Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting

Resumen

De chorro de microfluidos contra una bicapa lipídica interfaz de gotita ofrece una manera fiable para generar vesículas con el control de la asimetría de la membrana, la incorporación de proteínas de transmembrana, y la encapsulación de material. Esta técnica se puede aplicar para estudiar una variedad de sistemas biológicos en los que se desean biomoléculas compartimentadas.

Resumen

De abajo hacia arriba la biología sintética presenta un nuevo enfoque para la investigación y la reconstitución de los sistemas bioquímicos y, potencialmente, organismos mínimos. Este campo emergente involucra ingenieros, químicos, biólogos y físicos para diseñar y ensamblar componentes biológicos básicos en los sistemas complejos, que funcionan desde abajo hacia arriba. Tales sistemas ascendentes podrían conducir al desarrollo de las células artificiales para investigaciones biológicas fundamentales y terapias innovadoras ^1,2. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs) pueden servir como una plataforma modelo para la biología sintética debido a su estructura de la membrana alveolar y tamaño. De chorro de microfluidos, o microjetting, es una técnica que permite la generación de GUVs con un tamaño controlado, composición de la membrana, la incorporación de proteínas de transmembrana, y la encapsulación ^3. El principio básico de este método es el uso de múltiples pulsos de fluido, de alta frecuencia generadas por un dispositivo de inyección de tinta piezoeléctrico accionado para deformar una L suspendidabicapa IPID en un jefe. El proceso es similar a soplar burbujas de jabón a partir de una película de jabón. Mediante la variación de la composición de la solución de hidromasaje, la composición de la solución que abarca, y / o los componentes que se incluyen en la bicapa, los investigadores pueden aplicar esta técnica para crear vesículas personalizadas. En este trabajo se describe el procedimiento para generar vesículas simples de una bicapa de interfaz de gota por microjetting.

Introducción

Se ha convertido cada vez más claro que la biología celular es un problema multi-escala que implica integrar nuestra comprensión de las moléculas a las células. En consecuencia, saber con precisión cómo las moléculas trabajan en forma individual no es suficiente para comprender los comportamientos celulares complejos. Esto se debe en parte a la existencia de comportamientos emergentes de sistemas de varios componentes, como se ejemplifica en la reconstitución de la interacción actina red con vesículas de bicapa lipídica ^4, el montaje de huso mitótico en Xenopus extracto ^5, y la dinámica espacial de los mecanismos de división celular bacteriana ^6. Una forma de complementar el enfoque de la reduccionista de la disección de los procesos moleculares de los sistemas vivos es tomar el camino contrario de la reconstitución de comportamientos celulares utilizando un conjunto mínimo de componentes biológicos. Una parte crítica de este enfoque implica la encapsulación fiable de biomoléculas en un volumen confinado, una característica clave de una célula.

e_content "> Existen varias estrategias para encapsular biomoléculas para el estudio de sistemas biomiméticos. El sistema más biológicamente relevante es membranas bicapa de lípidos, que imitan las limitaciones físicas y bioquímicas impuestas por la membrana plasmática de la célula. formación de vesículas unilamelares gigantes (Guvs) por electroformation ^7, una de las técnicas más ampliamente utilizadas para la generación de GUV ^14, tiene típicamente un pobre rendimiento de encapsulación debido a su incompatibilidad con tampón de alta concentración de sal ^8. Electroformation también requiere grandes volúmenes de muestra (> 100 l), lo que podría ser un problema para trabajar con proteínas purificadas , e incorpora de manera ineficiente moléculas grandes debido a la dificultad de difusión entre las capas de lípidos estrechamente espaciados. Se han desarrollado varios enfoques de microfluidos para la generación de vesículas de lípidos. Los métodos de emulsión doble, que pasan a través de dos componentes de las interfaces entre las capas de aceite-agua-agua (W / O / W), se basa en la evaporación de un VOlatile disolvente para impulsar la formación de bicapa lipídica ^9. Otros han utilizado una línea de montaje de microfluidos que produce una corriente continua de vesículas bicapa de lípidos ¹⁰ o en dos etapas independientes ^11. Hemos desarrollado una técnica alternativa basada en la aplicación rápidamente pulsos de fluido contra una bicapa interfaz de gotita ¹² para producir GUVs de tamaño controlado, composición, y la encapsulación. Nuestro enfoque, conocido como chorro de microfluidos, ofrece las ventajas combinadas de varias técnicas de generación de vesículas existentes, proporcionando un enfoque para la creación de sistemas biomoleculares funcionales para la investigación de una variedad de problemas biológicos.

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Protocolo

1. Cámara Infinito Fabrication

1. Diseño de la cámara de infinito (llamado así por su forma) utilizando un software de diseño asistido por ordenador (CAD), y guarde el archivo de manera que sea compatible con un cortador láser. Para crear esta forma, separadas dos círculos de diámetro 0.183 en una distancia de centro a centro de 0,15 pulg Corte la cámara desde 1/8- 3/16 en acrílico transparente con el cortador láser. La forma del infinito facilita gota formación de bicapa interfaz y la estabilidad.
2. Taladre un 1/16 en el agujero en el borde de la cámara de acrílico al pozo en forma de infinito. Repita en el lado opuesto. Corte un pequeño rectángulo partir de una lámina de acrílico 0,2 mm con tijeras o un cortador láser para servir como un fondo para los pozos.
3. Aplicar una capa fina pero completa de adhesivo de secado rápido a un lado de la de acrílico 0,2 mm y pegamento a la parte inferior de la cámara. Mantenga el acrílico 0,2 mm firmemente en su lugar contra la parte inferior de la cámara y dispensarel pegamento en la superficie para permitir que el pegamento para crear un sello, sino evitar que cubre el área de visualización. Asegúrese de alinear el acrílico de forma que su borde quede al ras con el borde de la pared de la cámara y cubre por completo la cámara de corte infinito. Esto permitirá suficiente para la penetración del chorro y evitar la fuga del pozo.
4. Corte dos pedazos pequeños de caucho natural para cubrir los agujeros perforados. Aplique el pegamento de secado rápido alrededor del agujero. Coloque la goma sobre el agujero y presione en todas las áreas, con un par de pinzas para asegurar. Repita el procedimiento para los dos agujeros perforados. Asegúrese de que todas las conexiones están pegadas juntas completos a fin de evitar cualquier fuga.
5. El uso de un 23 G, 1 en la aguja, hacer un agujero en la goma natural en ambos lados de la cámara para facilitar la inserción de la punta de inyección de tinta piezoeléctrica.

2. Preparación Experimental

Almacenar la solución de stock de lípidos en cloroformo en un -20 ° C congelador. Para este estudio, ya sea 1,2-diphytanose utilizó il-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC). 2 ml de 25 mg solución de lípidos / ml se prepara típicamente en este protocolo y se prolongará durante dos meses cuando se almacenan a -20 ° C.

1. Para resuspender el lípido en n-decano, primero transferir desde un vial de stock a un pequeño frasco de vidrio, y suavemente seco en atmósfera de argón o nitrógeno. Mantenga el frasco en un ángulo durante el secado para exponer más área de superficie para el gas, permitiendo que el lípido se seque más rápido.
2. Con la tapa de la jarra sólo ligeramente enroscada, permita que la solución se secó para sentarse en vacío en un desecador durante 1-2 horas. A continuación, añadir n-decano a resolubilizar el lípido en 25 mg / ml. Vórtice brevemente la solución de lípidos y someter a ultrasonidos en un baño de ultrasonido durante 15 min. Guarde el lípido se reconstituye en n-decano a -20 ° C.
3. Preparar una solución madre de sacarosa. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 900 l de sacarosa 300 mM y 100 lde 1% de metilcelulosa (MC). La metilcelulosa se añade para aumentar la viscosidad de la solución, que ayuda en la inyección. Paso opcional: Añadir un opcional de 1 l de colorante alimentario de color oscuro o perlas fluorescentes para dar más contraste o fluorescencia en proyección de imagen, respectivamente. Esta solución es una solución de 300 mOsm sacarosa diseñado para que coincida con la osmolaridad celular y para proporcionar contraste durante microjetting.
4. Dibuje la solución en una desechable 1 ml jeringa de plástico. Mientras sostiene la jeringa con la punta hacia arriba, encender el eje varias veces para expulsar las burbujas hacia la punta, y empuje el émbolo para expulsar el aire atrapado. Asegúrese de evacuar todo el aire de la jeringa antes de proceder, ya que interfiere con la contracción piezoeléctrico adecuado responsable de chorro.
5. Instalar un filtro de 0,22 micras en el extremo de la jeringa. Para evitar que el aire quede atrapado en el filtro, sostenga la jeringa vertical y empuje el émbolo hasta que una gota se forma encima de la punta. Nota: Un33 mm unidad de filtro de jeringa de diámetro fue encontrado para trabajar mejor, pero los filtros alternativos tan pequeño como un filtro de jeringa de 3 mm de diámetro se puede utilizar para reducir el volumen muerto.
6. Desatornillar el adaptador Luer hembra de la inyección de tinta, y de forma segura presione en su lugar sobre el extremo del filtro. De nuevo, expulsar el fluido para evitar que quede aire atrapado. Tornillo en la parte superior de la inyección de tinta. El fluido debe viajar a la punta de la inyección de tinta después de que esté completamente colocado.

3. Preparando el Equipo

1. El uso de un v-clamp, montar el conjunto de la jeringa en la platina del microscopio. Conecte el cable de la inyección de tinta para el controlador de inyección de tinta. Nota: Una etapa costumbre fue construido para este protocolo, mientras que el diseño de la etapa puede ser determinado por el usuario, es fundamental para tener un control xyz independiente de la jeringa y el control xy del soporte de la muestra.
2. Determinar el aumento y la combinación de lentes necesario para alcanzar la proyección de imagen deseada. Aquí se usa un objetivo de 10X y 10X ocular.
3. Utilice una cámara de alta velocidad (≥ 1.000 fps) para visualizar el chorro y la generación de vesículas. Antes de la proyección de imagen, realizar la calibración de la cámara es necesario. Utilizar la imagen basada en auto-disparo en el software de la cámara para iniciar la captura de imágenes.
4. Monte la cámara de infinito en la platina del microscopio. Asegure la cámara con cinta adhesiva en su lugar en el escenario.
5. Alinee con cuidado la punta de inyección de tinta con el agujero perforado en el caucho natural (ver Figura 1b). Para ello, llevar la inyección de tinta cerca de la cámara y ajustar la posición de los ojos, y luego hacer ajustes más precisos a través de la lente de un microscopio. Proceda con cautela, ya que los movimientos gruesos pueden dañar la punta de inyección de tinta.
6. Una vez que la inyección de tinta está alineado, una copia del conjunto de jeringa lejos de la cámara para evitar cualquier daño a la inyección de tinta durante la carga de los pozos. Asegúrese de que el movimiento de la inyección de tinta es unidireccional de modo que permanezca alineado con el orificio en la membrana.
7. Presione suavemente en la PLUNger del conjunto de jeringa hasta que se forma una pequeña gotita en la boquilla de inyección de tinta. Esto proporcionará algo de contrapresión inicial.
8. Introduzca los parámetros de chorro. Para una onda bipolar trapezoidal, utilice los siguientes parámetros: 20 kHz de frecuencia de pulso, tiempo 3 microsegundos aumento, 35 microsegundos de duración de pulso, 3 microsegundos de tiempo de otoño, 65 V de tensión aplicada (amplitud de pulso), y 100 pulsos por chorro de disparo (número de pulsos) . Sin embargo, la tensión aplicada (amplitud de pulso) y número de pulsos (pulsos de chorro por gatillo) se pueden variar para controlar el tamaño de vesícula.

4. Vesícula Generación

1. Añadir 25-30 solución de lípidos l en suspensión en n-decano a la cámara de infinito, que cubre la superficie completa de ambos pozos.
2. Añadir 25 l de glucosa (de la misma osmolaridad que la solución de sacarosa) hasta el borde más exterior de un pozo, pipetear lenta y suavemente. Tras la deposición, debe formar una gota de glucosa, debido a que la glucosa y la solución de lípidos no se mezclan. Añadir otra 251; l de glucosa para el bienestar opuesta, lo que hará que otra gota y formar la membrana de bicapa lipídica en el centro de la cámara dentro de 5-10 min.
3. Inserte la inyección de tinta a través del caucho natural, y con cuidado guíe hacia la bicapa interfaz de gota. Acércate a la bicapa lentamente, como la inyección de tinta introducida desplazará volumen y se puede romper la bicapa.
4. Cuando la inyección de tinta está dentro de ~ 200 micras, aplique el chorro con los ajustes que se describen en el paso 3.8. La distancia desde la bicapa puede variar principalmente en función del número de impulsos de voltaje y, entre otros parámetros. Este protocolo recomienda aumentar lentamente ajustes (voltaje y número de pulsos) y observar la deformación bicapa.

5. Limpieza del equipo

1. Separe el conjunto de la jeringuilla de la platina del microscopio, y disponer de la jeringa de plástico de 1 ml y filtrar.
2. Para limpiar la inyección de tinta, aspirar las siguientes soluciones en orden por inmersión de la punta en la soluciN 7-10x cada uno: etanol al 70%, solución Neutrad 2% en agua caliente, etanol al 70%, y ddH ₂ O. Si la inyección de tinta no se ajusta firmemente en la pipeta de aspiración, cortar una punta de pipeta para formar un adaptador.
3. Secar la cámara con el tejido. Coloque la cámara de infinito en un vaso de 250 ml con un 2% v / v Neutrad en agua caliente y déjelos en remojo durante 5-10 min. Después de ultrasonidos, secar bien los pocillos bajo aire comprimido. Cualquier humedad en los pocillos puede comprometer la estabilidad de la membrana de bicapa lipídica, por lo que también se recomienda que las cámaras se colocan en un horno a 60 ° C durante 15 min.

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Resultados

Hemos reunido una configuración de chorro de microfluidos en un microscopio de fluorescencia invertido convencional con una etapa de encargo montado a partir de piezas mecanizadas y manuales micrómetros (Figura 1). Caracterización de la inyección de tinta ofrece información sobre el proceso de generación de vesículas. La variación de la distancia entre la boquilla de inyección de tinta y bicapa lipídica afecta a la fuerza aplicada para causar la deformación de la membrana. Muy cercano a la bi...

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Discusión

Muchas técnicas se han desarrollado para la generación de vesículas, incluyendo electroformation, emulsión, y la generación de gotitas ^14-16. Sin embargo, las nuevas técnicas experimentales son necesarios para permitir el diseño de sistemas biológicos con la creciente similitud con los sistemas vivos. Métodos de microfluidos, en particular, han ofrecido un mayor nivel de control que rige unilamellarity membrana, monodispersidad de tamaño, y los contenidos internos ^17,18, con lo que los mo...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piezoelectric Inkjet	MicroFab Technologies	MJ-AL-01-xxx	xxx denotes orifice diameter in microns
Jet Drive III Controller	MicroFab Technologies	CT-M3-02
High-speed camera	Vision Research	MiroEX2
DPhPC lipid in chloroform	Avanti	850356C	Ordered in small aliquots in vials
33 mm PVDF filters, 0.2 µm	Fisher Scientific	SLGV033RS
1 ml Syringes	Fisher Scientific	14823434
n-Decane	Acros Organics	111871000
Glucose	Acros Organics	410950010
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903-1KG
Methylcellulose	Fisher Scientific	NC9084958
1/8 in Acrylic	McMaster Carr	8560K239	CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request
0.2 mm Acrylic	Astra Products	Clarex clear 001
Acrylic Cement	TAP Plastics	10693
Loctite 495 Superglue	Fisher Scientific	NC9011323
Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive	Strobels Supply	30765
Natural rubber	McMaster Carr	85995K14
Custom stage	homemade	N/A	CAD designs are available upon request