La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Resumen

Las interacciones entre las proteínas son fundamentales para todos los procesos celulares. El uso de bioluminiscencia de transferencia de energía de resonancia, la interacción entre un par de proteínas se puede controlar en células vivas y en tiempo real. Además, los efectos de las mutaciones potencialmente patógenos pueden ser evaluados.

Resumen

Los ensayos basados ​​en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) proporcionan un medio sensible y confiable para monitorear las interacciones proteína-proteína en las células vivas. BRET es la transferencia no radiativa de energía a partir de un "donante" de la enzima luciferasa a una proteína fluorescente aceptora. En la configuración más común de este ensayo, el donante es de la luciferasa de Renilla reniformis y el aceptor es proteína amarilla fluorescente (YFP). Debido a que la eficiencia de la transferencia de energía es fuertemente dependiente de la distancia, la observación del fenómeno BRET requiere que el donante y aceptor de estar en estrecha proximidad. Para la prueba de una interacción entre dos proteínas de interés en células de mamífero en cultivo, una proteína se expresa como una fusión con la luciferasa y la segunda como una fusión con YFP. Una interacción entre las dos proteínas de interés puede llevar el donador y el aceptor suficientemente cerca para que se produzca la transferencia de energía. En comparación con otras técnicas para la investigación de la proteína-proteína eninteracciones, el ensayo BRET es sensible, requiere poca práctica en el tiempo y unos reactivos, y es capaz de detectar interacciones que son débiles, transitorio o dependiente del entorno bioquímico encontrado dentro de una célula viva. Por lo tanto, es un enfoque ideal para la confirmación de las interacciones putativas sugeridas por estudios de proteómica de levadura de dos híbridos o espectrometría de masas, y además es muy adecuado para cartografiar regiones interactuar, evaluar el efecto de las modificaciones post-traduccionales en las interacciones proteína-proteína, y evaluar el impacto de las mutaciones identificadas en el ADN del paciente.

Introducción

Tanto vinculación clásica y de próxima generación análisis de secuenciación de trastornos humanos están revelando la relevancia clínica de las proteínas que participan en una variedad de procesos biológicos. A menudo es el caso que, antes de su identificación en tales estudios, ha habido poca o ninguna investigación del papel biológico de estas proteínas. Una vía fructífera para comenzar a explorar la función biológica de una proteína de interés es identificar qué otras proteínas interactúa con en su contexto fisiológico. Caracterización de las redes moleculares de esta manera proporciona información detallada sobre los procesos biológicos que subyacen al fenotipo humano.

La proyección a gran escala de uso más frecuente se acerca para la identificación de los compañeros de interacción candidatos para las proteínas de interés son la levadura de dos híbridos de ¹ y proteómica basada en la espectrometría de masas ^2. Estos métodos pueden ser muy exitosos en lo que sugiere que interactúan las proteínas potenciales, pero are vulnerable a resultados positivos falsos. Por lo tanto, la confirmación de una interacción identificado por levadura de la espectrometría de masas de dos híbridos o requiere la validación de la interacción utilizando una segunda técnica. Normalmente, un co-inmunoprecipitación o ensayo de pull-down se utiliza para este fin ^3. Una desventaja del uso de tales técnicas para la validación es el requisito para la lisis celular, que destruye las condiciones intracelulares que pueden ser esenciales para el mantenimiento de ciertas interacciones proteína. Una segunda desventaja es que las interacciones débiles o transitorios de proteína pueden ser interrumpidos durante los pasos de lavado. Además, estos ensayos exigen práctica en tiempo significativos, están limitados en el número de muestras que se pueden procesar de forma simultánea, y a menudo requieren la optimización de tiempo de los reactivos y protocolos.

Para superar algunos de los problemas asociados con experimentos de co-inmunoprecipitación, varios ensayos se han desarrollado sobre la base de fluorescente y bioluminescent proteínas que se pueden utilizar en células vivas. El primero de estos ensayos se basan en la fluorescencia (o Förster) Transferencia de energía de resonancia (FRET), la transferencia no radiante de energía entre dos proteínas fluorescentes con la superposición de espectros de emisión y de excitación ^4. La eficiencia de la transferencia de energía es fuertemente dependiente de la distancia, por lo tanto, la observación del fenómeno de FRET requiere que los fluoróforos donador y aceptor estar en estrecha proximidad. Para la prueba de una interacción entre dos proteínas de interés, una proteína se expresa como una fusión con el fluoróforo donante (proteína fluorescente cian comúnmente; PPC) y el segundo como una fusión con el fluoróforo aceptor (proteína fluorescente amarilla comúnmente; YFP). Una interacción entre las dos proteínas de interés puede llevar a los donantes y aceptor fluoróforos suficientemente próximos para que se produzca la transferencia de energía, lo que resultará en un aumento mensurable en la emisión de luz desde el aceptor YFP en relación con el donante de la PPC. FRET ha tenido éxito en la detección de interacciones proteína-proteína en células vivas ^4. El principal inconveniente del uso de FRET para la detección de interacciones proteína-proteína es el requisito para la iluminación externa para la excitación del fluoróforo donante. Resultados de la iluminación interior en gran fondo en la señal de emisión, excitación no deseada del aceptante, y fotoblanqueo del donante y aceptor fluoróforos. Estos efectos reducen la sensibilidad del ensayo para la detección de interacciones proteína-proteína.

Una modificación del ensayo de FRET, que supera el problema de alto fondo de la iluminación externa es la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) ^5,6 ensayo. En el sistema de BRET el fluoróforo donante se sustituye por una enzima luciferasa. Así, la energía para la excitación del fluoróforo aceptor se genera dentro del sistema por la oxidación de un sustrato de luciferasa, lo que hace innecesaria la iluminación externa. En el másconfiguración común de este ensayo, el donante es luciferasa de Renilla reniformis y el aceptor es YFP (para una discusión de la alternativa de donantes y aceptores de proteínas ver Pfleger et al. ^5). De acuerdo con ello, en este sistema, una proteína de interés se fusiona con una proteína luciferasa y potencialmente interactuar a YFP, o viceversa. El ensayo BRET requiere la adición de coelenterazina como sustrato para la luciferasa. Debido a que la coelenterazina es permeable a las células, es posible llevar a cabo ensayos de BRET en células vivas. Sin embargo, coelenterazina nativa es inestable en solución acuosa, y el desglose-enzima independiente de coelenterazina tanto reduce la concentración de sustrato disponible para el ensayo y genera autoluminiscencia, lo que reduce la sensibilidad de las mediciones de la actividad de luciferasa. El uso de BRET en células vivas ha sido facilitado por el desarrollo de coelenterazines protegidas, que son estables en solución acuosa, pero se escinden por esterasas citosólicass después de la difusión a través de la membrana de la célula para generar coelenterazina activo dentro de la célula ^7.

Después de la adición de sustrato a las células que expresan luciferasa y las proteínas de fusión-YFP, la transferencia de energía resultante de las interacciones proteína-proteína se cuantificó mediante el control de la emisión de la luciferasa y YFP. Debido a las interacciones de proteínas se pueden monitorizar directamente en células vivas en placas de múltiples pocillos, el ensayo BRET constituye un método simple y escalable para la validación de las interacciones putativo que es el costo y eficiente en el tiempo.

Además de validar interactores putativos identificados en estudios de cribado proteómicos, el sistema de BRET también se puede utilizar para candidatos a elementos interactuantes prueba de derivados de estudios bioquímicos y estructurales previas sobre la proteína de interés. Una vez que la existencia de una interacción proteína-proteína se ha establecido (ya sea usando el ensayo BRET o por otras técnicas), existe un potencial para el ensayo BRET para ser EMPLoyed más para caracterizar la interacción. Por ejemplo, las regiones que interactúan se pueden asignar mediante la generación de versiones truncadas de las proteínas, y la participación de residuos específicos en la interacción se puede demostrar mediante la creación de mutaciones puntuales. Además, el efecto modulador de modificaciones postraduccionales o pequeñas moléculas (tales como fármacos o ligandos) sobre las interacciones proteína-proteína puede ser investigado ^8-10.

El ensayo BRET también tiene un gran potencial para la investigación de mutaciones identificadas en el ADN del paciente. En los casos en que se ha establecido un papel causal para una mutación, estudiar el efecto de la mutación en las interacciones proteína-proteína utilizando BRET puede revelar más acerca de la etiología molecular de la fenotipo ^11. Desde el advenimiento de las metodologías de secuenciación de próxima generación, cada vez es más común para varias mutaciones potencialmente dañinos que se identifiquen dentro de un individuo, en cuyo caso no está claro cuáles son releVant para el fenotipo ^12. En esta situación el ensayo BRET puede ser valiosa en la evaluación del impacto de las mutaciones en la función de las proteínas y, por tanto, su importancia para el trastorno.

Protocolo

1. Creación de plásmidos

1. Subclonar el ADNc para cada proteína de interés en ambos los vectores pluc y pYFP, ​​utilizando técnicas estándar de biología molecular (Figura 1). Para ver protocolos detallados Green et al ^13.
2. Secuencia de todos los constructos para verificar que las proteínas de interés están en marco con la secuencia de Luc / YFP sin codones de parada intermedios.
3. Realizar ensayos funcionales como se desee para confirmar que las proteínas de fusión conservan su actividad biológica. En el caso que aquí se presenta la localización subcelular de las proteínas de fusión YFP se determinó por microscopía de fluorescencia.
4. Hacer plásmidos de expresión de las proteínas de control apropiadas Luc y YFP mediante el diseño de las señales de orientación pertinentes en los vectores de expresión pLUC y pYFP. En el caso que aquí se presenta, generar constructos Luc y YFP-nucleares dirigida por la inserción de una señal de localización nuclear en los vectores pLUC y pYFP.
5. Haceruna construcción de control positivo en el que Luc y YFP se funden en un único polipéptido. En el caso que aquí se presenta, generar un control positivo en el que se inserta la secuencia de codificación de YFP en el vector pLuc.
6. Seleccionar un plásmido de relleno neutro para ser utilizado para igualar la masa de ADN en las mezclas de transfección. Utilice un plásmido que no tiene promotor eucariota y por lo tanto será transcripcionalmente inactivo en células de mamífero, tales como un vector de clonación bacteriana.

2. Preparación de ADN Mezclas

1. Estimar la concentración de todos los plásmidos descritos en la Sección 1 basado en la absorbancia a 260 nm (1 unidad de absorbancia es equivalente a 50 g / ml de ADN). Determinar la masa molecular de cada plásmido de multiplicar el número de pares de bases por 650 Da. Utilice la concentración y masa molecular para calcular la concentración molar de cada preparación de plásmido. Diluir las preparaciones de ADN de plásmido a una concentración de 36 nM. Estas serán las reservas de trabajoque se usan para preparar las mezclas de ADN para la transfección.
2. Preparar una mezcla de ADN de control que contiene 1.800 ng de plásmido de relleno en un volumen final de 20 l de agua.
3. Prepare una mezcla de ADN de control que contiene 5 l de la construcción-el control pLuc. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.
4. Preparar una mezcla de ADN de control que contiene 5 l de constructo de control de pLuc y 5 l de constructo de control de pYFP. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.
5. Prepare una mezcla de ADN de control que contiene 5 l de construcción de control positivo. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.
6. Prepare el siguiente ADN se mezcla para la prueba de homodimerización de una proteína de interés, X. Para cada mezcla de ADN combinar 5 l de la pLuc relevante construir y 5 l de la pYFP construir. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.
   A)-Control pLuc y pYFP-X
   B) pLuc-X y control pYFP
   C) pLuc-X y X-pYFP
7. Prepare el siguiente ADN se mezcla para la prueba de una interacción entre un par de proteínas de interés, X e Y. Para cada mezcla de ADN se combinan 5 l de la pLuc relevante construir y 5 l de la pYFP construyen. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.
   A)-Control pLuc y pYFP-X
   B) pLuc-X y control pYFP
   C) de control de pLuc y pYFP-Y
   D) pLuc-Y y-control de pYFP
   E) pLuc-X e-Y pYFP
   F) pLuc-Y y pYFP-X

3. Transfección

1. Harvest Subconfluent células HEK293 de un frasco de 75 ^cm2. Diluir 10% del total de células en 13 ml de medio de cultivo. Dispensar 130 l de suspensión celular en cada pocillo de un blancofondo transparente de 96 pocillos placa de cultivo de tejidos. Cultivar las células durante 24 horas.
2. Calcular el número de pozos a ser transfectadas multiplicando el número de mezclas de ADN por 3. Traer medio de cultivo libre de suero a temperatura ambiente. Preparar una mezcla maestra que contiene 6,3 l de medio libre de suero y 0,18 l de reactivo de transfección por pocillo. Mezclar por agitación e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
3. Preparar las mezclas de transfección mediante la adición de 2 l de mezcla de ADN a 20 l de medio / transfección mezcla maestra reactivo libre de suero. No vórtice. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
4. Transfectar tres pozos con cada mezcla de transfección dispensar 6,5 l de mezcla de transfección por pocillo. Cultivar las células de un 36 a 48 horas más.

4. Medición de la señal BRET

1. Disolver sustrato de luciferasa de células vivas a 34 mg / ml en DMSO por vórtex.
2. Diluir sustrato de luciferasa de células vivas reconstituido a 1:1.000 en sustrato dilución medio pre-calentado a 37 ° C. Permitir 50 l de medio de dilución de sustrato por pocillo. Vortex para mezclar. Puede formarse un precipitado, pero no va a interferir con el ensayo.
3. Aspirar el medio de cultivo de la placa de 96 pocillos. Dispensar 50 l de sustrato de luciferasa de células vivas diluido en cada pocillo. Células de cultivo durante al menos 2 horas (hasta 24 horas).
4. Retire la tapa de la placa de 96 pocillos y se incuba la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente en el interior del luminómetro.
5. Medida de emisión de Luc y YFP un pozo a la vez. Medida de emisión de Luc usando un filtro de bloqueo de longitudes de onda más larga que 470 nm. Medida de emisión de YFP utilizando un filtro de paso de banda de 500-600 nm. Integrar las señales de emisión durante 10 s.

5. Análisis de Datos

1. Promedio de las lecturas de emisión Luc de los 3 pocillos que recibieron sólo el plásmido de relleno. Reste este valor de todas las otras lecturas de emisiones Luc para producir los valores de emisión de Luc fondo-resta.
2. Promedio de las lecturas de emisión de YFP de los 3 pocillos que recibieron sólo el plásmido de relleno. Reste este valor de todas las otras lecturas de emisiones YFP para producir los valores YFP emisión de fondo-resta.
3. Para cada pocillo, se divide el YFP valor de fondo-resta la emisión por el valor Luc fondo-resta de emisión para dar la relación de BRET sin corregir.
4. La media de los coeficientes de BRET no corregidas de los tres pozos que fueron transfectadas con sólo el plásmido de control pLuc. Restar este valor de todas las otras relaciones de BRET no corregidos para dar las proporciones de BRET corregidos.
5. Para cada uno de los restantes conjuntos de relaciones de BRET corregidos, el promedio de los valores de los tres pozos transfectadas para obtener una relación BRET final.

Resultados

El principio del ensayo BRET se ilustra en la Figura 2. La configuración de ensayo utilizado a través de los experimentos presentados aquí se representa en la figura 3. La detección de una señal BRET fuerte a partir de células transfectadas con una proteína de fusión luciferasa-YFP confirmó que la transferencia de energía era observable en este montaje experimental (Figura 4).

Nuestra investigación se centra en el papel de la fami...

Discusión

El diseño de las construcciones de expresión de la proteína de fusión es un paso fundamental en la creación del ensayo BRET. En los experimentos presentados aquí, las proteínas de interés se fusionan con el extremo C-terminal de la luciferasa o YFP. También es posible, y puede ser necesario, para fusionar proteínas a la N-terminal de luciferasa / YFP. Para algunas proteínas, las fusiones sólo podrán aceptarse en el extremo N-o C-terminal con el fin de evitar la interrupción de la estructura y función de p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.