Método in vitro para observar interacciones mediadas por E-selectina Entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas

Resumen

Nuestro informe se describe un método único para visualizar y analizar las interacciones CTC / CE en el cáncer de próstata en condiciones de flujo fisiológico.

Resumen

La metástasis es un proceso en el que las células tumorales se desprenden de tumor intravasate vascular de la sangre primaria y el sistema linfático, de ese modo, obtener el acceso a la extravasación y formar un nicho secundaria. La extravasación de las células tumorales desde el sistema vascular de la sangre puede ser estudiada usando células endoteliales (ECs) y las células tumorales obtenidas a partir de diferentes líneas celulares. Se llevaron a cabo estudios iniciales usando condiciones estáticas, pero se ha documentado bien que los EC se comportan de manera diferente bajo condiciones de flujo fisiológico. Por lo tanto, los diferentes conjuntos de cámara de flujo actualmente se utilizan para el estudio de las interacciones celulares de cáncer con EC. Ensambles de cámara de flujo actuales ofrecen resultados reproducibles, ya sea utilizando diferentes líneas celulares o de líquido a diferentes condiciones de estrés de cizalla. Sin embargo, para observar y estudiar las interacciones con las células raras, como las células del tumor (CTCs) en circulación, se requieren ciertos cambios que deben introducirse en el conjunto de la cámara de flujo convencional. CTCsson una población de células raras entre millones de células sanguíneas. En consecuencia, es difícil obtener una población pura de CTC. La contaminación de las CTC con diferentes tipos de células que se encuentran normalmente en la circulación es inevitable el uso de presente de enriquecimiento o técnicas de agotamiento. En el presente informe se describe un método único para la etiqueta circular las células de cáncer de próstata con fluorescencia y estudiar sus interacciones con EC en un sistema de cámara de flujo auto-ensamblado. Esta técnica se puede aplicar además a observar las interacciones entre CTC próstata y cualquier proteína de interés.

Introducción

La metástasis es un proceso de múltiples pasos compleja que sigue siendo poco conocida. El eje ligando E-selectin/selectin se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral mediante la promoción de interacciones adhesivas primarias entre el endotelio vascular y células de cáncer de ^1,2. Endotelial (E)-selectina es una proteína transmembrana expresada por las células endoteliales activadas, mientras diferente ligando (s) de E-selectina se expresan por las células tumorales ^3. Numerosos enfoques in vitro se han empleado con éxito para modelar las interacciones de ligando E-selectin/selectin entre las células tumorales y las células endoteliales (EC) ^1. Para el estudio de estas interacciones, se están empleando diferentes sistemas de cámara de flujo para simular el sistema vascular arterial. Entre conjuntos de cámara de flujo, la cámara de flujo de placas paralelas (PPFC) en conjunción con las EC se utiliza rutinariamente como un modelo in vitro simulando in vivo en condiciones de estrés de cizallamiento. En estemétodo, ECs se cultivan en un plato de 35 mm y después de la consecución de una monocapa, las EC se adjuntan a la PPFC y experimentos basados ​​en la tensión de cizallamiento se realizan.

Sin embargo, PPFC y otros sistemas actuales presentan muchas limitaciones para el estudio de las interacciones adhesivas entre las células tumorales (CTC) derivadas de pacientes y EC, que circula principalmente, porque CTC son una población rara de células, arrojar desde el tumor primario, que circula entre los millones de células de la sangre (1 CTC por 10 ⁹ células de la sangre) ^4. Por lo tanto, a diferencia de suministro ilimitado de líneas de células cultivadas, bajo recuento de CTC conducen a muy pocas y raras interacciones CTC / CE, requiriendo adecuado ancho de canal de flujo para registrar las interacciones de análisis de la reproducción. Además, dado que los pacientes CTC derivados son una población impura, por lo tanto, se requiere un marcador de identificación para rastrear las CTC en específico. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un nuevo método para identificar el cáncer de próstata (CaP) CTCs tomando ventaja del hecho de que prácticamente todos estos CTC expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA) en su superficie celular ^5,6. En este informe, se utilizó la línea celular de cáncer de próstata, MDA PCa2b (MDA), para demostrar la utilidad potencial de nuestro nuevo sistema para el estudio de la próstata interacciones CTC con EC, con el tiempo para comprender el mecanismo de la metástasis.

Nuestra metodología se puede aplicar para varios experimentos de cizalla basada en la simulación de sistema vascular in vivo en ^7-9. Además de examinar las interacciones CaP CTC / CE, el sistema de cámara de flujo de corriente podría adaptarse fácilmente para el análisis de células mononucleares de sangre periférica o de las interacciones de células tumorales con EC. La facilidad de montaje y desmontaje de la cámara de flujo, un microportaobjetos III ^(0,1) (en lo sucesivo denominada como microportaobjetos), permite el cultivo de EC bajo perfusión y la estimulación de los EC con diferentes citocinas para inducir prOtein expresión. Además, cultivos de ECS, proteínas recombinantes, tales como E-y P-selectina se pueden cubrir en el microportaobjetos y las interacciones con las células tumorales pueden ser observados bajo condiciones de flujo laminar ^10.

Protocolo

1. El cultivo de HUVEC microportaobjetos para Interacciones de Observación del CTC-endoteliales

1. Bajo la campana de cultivo de tejidos, primero enjuague el microportaobjetos, ancho de canal de 1 mm con PBS. Suavemente la capa MicroSlide con 200 l de 50 mg / ml de fibronectina (disuelto en PBS) usando una jeringa de cierre Luer de 1 ml.
2. Cubrir el MicroSlide con la tapa y mantenerlo dentro de la campana de cultivo de tejido durante 30 min. De dispensación lenta del líquido en el MicroSlide impide la formación de burbujas en el canal.
3. Perfundir 200 l de agua tibia (37 ° C) de HUVEC medio de crecimiento (medio M199, HEPES 1 M, 20% de FBS, 5 mg / ml de heparina, factor de crecimiento celular endotelial 100 g / ml, y L-glutamina) sobre el MicroSlide e incubar 20 min a temperatura ambiente. Durante la perfusión, preparar la suspensión de células HUVEC.
4. Enjuague HUVECs con PBS y añadir 0,05% de tripsina-EDTA durante 1-2 min a TA. Centrífuga HUVECs en 2 ml de medio de crecimiento a 180 xg durante 5 min.
5. Medir la concentración de células usando un Neubahemocitómetro uer y preparar 10 ⁷ HUVEC células/100 l medio de cultivo. A continuación, retire con cuidado el medio de la entrada de la microportaobjetos usando una punta de pipeta de 200 l.
6. Llevar el MicroSlide a nivel de los ojos y el uso de una jeringa de 1 ml Luer-Lock, perfundir suavemente 200 l de concentración de preparado de HUVECs en el canal. Se debe tener precaución en este paso para evitar la formación de burbujas. Si aparecen burbujas, mantenga la perfusión durante un tiempo un poco más largo hasta que las burbujas entren en el canal de salida.
7. Ponga un volumen igual (~ 80 l) de los medios de comunicación HUVEC tanto en la entrada y salida de la MicroSlide. Esto evita que el flujo de células en cualquier dirección.
8. Cubrir el portaobjetos y mantenerlo en la incubadora (37 ° C) durante 1,5 horas.

2. Preparación de Flujo Asamblea Cámara para pasar la noche HUVEC Cultura en un MicroSlide

1. Coloque una jeringa estéril de 20 ml, conectores Luer hembra y macho, los tubos y una bomba de jeringa en la incubadora durante 15 millasn.
2. Para un volumen muerto mínimo, utilizar el tubo con diámetro interior de 0,04 pulgadas. Menor diámetro tubo impide la formación de burbujas.
3. Llene la jeringa de 20 ml con agua caliente (37 ° C) HUVEC medios de comunicación (12 ml). Una el tubo con los conectores en la jeringa. Quite las burbujas. Conecte este conjunto a la microportaobjetos.
4. Llenar completamente la entrada de la MicroSlide con medios HUVEC. Traiga la jeringa de 20 ml conectada al conector junto al microportaobjetos. Conecte con cuidado el conector a la microportaobjetos.
5. Traiga la puesta a punto en la incubadora y conectarlo a la bomba de jeringa, puesta a régimen de cizalladura 10 l / min. Deje las células O / N en la incubadora a 37 ° C.
6. Al día siguiente, desmontar la puesta a punto mediante la eliminación de el conector unido a la entrada de la MicroSlide.
7. Para regular positivamente la expresión de E-selectina sobre las CE, preparar el medio de cultivo fresco que contenía IL-1β a 10 ng / ml en 4 ml de medio. Aspirar los medios de comunicación en una jeringa de 10 ml. Retire tque los medios de comunicación a partir de la entrada de la microportaobjetos y conectar la jeringa a la diapositiva.
8. Ajuste la bomba de jeringa a 10 la velocidad de cizalla l / min durante 4 horas en la incubadora.

3. Elaboración de Anti-PSMA (J591-488) con etiqueta células del cáncer de próstata

1. Durante la incubación IL-1β de HUVECs, preparar anti-PSMA J591-Alexa488 etiquetados células de CaP. Añadir 0,05% de tripsina-EDTA para células MDA durante 1 min. No exponer las células a tripsina durante tiempos más largos, ya que puede afectar a los glicopéptidos presentes en la superficie celular. Reactivo de disociación celular libre de enzimas también se puede utilizar en lugar de la tripsina. Centrifugar a 200 xg durante 5 min.
2. Resuspender sedimento celular MDA in 1 ml de H / H tampón (sal de Hanks equilibrada solution/0.1% HSA/10 HEPES / _CaCl2 1 mM). Añadir anticuerpo-J591 Alexa488 anti-PSMA a 20 mg / mL durante 30 min a TA en un lugar oscuro. Resuspender las células durante la incubación.
3. Después de 30 min, se centrifuga la solución de células a 800 xg durante 5 min. Aspitasa y resuspender el precipitado en 1 ml de tampón H / H. Contar las células MDA etiquetados y llevar la concentración final de 1x10 ⁶ células / ml. Llene una jeringa de 5 ml con J591-488 células MDA etiquetados y eliminar las burbujas.

4. Preparación de anti-PSMA (J591-488) Etiquetada CTCs Enriquecido de CaP pacientes

1. Recoger 7,5 ml de sangre de pacientes con cáncer de próstata en un tubo de tapa azul (que contiene citrato de sodio). Suavemente diluir 1:01 sangre en 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
2. Añadir 5,3 ml de Ficoll-Paque Plus en un tubo cónico de 50 ml. Capa diluyó la sangre en la parte superior de la Ficoll-Paque. Centrifugar a 400 xg durante 30 min.
3. Pre-coat todos los tubos o consejos de entrar en contacto con las CTC con un 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl _2/4 mM MgCl ₂ (tampón R / S) para evitar la unión no específica de los CTC a las superficies. Mantener 4 ° C de temperatura de los medios y tampones que entran en contacto con los CTC.
4. Recoger el de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fraccióncontiene CTCs de la interfaz en otro tubo cónico de 50 ml que contiene 30 ml de tampón de R / S. Se centrifuga a 400 g durante 8 min.
5. Resuspender el precipitado y lavar de nuevo en tampón de R / S a 400 xg durante 8 min. Después de la centrifugación, se resuspende el sedimento en tampón H / h. Añadir anti-PSMA J591-488 anticuerpo a 20 mg / ml durante 30 min a TA en un lugar oscuro.
6. Después de 30 minutos, centrifugar los PBMCs que contengan J591-488 CTCs etiquetados a 800 xg durante 5 min. Volver a suspender en tampón H / H. Llene una jeringa de 1 ml (pre-recubiertos con tampón de R / S) con la muestra.

5. Preparación del microscopio, la bomba de jeringa y flujo Asamblea Cámara

1. Encienda el microscopio invertido y ajuste la iluminación Kohler a 10X objetivo. Traiga la bomba de jeringa al mismo nivel que la etapa de la muestra del microscopio y lo fijó en 1 dyn / cm ² esfuerzo de corte (~ 10 l / min).
2. Abra el software Zeiss Axiovision. Seleccione el objeto en la pantalla de ordenador. Crear un nuevocarpeta en la opción de herramientas en el software.
3. Abra la opción experimentos inteligentes en Axiovision y ajuste la configuración para grabar vídeos de corta duración 30 seg durante 30 min.
4. Para el vídeo fluorescente en vivo, establezca las opciones-12 de imagen ms de exposición, 2 x 2 bandejas, 5 Gain. Estos parámetros ayudan en la consecución de los vídeos cercanas a la velocidad de fotogramas de vídeo (~ 23 cuadros por segundo) con la cámara Zeiss MRM.
5. Para visualizar ancho del canal de flujo a 10 X objetivo en la pantalla del ordenador, utilice un adaptador de montura C (0,63 mm xf/60 Interface).
6. Encienda la lámpara de mercurio.
7. Coloque la jeringa y el conector que contiene las células en la bomba de jeringa.
8. Llevar la IL-1β estimulada HUVEC de la incubadora. Enchufe el conector en el canal de entrada de lleno de la microportaobjetos contiene HUVECs.
9. Conectar el canal de salida con el conector unido a la tubería. Ponga el tubo en un plato o 15 ml tubo cónico para recoger el flujo a través.
10. Inicie la infusia través de la MicroSlide a 10 l / min. Tenga en cuenta las interacciones entre las células endoteliales y las células MDA marcados o etiquetados CTC derivados de pacientes menores de filtro de 488 nm en el microscopio de epifluorescencia.
11. Comienza la grabación del experimento como 30 seg videos cortos. Durante el análisis de la reproducción, medir la velocidad de rotación. La velocidad de rotación se mide dividiendo la distancia recorrida por las células con el tiempo.

6. La inmunotinción de la MicroSlide

1. Retire el papel de la entrada y salida del microportaobjetos después de la perfusión de las células MDA en IL-1β estimulada HUVECs durante 10 min.
2. Con una punta de 200 l, poner caliente (37 ° C) de PBS que contiene calcio y magnesio en la entrada de la microportaobjetos durante 5 min. Incline la microportaobjetos usando su tapa como un apoyo en el banquillo. Mantenga el MicroSlide en una posición inclinada para todas las incubaciones durante inmunotinción.
3. Fijar HUVECs perfundiendo cálida formaldehído al 2% en la entrada
4. incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Enjuague dos veces con PBS durante 5 min cada uno.
5. Añadir Triton X-100 (0,1%) en 5% de BSA en PBS durante 10 min a TA.
6. Enjuague dos veces con PBS durante 5 min cada uno. Se bloquea con 5% de BSA en PBS durante 30 min.
7. Se incuba con anticuerpo de cabra anti-primaria VE-cadherina (1:100) en 2,5% BSA O / N a 4 ° C.
8. Al día siguiente, lavar dos veces con PBS durante 5 min cada uno. Añadir burro secundario de cabra anti-647 de anticuerpos durante 45 minutos. Lavar dos veces con PBS durante 5 min cada uno.
9. Incubar a temperatura ambiente con anticuerpo humanizado conjugado-J591 Alexa488 durante 1 hora.
10. Lavar dos veces con PBS durante 5 min cada uno. Añadir DAPI durante 5 min. Lavar con agua destilada durante 5 min.
11. Añadir PBS (o Mowiol para el almacenamiento a largo plazo). Visualice el microportaobjetos bajo el microscopio confocal.

Resultados

La figura 1 muestra un cultivo O / N de una monocapa de EC en la MicroSlide. Los batiduras en la Figura 1A muestra que el 100% de la MicroSlide es visible usando objetivo 5X mientras que el 70% es visible utilizando un objetivo de 10 aumentos (figura 1B). Para E-selectina mediada por las interacciones, las células de rodadura en los bordes no se consideran que hace más de 70% de la MicroSlide disponible para la grabación en vídeo y análisis de la reproducción. En ...

Discusión

Debido al bajo número de CTC entre las células de la sangre, es difícil aislar los CTC como una población pura de células. Con el fin de estudiar las interacciones CTC / CE, la población rara e impuro de los CTC plantea dos grandes retos: a) Identificación de los CTC entre las células de la sangre; b) Observación de las interacciones CTC / CE.

Para superar la primera limitación de la identificación de los CTC de próstata entre los glóbulos, tomamos ve...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02