Una técnica de microfluidos investigará Deformabilidad Cell

Resumen

Se demuestra un ensayo basado en microfluídica para medir la escala de tiempo de tránsito para las células a través de una secuencia de constricciones a escala micrométrica.

Resumen

Aquí nos detalle el diseño, fabricación y uso de un dispositivo de microfluidos para evaluar la deformabilidad de un gran número de células individuales de una manera eficiente. Típicamente, los datos de ~ 10 ² células pueden ser adquiridos dentro de un experimento 1 hr. Un programa de análisis de imagen automatizado permite eficiente análisis post-experimento de datos de imagen, lo que permite el procesamiento de estar completo dentro de unas pocas horas. Nuestra geometría del dispositivo es único en que las células deben deformarse a través de una serie de constricciones a escala micrométrica, permitiendo de ese modo la deformación inicial y la relajación dependiente del tiempo de las células individuales a ensayar. La aplicabilidad de este método a las células de leucemia promielocítica humana (HL-60) se demuestra. Células de conducción para deformar través constricciones micras escala que utilizan flujo de presión impulsada, observamos que (HL-60) células promielocítica humana momentáneamente ocluyen la primera constricción de un tiempo medio de 9,3 ms antes de pases con mayor rapidez a través de la constricción posterioriones con un tiempo de tránsito promedio de 4,0 milisegundos por constricción. Por el contrario, todo-trans tratado con ácido (tipo de neutrófilos) retinoico células HL-60 ocluyen la primera constricción sólo 4,3 mseg antes de pases a través de las constricciones posteriores con un tiempo de tránsito mediana de 3,3 mseg. Este método puede dar una idea de la naturaleza viscoelástica de células, y finalmente revelar los orígenes moleculares de este comportamiento.

Introducción

Los cambios en la forma celular son fundamentales en numerosos contextos biológicos. Por ejemplo, los eritrocitos y los leucocitos se deforman través de los capilares que son menores que su propio diámetro ^1. En la metástasis, las células cancerosas deben deformarse a través de huecos intersticiales estrechas, así como la vasculatura tortuosa y redes linfáticos para sembrar en sitios secundarios ^2. Para investigar el comportamiento físico de las células individuales, dispositivos de microfluidos presentan una plataforma ideal que se puede personalizar para estudiar una serie de comportamientos celulares, incluyendo su capacidad de migrar a través de huecos estrecho ³ y deformar pasivamente a través de las constricciones de escala micrométrica ^{3- 9.} Polidimetilsiloxano (PDMS) dispositivos de microfluidos son ópticamente transparentes, permitiendo deformaciones celulares para ser visualizadas mediante microscopía de luz y analizados utilizando herramientas básicas de procesamiento de imágenes. Además, las matrices de constricciones pueden ser definidos con precisión, que permite el análisis de múltiples células simultáneamente con unarendimiento que supera muchas técnicas existentes ^10,11.

Aquí se presenta un protocolo experimental detallado para sondear deformabilidad celular utilizando el dispositivo de microfluidos 'Cell Deformador' PDMS. El dispositivo está diseñado de manera que las células de paso a través de constricciones secuenciales; esta geometría es común en contextos fisiológicos, tales como el lecho capilar pulmonar ^12. Para medir la deformabilidad celular, el tiempo de tránsito proporciona una métrica conveniente que se mide fácilmente como el tiempo requerido para una célula individual a través de un único tránsito ^4,6 constricción. Para mantener una caída de presión constante a través de los canales estrechos durante el tránsito de células, usamos flujo accionado por presión. Nuestro protocolo incluye instrucciones detalladas sobre el diseño del dispositivo y la fabricación, el funcionamiento del dispositivo de flujo impulsado por presión, la preparación y obtención de imágenes de células, así como el procesamiento de imágenes para medir el tiempo para que las células se deforman a través de una serie de constricciones. Incluimosambos diseños de dispositivos y el código de procesamiento de datos como archivos de visión suplementarios. Como una muestra representativa de los datos, se muestra el tiempo de tránsito celular a través de una serie de constricciones como una función del número de constricciones pases. Análisis de la escala de tiempo para que las células tránsito a través constricciones estrechos de un dispositivo de microfluidos puede revelar diferencias en la deformabilidad de una variedad de tipos de células ^4,5,13. El dispositivo ha demostrado aquí examina únicamente el tránsito celular a través de una serie de constricciones a escala micrométrica; este diseño emula el tortuoso camino que las células experimentan en circulación y también permite sondear las características físicas adicionales de las células, tales como tiempo de relajación.

Protocolo

1. Diseño de dispositivos de microfluidos

NOTA: El diseño del dispositivo tiene cuatro regiones funcionales básicos: puerto de entrada, filtro de células, matriz de constricción, y el puerto de salida (Figura 1). El diseño general se puede aplicar a una amplia gama de tipos de células, con ajustes menores en las dimensiones. Siempre he aquí algunas recomendaciones básicas de diseño, junto con los parámetros del dispositivo que son eficaces para una selección de ambas células primarias y inmortalizadas.

1. Seleccionar la anchura de los canales de la matriz de constricción (Figura 1B) en aproximadamente 30-50% del diámetro medio de celda; estos resultados de proporción-constricción a célula de tamaño en la deformación celular significativa, pero la obstrucción mínima. Dado un tipo de célula que no ha sido previamente probado, es prudente para diseñar una gama de anchos de constricción de ~ 30-50% del diámetro de la celda para encontrar el ancho óptimo. Al igual que con muchos tipos de dispositivos de microfluidos, más de 120 maestros moldes de dispositivos pueden tomar como modelo en un pecadogle oblea de silicio de 4 pulgadas, lo que permite una gran variedad de diferentes diseños de dispositivos que se fabrica en un único proceso de fabricación.
2. Seleccione la altura del canal a ser al menos 50% del diámetro de la célula; Esto asegura que la célula está confinado en 2 dimensiones. Para evitar el colapso durante la unión de canal, asegúrese de que la relación de aspecto del canal no menos de 1:10 es (altura: anchura) en todo el dispositivo. Para los canales que deben superar esta relación de aspecto, añadir puestos de apoyo para evitar el colapso. Postes de soporte espacio a una distancia que es al menos dos veces el diámetro de la celda, para no impedir el flujo celular.
3. Incluir un filtro en los puertos de entrada para eliminar los residuos y desagregar grupos de células (Figura 1B). Ajuste el tamaño y el espaciamiento de los postes de filtro de modo que la distancia que separa los mensajes es aproximadamente igual a un diámetro celular.
   NOTA: El límite inferior del tamaño de la característica está establecida por la resolución con la que la máscara de la litografía se imprime. Asegúrese de que todas las funciones están dentro de los resolution límite especificado por el proveedor máscara.

2. Suministros y Preparación

NOTA: Antes de realizar un experimento, los siguientes elementos deben estar preparados. Un diagrama esquemático de la configuración completa se da en la Figura 1.

1. Fabricar el maestro dispositivo usando técnicas estándar para micromecanizado litográfica ^14,15. Verificar la altura de las características modeladas utilizando un perfilómetro.
   NOTA: Mientras que los maestros pueden ser fácilmente fabricados en una instalación de salas blancas, algunos laboratorios han desarrollado métodos de litografía de bajo costo para su uso en un entorno semi-limpia ^16,17.
2. Preparar la fuente de aire para el flujo accionado por presión, usando un tanque de aire comprimido y la secuencia de los reguladores de aire y accesorios (Figura 1A).
   1. Establecer un tanque de suministro de aire y regulador manual.
      NOTA: Una composición de 5% de _CO2 en aire mantiene un ambiente similar a un incubato típica de cultivo de célulasr, pero otras mezclas de gases pueden también ser utilizados.
   2. Establecer un regulador de presión controlado electrónicamente en línea con el regulador manual. Utilice un convertidor electroneumático para regular y mantener una caída de presión estable a través de los canales, con fluctuaciones de presión de menos de 2 kPa. Utilice el código simple escrito en LabVIEW (Información complementaria) a la entrada de la presión deseada.
      NOTA: El convertidor electro-neumática utiliza un bucle de retroalimentación interno para ajustar la presión de salida de la válvula para que coincida con la presión especificada a través del dispositivo de microfluidos.
   3. Configurar una cámara presurizada para conducir el flujo de la suspensión celular. Montar una cámara de suspensión de células de un citómetro de flujo estándar de tubo y una tapa mecanizada que crea un sello hermético a presión en el tubo.
      NOTA: La tapa de la cámara de presión contiene dos orificios: una entrada que se conecta al tanque de aire comprimido, y una salida a través de la cual las células fluyen desde la cámara de presión en el dispositivo (Figure 2).
3. Establecer un microscopio invertido equipado con una cámara que tiene una velocidad de adquisición de al menos 100 fotogramas por segundo para capturar imágenes de las células fluyen a través de la matriz de constricción. Interfaz de la cámara con una tarjeta de captura de vídeo y un ordenador.
4. Preparar una solución madre de tensioactivo de 10% w / w de Pluronic F-127 en tampón fosfato salino (PBS) como la adición de una pequeña cantidad de F127 a la solución de medio celular ayudará a minimizar la adhesión celular a las paredes de PDMS. Para preparar la solución F127, vórtice y calentar suavemente a 37 ° C para disolver el F127. Antes de usar, pasar la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras y almacenar a temperatura ambiente. Preparar la solución de tensioactivo antelación vórtex y filtrado generará burbujas que persistirán durante más de 24 horas.

3. la fabricación del dispositivo de microfluidos

1. Fabrique bloque PDMS con canales de microfluidos.
   1. Mezclar bien con un PDMSta relación de 1:10 (w / w) agente de curado a la base.
   2. Vierta la mezcla sobre el maestro del equipo (paso 2.1). Degas en una campana de vidrio con vacío aplicada hasta que las burbujas atrapadas desaparecen, o durante unos 10-20 min.
      NOTA: Después de este tiempo, todavía puede haber burbujas en la interfase aire-PDMS, que es normal; éstos normalmente se disiparán durante la cocción. Es más crítico para asegurar que no haya burbujas restantes adyacentes a los canales.
   3. Hornee el dispositivo de desgasificado a 65 ° C durante 4 horas. Para evitar el colapso de los canales, hornear el dispositivo durante la noche para reticular aún más las PDMS para un dispositivo con un mayor módulo elástico que es más resistente al colapso canal. Sin embargo, nota que se extendía hornear también fragiliza los PDMS y puede conducir a la rotura al perforar agujeros (Paso 3.3).
2. Retire los dispositivos de microfluidos del molde maestro. Cortar los dispositivos de microfluidos individuales fuera del bloque de PDMS con una hoja de afeitar y retire el dispositivo desde el mástiler. Comience levantando suavemente una esquina del dispositivo; pelado lento y suave, en lugar de levantar el bloque de PDMS hacia arriba, reduce la presión sobre los dos PDMS y el maestro.
3. Haga agujeros en el dispositivo de PDMS para crear puertos de conexión para el acceso entre la tubería y microcanales. Crear orificios utilizando un punzón de biopsia, y el punzón desde el lado del canal hasta el lado exterior del dispositivo.
   NOTA: Un punzón de biopsia con un diámetro interior de 0,75 mm crea agujeros de esa interfaz perfectamente con polieteretercetona (PEEK) tubo (diámetro exterior = 1/32 "o 0,79 mm) o un tubo de polietileno (PE-20, de diámetro exterior = 0,043" o 1,09 mm ). Use un anillo de luz para ayudar a visualizar agujeros en dispositivos con canales poco profundos ^18. Asegúrese de que el punzón de biopsia es fuerte; después de un uso repetido la vanguardia embota y el punzón de biopsia debe ser desechado y sustituido.
4. Enjuague el dispositivo de PDMS con isopropanol (grado HPLC) para quitar trozos de polvo y presentadas de PDMS. Asegúrese de que elagujeros estén libres de desechos por la dirección de un flujo constante de isopropanol puro a partir de una botella de apretón a través de los agujeros. Secar con aire filtrado. Después de la limpieza, coloque PDMS bloques con canales boca arriba en una placa de Petri limpia para mantener la limpieza del dispositivo. Si es necesario, dispositivos de tiendas en esta forma hasta que la unión.
5. Limpie el sustrato de vidrio de lavado con metanol (grado HPLC), secar con aire filtrado y coloque sobre una placa caliente a 200 ° C durante 5-10 minutos para asegurar que el vaso está completamente limpia y seca antes del tratamiento de plasma.
   NOTA: El sustrato de vidrio se forma la parte inferior de cada canal. Normalmente basta un portaobjetos de vidrio, ya que un objetivo de 10X o 20X es ideal para la formación de imágenes de múltiples canales en paralelo. Para imágenes de mayor resolución, unir el dispositivo a un cubreobjetos (# 1.5 espesor).
6. Unir el dispositivo de PDMS al sustrato de vidrio.
   1. El plasma de oxígeno tratar el lateral de canal del bloque de PDMS y 1 lateral de un portaobjetos de vidrio.
      NOTA: WITH una unidad de descarga de mano, utilizar un tiempo de tratamiento de 1 min, pero optimizar el tiempo de tratamiento para cada aparato plasma de oxígeno.
   2. Coloque el lado del canal de los PDMS en la parte superior del lado tratado del vidrio inmediatamente después del tratamiento.
   3. Sostenga con una ligera presión para ~ 10 seg para promover la unión. Hornear todo el dispositivo a una temperatura elevada (60-80 ° C) durante al menos 15 min para mejorar la resistencia de la unión.

4. Deformación células a través de canales constreñida

1. Inspeccione el dispositivo de microfluidos con un microscopio. Asegúrese de que los canales no se contraen o rotas y que los dos orificios de entrada y salida se conectan directamente en los canales de dispositivos mediante el uso de un objetivo de baja potencia (10 veces). Designe dispositivos defectuosos al anotar la superficie del PDMS con una hoja de afeitar y no usarlos para experimentos.
2. Preparar las muestras de cultivo de células a ensayar. Células de cultivo utilizando condiciones estándar.
   1. Fo ejemplo, cultivo de células HL-60 en medio RPMI-1640 suplementado con solución de penicilina-estreptomicina al 1% y suero bovino fetal al 10% en 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C.
   2. Para las células adherentes, los cosechan por tripsinización y se resuspende en medio de crecimiento fresco. Utilice un protocolo tripsinización estándar; por ejemplo, añadir ~ 0,5 ml de tripsina a un matraz con 25 ^cm2 de área de cultivo, y volver a suspender en ~ 30 ml de medio fresco. Diferenciar células HL-60 en células de tipo neutrófilo por todo-trans retinoico (ATRA) a una concentración final de 5 mM por 1 x 10 ⁵ células / ml como se ha descrito previamente ^19,20.
   3. Centrifugar las células a 300 xg durante 3 min, aspirar cuidadosamente las células sobrenadante y resuspender a la densidad final apropiado en medio de cultivo fresco con 0,1% v / v F-127.
3. Contar las células utilizando un contador Coulter, hemocitómetro o citómetro de flujo. Ajustar la suspensión celular a una densidad de 1 × 10 ⁶ 5 x 10 6 células / ml. Una vez que la densidad de la suspensión se ajusta, suplemento con aproximadamente 0,1% v / v F-127.
   NOTA: La densidad celular y la concentración de tensioactivo pueden necesitar ser modificada dependiendo de los sistemas de células particulares, Tabla 1 proporciona un registro de concentraciones utilizadas previamente de células y F-127 para diferentes tipos de células.
4. Coloque suspensión de células en un citómetro de flujo del tubo y conectarse a la tapa de presión. Antes de conectar el tubo al dispositivo de microfluidos, ajustar la presión a alrededor de 14-21 kPa y descarga hasta que la suspensión celular emerge desde la punta de la tubería. Esto ayudará a minimizar las burbujas de aire en el tubo y el dispositivo.
5. Inserte la punta del tubo que contiene la suspensión de células en la entrada de dispositivo. Si el equipo está unido a un cubreobjetos, coloque el dispositivo sobre una superficie plana y sólida, tal como la platina del microscopio antes de conectar el tubo; el cubreobjetos es frágil y lo contrario podría romperse.
6. Inserte un trozo de tubo into el puerto de salida y la ruta en un tubo de vacío para la recogida de residuos tal como un tubo Falcon vacío pegada a la cara de la platina del microscopio. Para mantener la coherencia en la resistencia fluídica global del dispositivo entre los experimentos, asegúrese de que el tubo de entrada y la salida es del mismo diámetro y aproximadamente la misma longitud para cada experimento.
7. Rampa suavemente la presión para cerca de 28 kPa o hasta que las células fluyen a través de los canales. Coloque el dispositivo de modo que múltiples canales están en el campo de visión y son perpendiculares a la parte inferior de la pantalla. Si la cámara está limitada por el tamaño de los datos, adquirir múltiples vídeos para generar un número suficiente de puntos de datos independientes. Ajustar la velocidad según sea necesario para la salida de datos deseado marco. Para captar los cambios en la forma celular, utilizar imágenes de alta velocidad a 300 fotogramas por segundo (fps); para medir los tiempos de tránsito de las células, utilizar velocidades de fotogramas de aproximadamente 100 fps.

Análisis 5. Datos

1. Abra el archivo de mástiler_script.m (Descargable Archivo Suplementario) y ejecutar el programa.
2. Seleccione el primer video para ser analizada desde la ventana del Explorador de Windows que aparece. Especifique la velocidad de fotogramas del vídeo seleccionado y presione intro.
   NOTA: Una figura aparecerá que pide al usuario que seleccione una ventana de recorte rectangular para el primer video.
3. Seleccionar una ventana que abarca todos los canales de izquierda a derecha y cruza los canales justo encima de la primera bombilla de la matriz de canales en la parte superior y la parte inferior (Figura 3).
4. Seleccione las regiones de constricción de la imagen recortada. Preste especial atención a mantener una distancia fija de píxeles entre la ventana de límite superior e inferior para cada vídeo seleccionado.
   NOTA: El borde superior ventana especifica la constricción superior y el borde inferior ventana especifica la constricción más inferior (Figura 4); constricciones intermedios se aproximan de esta entrada del usuario. A continuación, el algoritmo muestra las segmentation de las células en los primeros 50 cuadros de cada video (Figura 5).
5. Monitorear la imagen izquierda superior (Figura 5A) de cerca para determinar si el algoritmo está localizando con precisión las células; una imagen binarizada se superpone a la fuente de vídeo para demostrar la localización de las células identificadas.
   NOTA: Las diferentes ventanas, (Figuras 5B-5D) son para el diagnóstico de código y demuestran los fotogramas de vídeo después de las operaciones específicas de procesamiento de imágenes.
6. Seleccione el siguiente vídeo que se procesa a partir de la ventana del Explorador de Windows.
   NOTA: El algoritmo se repetirá los pasos 5.2-5.5 para cada vídeo seleccionado.
7. Seleccione Cancelar una vez todos los vídeos deseados, se han añadido a través de la ventana del Explorador de Windows para instruir a la función que la lista de vídeos se ha completado.
   NOTA: El algoritmo llevará a cabo las operaciones restantes sin intervención del usuario. Esto tomará aproximadamente 1-2 horas, dependiendo del número de vídeos procesados ​​y pe informáticosrformance. Al finalizar, el algoritmo producirá un histograma de los datos de tiempo de tránsito y guardar los datos en el directorio como un archivo .mat MATLAB y un archivo xls de Microsoft Excel.

Resultados

Para investigar la deformabilidad de diferentes tipos de células, células de leucemia mieloide humana (HL-60), células de neutrófilos, células diferenciadas de linfocitos de ratón, y líneas celulares de cáncer de ovario humano (OVCAR8, HEYA8) se evalúan utilizando la técnica de microfluidos la "célula Deformador '. Los resultados representativos para el tiempo de tránsito de la HL-60 células HL-60 y de tipo de neutrófilos muestran la escala de tiempo de una sola célula de tránsito a través de u...

Discusión

Aquí proporcionamos un procedimiento experimental global para el análisis de la deformación de las células que transitan a través de canales de microfluidos obstruida usando flujo de presión impulsada. Una secuencia de comandos de MATLAB permite el procesamiento automático de datos (material complementario); se mantiene una versión actualizada del código ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). En términos más generales, las técnicas presentadas aquí...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant	Fisher Scientific	8409400	Produced by BASF, also available through Sigma
PDMS base and crosslinker	Essex Brownell	DC-184-1.1	Product commonly named Sylgard 184 Elastomer
Oxygen plasma discharge unit	Enercon	Dyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Fingertight Ferrule, 1/32"	Upchurch Scientific	UP-F-113
Fingertight III Fitting, 10-32	Upchurch Scientific	UP-F-300X
Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm	Valco	TPK.515-25M
Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm	Becton Dickinson	427406
Pressure regulator	Airgas or Praxair
Polyurethane tubing, 5/32” OD	McMaster Carr	5648K284
Push-to-connect fittings	McMaster Carr	5111K91
Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter	Omega	IP413-020
16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ	National Instruments	NI PCI 6225-779295-01
Analog Connector Block-Screw Terminal	National Instruments	SCB-68-776844-01
LabView System Design Software	National Instruments
MATLAB Software	The MathWorks, Inc.	MATLAB R2012a	Code requires the Image Processing Toolbox
Shielded Cable	National Instruments	SHC68-68