Una Plataforma Novela Estiramiento para Aplicaciones en Celular y Tisular Mecanobiología

Resumen

Se presenta en este artículo una plataforma novela de estiramiento que se puede utilizar para investigar las respuestas de células individuales a complejo deformación mecánica biaxial anisotrópico y cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos.

Resumen

Las herramientas que permiten la aplicación de fuerzas mecánicas a las células y tejidos o que pueden cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos han contribuido de manera espectacular a la comprensión de mecanobiología básica. Estas técnicas se han utilizado ampliamente para demostrar cómo el inicio y la progresión de diversas enfermedades están muy influenciados por las señales mecánicas. Este artículo presenta un estiramiento biaxial (BAXS) plataforma multifuncional que puede estimular mecánicamente las células individuales o cuantificar la rigidez mecánica de los tejidos. La plataforma BAXS consta de cuatro motores de bobina de voz que pueden ser controlados de forma independiente. Única células pueden ser cultivadas en un sustrato flexible que se puede acoplar a los motores que permiten una para exponer las células a campos de tensiones complejas, dinámicas y espacialmente variables. Por el contrario, mediante la incorporación de una célula de carga de fuerza, se puede cuantificar también las propiedades mecánicas de los tejidos primarios como los que están expuestos a los ciclos de deformación.En ambos casos, un conjunto adecuado de abrazaderas debe ser diseñado y montado en los motores de la plataforma BAXS con el fin de sostener firmemente el sustrato flexible o el tejido de interés. La plataforma BAXS se puede montar en un microscopio invertido para llevar a cabo simultánea luz transmitida y / o imágenes de fluorescencia para examinar la respuesta estructural o bioquímica de la muestra durante los experimentos de estiramiento. Este artículo proporciona detalles experimentales del diseño y el uso de la plataforma BAXS y presenta los resultados de una sola célula y estudios de todo el tejido. La plataforma BAXS se utilizó para medir la deformación de los núcleos en células individuales de mioblastos de ratón en respuesta al sustrato cepa y para medir la rigidez de las aortas aisladas de ratón. La plataforma BAXS es ​​una herramienta versátil que se puede combinar con diversos microscopías óptica con el fin de proporcionar nuevos conocimientos mecanobiológicos en los niveles de tejido sub-celulares, celular y conjunto.

Introducción

El microambiente mecánica juega un papel importante en muchas funciones celulares tales como proliferación, migración, y diferenciación, que tienen un impacto profundo en el desarrollo y la homeostasis de los tejidos y también en enfermedades ^1-6. A través de los años, una multitud de herramientas experimentales se han utilizado para estimular mecánicamente las células o tejidos y medir las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos con el objetivo de aumentar la comprensión de mecanobiología básica y el estudio de la aparición y progresión de enfermedades ^{de 6-17.} Sin embargo, hay que a menudo se basan en varios dispositivos experimentales diferentes con el fin de lograr los objetivos de un estudio en particular. En este artículo se presenta un solo biaxial plataforma, multi-funcional, que se extiende (BAXS) que permite que los estudios que investigan el papel que las propiedades mecánicas y las fuerzas mecánicas juegan en biología en la sub-celular a escalas de longitud tejido enteros. La plataforma BAXS no sólo permite la quantification de las propiedades mecánicas de los tejidos aislados, sino que también facilita la capacidad de aplicar campos de deformación simples, complejos, y dinámicas a las células vivas a fin de comprender sus respuestas al estiramiento que se produce in vivo. La plataforma BAXS también mantiene la capacidad de realizar la microscopía de células vivas durante las pruebas mecánicas y perturbaciones en las células y tejidos.

La plataforma BAXS es un aparato construido a la medida que se puede utilizar para investigar el efecto de la deformación del sustrato a nivel celular y realizar ensayos de tracción sobre los tejidos biológicos (Figura 1A). Un calentador de aluminio se fabricó para dar cabida a un plato estándar de 10 cm de Petri y mantener las soluciones fisiológicas a 37 ° C usando un controlador de temperatura y calentadores de Kapton (Figura 1B). Esta plataforma BAXS se puede integrar en un contraste de fase invertida y / o un microscopio de fluorescencia y permite la formación de imágenes simultánea (Figura 1C).En breve, la plataforma BAXS consta de cuatro motores de bobina de voz lineales de los cuales las partes móviles están montados en miniatura de bolas de movimiento lineal diapositivas del rodamiento orientadas a lo largo de dos ejes perpendiculares (Figura 1D). Una etapa de posicionamiento lineal está montado en cada uno de los cuatro motores para permitir el movimiento vertical del sistema de sujeción que se utilizará (Figura 1E). La posición de cada motor se controla mediante un codificador óptico con una resolución de 500 nm (Figura 1F). Los cuatro motores son controlados de manera independiente con un controlador de movimiento que emplea realimentación del codificador óptico para comandos de movimiento (Figura 1G) de ejecutar. Una interfaz de LabVIEW proporciona un control total sobre la magnitud de desplazamiento, velocidad y aceleración de cada motor con el fin de generar la deformación completamente personalizable, estático y dinámico, de las células o muestras de tejido.

La técnica utilizada para inducir una deformación en las células se consigue simplemente allowing de células se adhieran firmemente a un sustrato flexible y transparente y luego se extiende este sustrato utilizando los cuatro motores de la plataforma BAXS. La plataforma BAXS permite el montaje de cualquier conjunto de diseño personalizado de pinzas para sujetar el sustrato en los motores de bobina de voz. Para este fin, se diseñó un conjunto de abrazaderas a la que un sustrato flexible y transparente, hecha de polidimetilsiloxano (PDMS), puede ser conectado al mismo (Figuras 2A-C y la Figura 3). Como las abrazaderas estarán expuestos a soluciones fisiológicas, todas las partes se mecanizan a partir de acero inoxidable para permitir la esterilización. Estas abrazaderas han sido cuidadosamente diseñados para llevar el sustrato lo más cerca posible al objetivo del microscopio para mejorar la calidad de imagen al tiempo que minimiza la presión sobre el sustrato durante el estiramiento (Figura 2D).

La misma plataforma BAXS también se puede utilizar para cuantificar la rigidez de pequeñas muestras de tejido, utilizando un conjunto adecuado de abrazaderas con ADAPTed soportes para las muestras de tejido y una célula de carga para monitorizar fuerzas. Varios enfoques pueden ser tomados para montar un tejido a los motores de la plataforma BAXS; en este caso los minutiens de insectos de acero inoxidable pines pueden conectar a través de la apertura de los tejidos vasculares con el fin de realizar ensayos de tracción (Figuras 4A-B). Alternativamente, para tejidos gruesos sin una abertura natural, bordes de tejido puede ser celebrada en su posición con las abrazaderas unidas a los motores de bobina de voz o pegados a las pequeñas placas de vidrio con pegamento biológico y unidos a los motores con las abrazaderas. Con el fin de realizar las pruebas de tracción se requiere una célula de carga en miniatura y se puede incorporar fácilmente en los motores de la plataforma BAXS y se utiliza para medir la fuerza que actúa sobre el tejido durante un ciclo de estiramiento (Figura 4C). Como la plataforma BAXS se compone de cuatro motores, la introducción de una segunda célula de carga permite a uno realizar ensayos de tracción a lo largo de dos direcciones ortogonales. Esta capacidad permite a uno quantify la rigidez mecánica de un solo tejido a lo largo de dos direcciones perpendiculares durante el mismo experimento.

Es importante destacar que, en todas las configuraciones, las células o muestras de tejido de interés se mantienen siempre en un baño de temperatura controlada que es accesible para el usuario. Esta capacidad permite la introducción de agentes farmacológicos durante el estiramiento de la muestra con el fin de examinar la respuesta temporal de la muestra. Además, como el eje óptico del microscopio invertido permanece sin obstrucciones, todas las formas de microscopía están todavía disponibles para el usuario. Por último, como todos los cuatro motores de la plataforma BAXS son independientes, es posible aplicar campos de deformación altamente configurables para la muestra de interés. In vivo células y tejidos están expuestos a complejo y anisotrópico de estiramiento que puede ser imitado más apropiadamente en esta plataforma en oposición al tradicional estirado uniaxial ^{7,13,15,18,19} plataforma. Además, las características físicasdel campo de deformación se puede cambiar sobre la marcha durante un experimento. Estas capacidades permiten al usuario examinar la respuesta celular y el nivel de tejido a una amplia serie de altamente complejo, anisotrópico, temporalmente, y campos de deformación espacialmente diferentes. En este artículo se describen las ventajas y limitaciones de la plataforma BAXS así como su diseño, principios de funcionamiento, y los detalles experimentales para una sola célula y los experimentos de todo el tejido.

Figura 1. Visión general de la plataforma BAXS. A) Vista superior de la plataforma BAXS mostrando los cuatro motores de bobina de voz. B) Cuadro detallado del calentador de placa de Petri se utiliza para mantener las células y los tejidos a 37 º C. C) La plataforma se puede montar en un microscopio invertido para tocar en vivo- imágenes de células durante los experimentos de estiramiento.D) Cuadro detallado del motor de bobina de voz; la parte móvil de la plataforma. E) Cuadro detallado de la etapa de posicionamiento lineal que permite el desplazamiento vertical de los sistemas de sujeción. F) Cuadro detallado del codificador óptico que proporciona la posición en tiempo real del motor para el controlador de movimiento. G) Cuadro detallado del controlador de movimiento que muestra las cuatro entradas de encoder ópticos y salidas de potencia a los cuatro motores de bobina de voz.

Figura 2. Sistema de sujeción para los experimentos de células de estiramiento. AB) imágenes que muestran los detalles de las abrazaderas utilizadas para unir el sustrato de PDMS a los motores de bobina de voz para el estiramiento. C) El sustrato se envuelve alrededor de la parte cilíndrica de la abrazadera con su Featur anclajees que se sienta en la ranura en la parte superior. A continuación, el sustrato se fija con los tornillos que empujan el sustrato / anclaje características en la ranura superior. D) Ilustración de la plataforma BAXS con las abrazaderas que sostiene el sustrato en su lugar. El recuadro muestra una vista detallada del sustrato con las células unidas a él sentado justo por encima de una hoja de cubierta y el objetivo del microscopio.

Figura 3. Lista de materiales de la membrana y su sistema de sujeción. Dibujos que muestran las dimensiones de las partes principales integrados a la plataforma de dos ejes para llevar a cabo experimentos de células de estiramiento.

Figura 4. Explo de un sistema de sujeción para la evaluación de la rigidez de los vasos de pequeño calibre. AB) imágenes detalladas del sistema de sujeción se utiliza para inducir la deformación en un 1 mm de diámetro de la aorta del ratón. Pasadores de acero inoxidable fueron cuidadosamente en forma en triángulos abiertos para permitir que el buque se deslice en ambas clavijas. C) Ilustración de la plataforma BAXS con las abrazaderas de la celebración de la embarcación y una célula de carga conectada entre el motor fijo y la pinza izquierda. El recuadro muestra una vista superior detallada del buque montado en las patillas.

Protocolo

1. Deformación mecánica de las células individuales

1. La fabricación de un sustrato PDMS con bolas fluorescentes incrustados
   Antes de la fabricación del sustrato, microesferas fluorescentes en solución de agua se vuelven a suspender en isopropanol para mejorar la mezcla del grano en el PDMS debido a su naturaleza hidrofóbica.
   1. Pipetear 500 l de microesferas fluorescentes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 16.200 xg durante 10 min.
   2. Desechar el sobrenadante y añadir 500 l de isopropanol siguieron con 5 min de vórtice. Ponga el vial a un lado toda la noche en la oscuridad con el fin de permitir que cualquier partícula grande de agregados al sedimento.
   3. A la mañana siguiente, retire con cuidado el sobrenadante a un vial de microcentrífuga limpio. Esta solución de bolas se puede utilizar para fabricar más de 5 sustratos. NOTA: La solución del grano seguirá sedimentar durante los próximos 3 días. Tenga cuidado de evitar resuspensión del sedimento.
   4. Vierta 0,5 g del agente de curado proporcionadocon el kit de PDMS en un vial de microcentrífuga de 1,5 ml usando un equilibrio científica. Por etapas sucesivas, añadir un total de 90 l de bolas (seis en 15 mu l adiciones), vortex durante 1 min entre cada adición. Ponga a un lado.
   5. Pesar 10 g de PDMS y se mezcla durante al menos 12 min con la 0,5 g del agente de curado suplementado con perlas fluorescentes.
   6. Fabrique un molde en forma de cruz SU-8 2050 usando técnicas de fotolitografía estándar siguiendo las instrucciones del fabricante. El molde utilizado tiene una altura de 320 micras y un área de 13,4 cm ² (Figura 3). El molde puede contener 428 l ó 440 mg de PDMS.
   7. Vierta 400 mg de los PDMS con cuentas en el molde en forma de cruz con una pipeta de transferencia y curar durante 2 horas a 80 ° C. Después del curado, retire el sustrato del molde (Figura 5). El sustrato se puede mantener en una placa de Petri a temperatura ambiente durante 2 semanas sin mostrar cambios significativos en sus propiedades mecánicas.
   8. Vierta gotitas de PDMS (agente de curado: PDMS con una relación de 01:20) en una placa de Petri con un tamaño final de aproximadamente 4 mm de diámetro y curar boca abajo durante 2 horas a 80 ° C (Figura 5B). Estas características de anclaje se pueden mantener en una placa de Petri para la semana. NOTA: Mantener el plato boca abajo para evitar que las gotas de aplanamiento durante el proceso de curado.
   9. Tratamiento de aire de plasma (30 seg a 30 W) el sustrato y 8 funciones de anclaje. Enlazar las características en cada extremo del sustrato a una distancia de 4 mm del guión de forma cuadrada presentes en el sustrato (Figura 5C).
2. Montaje de la membrana de las abrazaderas
   1. Envuelva cada extremo del sustrato alrededor de la parte cilíndrica ranurada de las abrazaderas y seguro en su lugar con los tornillos de fijación 2 de la parte superior (Figura 2B y las figuras 5D-E).
   2. Atornille las 4 abrazaderas en el soporte de sujeción y vierta PDMS (relación 01:20) usando un t desechableRANSFERENCIA pipeta en la interfase entre el sustrato y la parte cilíndrica ranurada de las abrazaderas. Corre el PDMS sin curar alrededor de la parte cilíndrica ranurada utilizando una llave hexagonal de 1,5 mm.
   3. Vierta PDMS (1:20) en las ranuras hasta que esté completamente llena por acción capilar y curar el conjunto a 80 ° C durante 2 horas (Figura 5F).
3. La siembra de células en la membrana
   1. Tratamiento de aire-plasma (30 segundos a 30 W) todo el conjunto para esterilizar y funcionalizar el sustrato para permitir que para el revestimiento de colágeno.
   2. Funcionalizar el área del sustrato donde las células se sembraron con 1 ml de ácido acético 0,02 M suplementado con 16 g / ml de colágeno de cola de rata a temperatura ambiente durante 1 h. La densidad de colágeno final deseado es 5 g / cm ^2.
   3. Enjuagar el sustrato 3x con tampón fosfato y dejar secar a temperatura ambiente por lo menos durante 10 minutos.
   4. Añadir 40 l de medio de cultivo suplementado con 10% Seru bovino fetalm y 1% de penicilina-estreptomicina que contenía 2000 células en la porción central del sustrato para cubrir un área de 1 cm ² (densidad de células: 20 células / mm ^2). La densidad celular puede ser alterado de acuerdo con los requisitos experimentales.
   5. Ponga todo el conjunto en una incubadora de cultivo celular estándar con el sustrato hacia arriba con la gota de medio de cultivo que contiene las células en ella. NOTA: El montaje se debe mantener con el sustrato hacia arriba durante al menos 3 horas para permitir que las células se unan firmemente ella. Para evitar la evaporación, 30 l de medio de cultivo caliente se añade en la gota sobre el sustrato cada 45 min durante 3 horas.
   6. Después de 3 h, dar la vuelta todo el conjunto en una placa de Petri llena de medio de cultivo fresco para sumergir el sustrato y se incuba durante la noche para permitir que las células proliferen.
   7. El día siguiente, preparar la solución salina tamponada con HEPES (HBSS; 20 mM de Hepes, 120 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl, 0,8 mM de _MgSO4, 1,8 mM de _CaCl2, y 11,1 mM de dextrose). Ajustar el pH a 7,4. NOTA: La solución HBSS tiene que estar preparado todos los días y se mantiene a 37 ° C durante los experimentos. Esta solución fisiológica se utiliza para mantener las células en la platina del microscopio mediante la imitación de las condiciones del tejido / normal de la sangre.
   8. Monte la puesta a punto de contraste de fase invertida o un microscopio fluorescente Monte el conjunto de la abrazadera del sustrato en la plataforma y motores BAXS. Llene la caja de Petri en el interior del calentador de placa de Petri con tampón HEPES (Figura 2D).

2. Rigidez medición de los buques de pequeño calibre

1. Preparación
   1. Krebs solución fisiológica: Prepare una solución de NaCl 118,1 mM, 11,1 mM D-glucosa, 25 mM NaHCO _3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO _4, 1,2 mM KH ₂ PO ₄ y 2,5 mM CaCl _2. Ajustar el pH a 7,4 y oxigenar la solución con gas médico carbógeno (95% O _2/5% CO ₂₎ durante 30 min. NOTA: El soluti Krebsel tiene que estar preparado todos los días y se mantiene a 37 ° C durante los experimentos. Esta solución fisiológica se utiliza para mantener los tejidos vivos al imitar las condiciones del tejido / sangre normal.
   2. Reúna la instrumentación para la disección y la evaluación mecánica de los vasos aórticos: tijeras quirúrgicas, pinzas dobladas, micro-tijeras, microscopio de disección quirúrgica, 50 ml tubos de centrífuga de polipropileno y 10 ml pipetas serológicas. El procedimiento quirúrgico y el experimento no requiere condiciones estériles. Montar las abrazaderas de la plataforma BAXS junto con la célula de carga de antemano.
2. Aislamiento de tejido y disección
   Todos los procedimientos experimentales con animales de laboratorio tienen que ser aprobados por el Comité de los usuarios de Cuidado de Animales y Uso 'institución, que cumple con la Guía de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los usuarios' país.
   1. Lleve a cabo la eutanasia de ratón con la inhalación de 99% de CO ₂ (7 psi)en una cámara de Plexiglas (Figura 6A).
   2. Abdomen abierto ratón y cortar la aorta torácica a sangrar el ratón.
   3. Retire el diafragma, la caja torácica y los lóbulos pulmonares (Figura 6B). NOTA: Para reducir al mínimo el riesgo de dañar el tejido, mantener el corazón conectado a la aorta y evitar tocar el recipiente directamente, sino manipularla usando el corazón.
   4. Quite el corazón, la raíz aórtica y de la aorta torácica cortando suavemente entre el buque y la columna vertebral. NOTA: No provocar ningún alargamiento en el recipiente durante la escisión de mantener la estructura interna del tejido intacto (Figura 6C).
   5. Inmediatamente sumerja y mantener el corazón y la aorta en solución de Krebs.
   6. Cortar y lavar cuidadosamente la aorta en solución de Krebs para eliminar cualquier coágulo de sangre. Quitar el tejido conectivo usando micro-tijeras, pinzas y microscopio de disección quirúrgica (Figura 6D-E). NOTA: Mantenga toda la eslora del buque y el uso de la aorraíz de tic para determinar la orientación del vaso.
3. Vessel Determinación de dimensiones y montaje
   Para determinar la rigidez del recipiente, se requiere que las dimensiones de la embarcación sin carga y se pueden determinar con un microscopio calibrado.
   1. Cortar un anillo aórtico de aproximadamente 2 mm de longitud y medir con precisión su longitud utilizando un ajuste (Figuras 6F-G) microscopio calibrado. Ponga a un lado este segmento en solución de Krebs.
   2. Corte otro anillo aórtico tan pequeño como sea posible entre cada uno de los segmentos 2 mm (Figura 6F). Añadir este pequeño segmento en un portaobjetos de vidrio de microscopio con el lumen hacia arriba y medir el espesor de la pared usando un ajuste de microscopio calibrado (Figura 6H).
   3. Llene la caja de Petri en la plataforma BAXS con solución Krebs e inserte el segmento de anillo aorta 2 mm en los pernos de tracción (recuadro en la Figura 4C).

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Figura 5. Fabricación sustrato de PDMS y de montaje. A) Después del curado, el sustrato es cuidadosamente pelado fuera de la 2050 molde SU-8 y dejar de lado en una placa de Petri. B) Anclaje características hechas de PDMS y ayudan a asegurar el sustrato en la abrazaderas. C) sustrato con características de anclaje listo para el montaje. D) El sustrato se monta en las abrazaderas 4, que se montan entonces en el soporte de la abrazadera (véase el recuadro). E) Imagen detallada del sustrato montado en las abrazaderas 4. F ) Procedimiento de colada de PDMS en la ranura debajo de la del sustrato. La flecha muestra el PDMS de llenado lentamente la ranura por capilaridad.

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Figura 6. Preparación y aislamiento de la aorta torácica. A) preparar instrumentos quirúrgicos y el ratón sacrificado. B) A través de una incisión abdominal longitudinal, se retiran de la jaula torácica y globos de pulmón. C) La aorta se retira cuidadosamente usando el corazón para manipular el tejido. D) El corazón y la aorta se ponen en solución fisiológica de Krebs. La aorta se limpia mediante la eliminación de todos los tejidos conectivos. E) imagen detallada que muestra el. F) segmento de la aorta del corazón y la aorta utilizado para la evaluación de rigidez a lo largo con pequeños segmentos utilizados para la medición de espesor. GH) La longitud precisa (G) y el espesor (H) de cada uno de los segmentos de buques se evalúan usando un microscopio inverso y un programa de análisis.

Resultados

Celular Estiramiento

La plataforma BAXS se utilizó para investigar la respuesta mecánica del núcleo en las células individuales de mioblastos de ratón (C2C12) expuesta a una deformación del sustrato de 25%. Células mioblastos se encuentran en el tejido muscular y están constantemente expuestos a estiramiento mecánico y de compresión in vivo. Las propiedades de forma y mecánicas del núcleo de la célula han demostrado que desempeñan un papel importante e...

Discusión

La plataforma BAXS presentado aquí facilita numerosos experimentos en el estudio de mecanobiología, de las investigaciones de las células individuales a los tejidos enteros. Además, la plataforma es altamente flexible y configurable, permitiendo numerosos experimentos de estimulación mecánicas y de ensayo de tracción multiaxial. La plataforma también permite el mantenimiento de células y tejidos en condiciones fisiológicas y permite para microscopía simultánea durante los experimentos de estiramiento. Los do...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your
FluoSpheres fluorescent microspheres	Invitrogen	F8810	Keep away from light.
Linear voice coil	Moticont	LVCM-051-051-01	The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.
Ball bearing slide	Edmund Optics	NT37-360	Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides
Linear positioning stage	Edmund Optics	38-960	Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages
Optical encoder	GSI microE systems	Mercury II 1600S - 0.5um resolution	reflective incremental encoder.
Motion controller	Galil	DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440	4 axis controller with a 4 axis amplifier
Load cell	Honeywell	31 low	miniature load cell with a range of 0-150 g
Insect minutiens pins (0.20 mm)	Pin Service Austerlitz Insect pins		Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape
SU-8 2050	Micro Chem	SU-8 2050	Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light
Air-plasma treatment system	Glowresearch		Autoglow Oxygen Plasma System
Rat-tail collagen	Invitrogen	A10483-01	Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml
Hoechst 33342	Invitrogen	R37605	DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters	omega.ca	KHLV-0504/(10)-P	28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V
1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers	omega.ca	CN63200-R1-LV	Temperature controller; supply 24 V.
DMEM culture medium	Hyclone	SH3024301	Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C
Penicillin-Streptomycin	Hyclone	SV30010	Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C.
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH3039603C	Keep frozen.
Trypsin 0.05%	Hyclone	SH30236.02	Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation
Hepes	Wisent Inc	330-050-EL	HEPES-buffered salt solution
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
CaCl2	Fisher Scientific	C614-500	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
Dextrose	Fisher Scientific	BP220-1	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-1	Krebs physiological solution
KH2PO4	Fisher Scientific	BP362-500	Krebs physiological solution
Carbogen 95% O2/5% CO2	Lindle	DIN:02154749	Krebs physiological solution oxygenation
Nocodazole	Sigma	M1404	Microtubules depolymerization agent
Cytochalasin-D	Sigma	C8273	Actin filaments depolymerization agent
Anti-α-SMA-FITC	Sigma	F3777	Used to stain and quantify smooth muscle cells content
Picrosirius red stain	Fluka	43665	Used to stain and quantify collagen content