (Opcional) El volumen de negocios de β-catenina se puede mejorar ligeramente en extracto de huevo Xenopus mediante la adición de la ubiquitina (1,25 mg / ml final). La cicloheximida (final de 0,1 mg / ml) también se puede añadir para reducir al mínimo la traducción de los transcritos endógenos.
   5. Alícuota de los volúmenes adecuados para el ensayo de degradación en tubos de microcentrífuga pre-refrigerados en hielo. Para los ensayos de degradación de β-catenina radiomarcados, se retiran 2-5 ml extraer para cada momento.

3. Radiomarcados β-catenina ensayo de degradación en el extracto de huevo Xenopus

NOTA: Todos los pasos deben realizarse en el hielo a menos que se indique lo contrario.

1. Preparación radiomarcados β-catenina
   1. Preparar recién sintetizado in vitro ^[35 S]-metionina proteína radiomarcada utilizando kits disponibles comercialmente. NOTA: La generación ^35-S etiquetados (vida media de 87 días), las proteínas se producen fácilmente y eficientemente usando vitro acoplada kits de transcripción-traducción disponibles comercialmente en. Es importante que la proteína traducida está suficientemente marcado de tal manera que los cambios en el recambio de proteínas se pueden visualizar fácilmente.
   2. Para confirmar radiomarcaje éxito, realizar SDS-PAGE/autoradiography con 0,5 l de la proteína traducida. Cuantificar la intensidad de la banda de β-catenina radiomarcado utilizando ImageJ, ImageQuant, o un progr software cuantitativo alternativoam. NOTA: La banda de proteína β-catenina radiomarcado debe ser claramente visible en la película dentro de unas pocas horas (4-6 horas).
   3. Snap-congelar la proteína radiomarcada en nitrógeno líquido para el almacenamiento hasta su uso. Nota: El almacenamiento prolongado (> 2 meses) y múltiples de congelación / descongelación (mayor que 2) puede afectar gravemente a la capacidad de la radiomarcado β-catenina para degradar robustamente en extracto de huevo de Xenopus. Típicamente, la estabilidad de las proteínas radiomarcadas disminuye significativamente después de 1 mes de almacenamiento a -80 ° C; por lo tanto, radiomarcado β-catenina relativamente recién preparada da mejores resultados en estos ensayos de degradación.
2. Realización del ensayo Degradación β-catenina
   1. Añadir 1-3 l (dependiendo de la fuerza de la señal de banda radiomarcada) de β-catenina en traducida in vitro (y otras proteínas, moléculas pequeñas, etc que se están probando) en 20 l de mezcla de reacción de Xenopus en hielo. Mezcle bien con la quickly agitando el tubo y un pulso corto de vórtice; este es un paso importante como extracto de huevo Xenopus es muy viscosa y mezcla incompleta afectará la consistencia de los resultados. Giro de pulso y colocar en hielo.
   2. Inicie la β-catenina reacción de degradación al cambiar los tubos a temperatura ambiente.
   3. En el punto de tiempo designado, eliminar 1-5 ml de la muestra y mezclar inmediatamente con tampón de muestra SDS (volumen 5x) para detener la reacción. Para asegurarse de que la reacción de degradación está completamente terminado, el tubo de película varias veces y agitar vigorosamente.
   4. Realice SDS-PAGE/autoradiography. Ejecutar 1 ml equivalentes (~ 50 mg de proteína) del extracto para cada punto / carril. La degradación de β-catenina en el extracto de huevo Xenopus debe ser evidenciado por la disminución dependiente del tiempo en la intensidad del radiomarcado β-catenina banda de la Figura 2. Cuantificar los resultados utilizando ImageJ, ImageQuant, u otro software de imagen de elección en caso de necesidad.
   5. (Optional) Soak gel de SDS-poliacrilamida en solución de fijación (ácido acético al 10% y 30% de metanol en agua destilada) antes del secado para disminuir la radioactividad de fondo y aumentar la calidad de la imagen.

4. Β-catenina-Luciferase Assay Degradación en Xenopus extracto de huevo

Realice todos los pasos en el hielo a menos que se indique lo contrario.

1. Preparación de β-catenina-luciferasa
   1. Sintetizar no radiomarcado, luciferasa-etiquetados β-catenina usando el sistema acoplado de transcripción-traducción con la mezcla de aminoácidos completa.
   2. Confirmar la producción de la luciferasa-etiquetados β-catenina mediante la medición de la actividad de luciferasa 0,5 a 1 l de la reacción. Evaluar la luminiscencia de fondo mediante la medición de la luminiscencia a partir de una mezcla de reacción no traducida. NOTA: Los kits comerciales múltiples están disponibles para medir la actividad de la luciferasa. Luminiscencia de larga duración, sin embargo, funciona especialmente bien para la assa degradaciónY.
2. Realización del ensayo Degradación β-catenina-luciferasa
   1. Descongelar y preparar el extracto de huevo Xenopus como en 2.2.
   2. Añadir vitro-fusión traducido en β-catenina-luciferasa (de 4.1) en la mezcla de reacción Xenopus preparado (de 2,2) en hielo y mezclar bien como en 3.2.1. NOTA: La actividad de la luciferasa de β-catenina que se añade al extracto es típicamente entre 20 - 50.000 unidades relativas de luminiscencia (RLU) / ml de extracto de (sobre la base de las mediciones obtenidos a partir de 4.1.2). Señal de salida debe ser de aproximadamente 100.000 RLU (2-5 ml de la β-catenina-luciferasa de fusión en traducida in vitro).
   3. Cambie el extracto de RT para iniciar la reacción de degradación.
   4. Eliminar una parte alícuota de la reacción en el momento indicado y complemento de congelación en nitrógeno líquido. NOTA: muestras por triplicado se eliminan típicamente para el análisis para cada punto de tiempo. Extracto congelado se puede almacenar a -80 ° C untIL que están listos para ser analizado.
   5. Descongelar las muestras de hielo, las muestras de transferencia a placas de 96 pocillos blancos estándar en el hielo, y el proceso para la actividad luciferasa.

Resultados

Un esquema de la degradación de β-catenina en extracto de huevo de Xenopus se muestra en la Figura 2A. ³⁵ marcado con S β-catenina se incubó en extracto de huevo de Xenopus, partes alícuotas (1 ml extraer equivalente) se eliminaron en los momentos apropiados, y las muestras se sometieron a SDS-PAGE seguida de autorradiografía. la degradación de β-catenina por componentes de la vía de Wnt está mediada por el sistema de ubiquitina-proteasoma ^2, y la degrad...

Discusión

Extracto de huevo Xenopus es un sistema bioquímico sólida para la investigación de rotación β-catenina. La concentración de β-catenina en el extracto de huevo Xenopus es de ~ 25 nM ^2. En condiciones óptimas, el extracto de huevo es capaz de degradar β-catenina a una velocidad de 50-100 nM / h, y es mitad de la máxima a 200 nM ^24. Hay varios pasos críticos para la reconstitución exitosa de la degradación de β-catenina usando extracto de huevo Xenopus. Estos i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	ProSpec	hor-272-A	Reconstituted with distilled water before use.
Human chorionic gonadotropin	Sigma	CG10-10VL
Potassium chloride	Fisher	BP366-1
Sodium chloride	Research Products International	S23020-5000.0
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500
Calcium chloride	Acros Organics	AC42352-5000
HEPES	Fisher	BP310-1
Cysteine	Acros Organics	AC17360-1000
Leupeptin	Sigma	L2884-10MG
Aprotinin	Sigma	A1153-10MG
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG
Cytochalasin B	Sigma	C8273-10MG
3 ml syringe: Luer Lock tip	Becton Dickinson	309657
27 G needle	Becton Dickinson	305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed	Corning	3605
Steady-Glo luciferase assay system	Promega	E2520	Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system	Promega	L4600
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system	Promega	L3260	Generally higher yield than reticulocyte lysate
EasyTag Express protein labeling mix [S35]	Perkin Elmer	NEG772007MC
Creatine phosphate	Sigma	27920-5G
ATP	Sigma	A2383-5G
Creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system	Promega	E2920	Same storage conditions as Steady-Glo
50 ml Centrifuge tubes	Fisher Scientific	0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor	Thermo Scientific	28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge	Fisher Scientific	05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit	Ambion	AM1340
Anti-firefly luciferase antibody	Abcam	ab16466
Anti-GSK3 antibody	BD Transduction Laboratories	610201
FLUOStar Optima	BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus centrifuge	Thermo Scientific
16 °C Incubator	Percival Scientific