De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

Resumen

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Resumen

En la corteza de los mamíferos, las neuronas forman redes muy complicadas y el intercambio de información en las sinapsis. Los cambios en la fuerza sináptica, así como la adición / eliminación de sinapsis, se producen de una manera dependiente de la experiencia, que proporciona la base estructural de la plasticidad neuronal. Como componentes postsinápticos de las sinapsis excitatorias más en la corteza, las espinas dendríticas se considera que son un buen indicador de las sinapsis. Tomando ventajas de la genética del ratón y técnicas de marcaje fluorescente, neuronas individuales y de sus estructuras sinápticas pueden ser etiquetados en el cerebro intacto. Aquí presentamos un protocolo de imágenes transcraneal utilizando dos fotones microscopía de escaneo láser para seguir la etiqueta fluorescente espinas dendríticas postsináptica a través del tiempo en vivo. Este protocolo utiliza una preparación de cráneo adelgazado, que mantiene el cráneo intacto y evita efectos inflamatorios causados ​​por la exposición de las meninges y la corteza. Por lo tanto, las imágenes pueden ser adquiridas inmediatamente después dose realiza rgery. El procedimiento experimental se puede realizar de forma repetitiva durante diversos intervalos de tiempo que van desde horas hasta años. La aplicación de esta preparación también se puede ampliar para investigar diferentes regiones y capas corticales, así como otros tipos de células, en condiciones fisiológicas y patológicas.

Introducción

La corteza de los mamíferos participa en muchas funciones cerebrales, de la percepción sensorial y el movimiento de control de abstraer el procesamiento de información y la cognición. Varias funciones corticales se basan en diferentes circuitos neuronales, que se componen de diferentes tipos de neuronas que se comunican e intercambian información en las sinapsis individuales. La estructura y la función de las sinapsis están siendo modificados constantemente en respuesta a las experiencias y patologías. En el cerebro maduro, la plasticidad sináptica toma la forma de ambos cambios de resistencia y la adición / eliminación de sinapsis, que juega un papel importante en la formación y mantenimiento de un circuito neuronal funcional. Las espinas dendríticas son los componentes postsinápticos de la mayoría de las sinapsis excitadoras en el cerebro de los mamíferos. La constante rotación y los cambios morfológicos de las espinas se cree que servirá como un buen indicador de las modificaciones en las conexiones sinápticas ^1-7.

Dos fotones de escaneo láser microscopy ofrece una penetración profunda a través, preparaciones opacas gruesas y baja fototoxicidad, que lo hace adecuado para las imágenes en directo en el cerebro intacto ^8. En combinación con marcaje fluorescente, dos fotones de imágenes proporciona una poderosa herramienta para mirar en el cerebro vivo y siga reorganización estructural en las sinapsis individuales con alta resolución espacial y temporal. Varios métodos han sido utilizados para preparar los ratones para formación de imágenes en vivo ^9-13. Aquí se describe una preparación de cráneo adelgazado de imágenes in vivo de dos fotones para investigar la plasticidad estructural de las espinas dendríticas postsinápticos en la corteza del ratón. Con este enfoque, los estudios recientes han representado una imagen dinámica de los cambios de la espina dendrítica en respuesta a las habilidades motoras de aprendizaje Con el aumento de la disponibilidad de animales transgénicos con subconjuntos neuronales marcados con fluorescencia y el rápido desarrollo de las técnicas in vivo de etiquetado, los procedimientos similares a los descritos aquí se pueden aplicar también de investigaciónTE otros tipos de células y regiones corticales, en combinación con otras manipulaciones, así como se utiliza en modelos de enfermedad ^16-23.

Protocolo

Aprobación necesita ser obtenido de instituciones de origen antes del inicio de la cirugía y estudio de imágenes. Los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos de la Universidad de California, Santa Cruz Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

1. Cirugía

1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y esterilizar el área de trabajo con un 70% de alcohol a fondo antes de la cirugía.
2. Se anestesia el ratón por inyección intraperitoneal (IP) de solución anestésica KX (200 mg / kg de ketamina y 20 mg / kg de xilazina) de acuerdo con el peso corporal del ratón Nota:. Dosificación KX puede ser ajustado de acuerdo a la cepa, edad, y estado de salud de los ratones. También se recomienda la consulta veterinaria para determinar la dosis óptima.
3. Realice una prueba de toe-pinch periódicamente presionando los dedos del ratón y de la comprobación de una respuesta refleja para supervisar el estado de anestesia.Asegúrese de que el ratón esté totalmente anestesiado antes de iniciar la cirugía Nota:. Durante las sesiones de formación de imágenes prolongados, comprobar el estado de la anestesia del ratón periódicamente, administrar KX adicional si es necesario.
4. Coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura del cuerpo durante la cirugía.
5. Afeitarse la cabeza del ratón utilizando una hoja de afeitar para exponer el cuero cabelludo.
6. Esterilizar el área afeitada limpiando la piel con la alternancia de algodón con alcohol y betadine. Retire todos los recortes de pelo residuales.
7. Aplique suavemente ungüento para los ojos para lubricar los dos ojos, por lo tanto, la prevención del daño permanente causado por la deshidratación durante el experimento.
8. Hacer una incisión recta a lo largo de la línea media del cuero cabelludo, y mover la piel lateralmente hacia los bordes del cráneo.
9. Retire el tejido conectivo unido al cráneo.

2. Diluido-cráneo Preparación

1. Identificar la región de imagen basada en ster. coordenadas eotaxic Nota: Trate de evitar los grandes vasos sanguíneos, lo que la penetración de luz bloque y difuminar las estructuras proyectadas. Se observa mejor vasculatura cuando el cráneo es húmeda con solución salina estéril.
2. Utilice el micro taladro de alta velocidad para diluir una región circular de cráneo (0,5-1,0 mm de diámetro). Mueva el taladro paralelo a la superficie del cráneo, en vez de sostener contra el cráneo y presionando hacia abajo. Taladro hasta tanto la capa de hueso compacto exterior y la capa esponjosa media se eliminan Nota:. Para evitar daños causados ​​por el sobrecalentamiento, evitar el contacto prolongado entre la broca y el cráneo.
3. Continuar el adelgazamiento de la capa de hueso compacto interior con una cuchilla microquirúrgica en el centro de la región de perforación-adelgazado. Mantenga la cuchilla microquirúrgica en un ángulo de aproximadamente 45 ° para raspar el cráneo sin presionar hacia abajo contra el cráneo hasta que un afinado de manera uniforme pequeña región (200-300 micras de diámetro) con un espesor de aproximadase obtiene LY 20-30 micras. Debido a la auto-fluorescencia del cráneo, el espesor se puede medir mediante el escaneo de la distancia entre la superficie superior e inferior del cráneo bajo el microscopio de dos fotones Nota:. Aunque un espesor cráneo de menos de 20 micras proporciona una buena calidad de imagen, no es recomendable porque hace que el proceso de adelgazamiento en posteriores sesiones de re-proyección de imagen difícil. Para evitar el exceso de adelgazamiento, el espesor del cráneo necesita ser comprobada periódicamente durante la cirugía (ver Discusión).

3. Inmovilización

1. Retire con cuidado los restos de los huesos.
2. Coloque una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato en cada borde de la abertura central de la placa de cabeza estéril, que ha sido tratado en autoclave (véase la Figura 1). Mantenga la placa de cabeza firmemente contra el cráneo con la región adelgazada situado en el centro de la abertura Nota:. Si el pegamento contamina el R adelgazadaegión por accidente, retire con cuidado con la cuchilla microquirúrgica.
3. Tire suavemente de la piel de los lados del cráneo hasta los bordes de la abertura central de la placa de cabeza.
4. Espere aproximadamente 10 minutos hasta que la placa de cabeza está bien adherida al cráneo.
5. Coloque la placa de cabeza en dos bloques laterales de la placa de sujeción y apriete los tornillos en los bordes de la placa de cabeza para inmovilizar el ratón sobre la placa de sujeción (véase la Figura 1) Nota:. Asegúrese de que no hay piel o los bigotes entre la placa de cabeza y los bloques antes de apretar los tornillos. Una buena preparación inmovilizada no debe mostrar ningún movimiento observable del cráneo bajo el microscopio de disección cuando la parte posterior del animal se dio unos golpecitos suavemente.
6. . Enjuagar el cráneo expuesto con solución salina para eliminar el pegamento no polimerizado Nota: Es importante eliminar cualquier pegamento restante, como pegamento no polimerizado difumina las imágenes y los daños objetivos de microscopio <./ Li>

4. Imaging

1. Tome una foto de la vasculatura del cráneo expuesta con la región adelgazada como mapa 1, que se utiliza para la ubicación de la zona visualizada en las sesiones de formación de imágenes posteriores (véase la Figura 2).
2. Coloque el ratón bajo el microscopio de formación de imágenes. Ubicar la zona adelgazada bajo un objetivo de aire 10 veces usando epifluorescencia y mover el área más delgada para el centro de la vista.
3. Añadir una gota de solución salina en la parte superior del cráneo y cambiar a la objetivo 60X, que ha sido enjuagado con agua estéril. Seleccione una región donde las espinas dendríticas individuales están claramente visualizadas junto dendritas. Identificar y etiquetar la región correspondiente en el mapa 1 comparando vasculatura entre la vista de epifluorescencia y la foto vasculatura.
4. Sintonice la longitud de onda del láser de dos fotones de acuerdo con los fluoróforos. Por ejemplo, 920 nm para YFP; 890 nm para GFP; 1000 nm para DsRed y tdTomato ^24.
5. Adquirir pilas de imágenes con 2pasos micras a lo largo del eje z usando el objetivo 60X. Esta pila de imagen cubre un área de 200 x micras aproximadamente 200 micras (512 x 512 píxeles) y se utiliza como mapa 2 para el traslado durante las sesiones de formación de imágenes posteriores (véase la Figura 2).
6. Adquirir nueve pilas de imágenes en el mapa 2 se utiliza el zoom digital de 3X. Cada pila de imagen cubre un área aproximada de 70 m x 70 m (512 x 512 píxeles), con 0,7 m pasos a lo largo del eje z Nota:. La intensidad del láser debe estar por debajo de 40 mW cuando se mide en muestras para reducir al mínimo la fototoxicidad.

5. Recuperación

1. Tras las imágenes, separe con cuidado la placa de cabeza del cráneo.
2. Limpiar a fondo el cráneo y la piel para eliminar todo el pegamento restante Nota:. Cualquier pegamento que queda en la piel causará irritaciones y retrasar la cicatrización de la piel, mientras que el pegamento que queda en el cráneo provocará la erosión del cráneo y unngiogenesis en la capa de hueso recién crecido, por lo que la posterior reubicación y reconstrucción de imagen difícil.
3. Enjuague el cráneo y la piel con solución salina varias veces.
4. Suturar el cuero cabelludo con sutura quirúrgica estéril.
5. Mantenga al animal en una almohadilla térmica en una jaula separada. Administrar analgésico buprenorfina (0,1 mg / kg) por vía subcutánea para mitigar el dolor post-operatorio. Volver al animal a la jaula después de la recuperación completa. Vigilar estrechamente el animal (marque al menos una vez al día) hasta que la incisión haya sanado y se retiran las suturas. Administrar las inyecciones posteriores de buprenorfina analgésica si es necesario.

6. Creación de imágenes

1. Repita los pasos 1.1 a 1.8.
2. Repita los pasos 3.1 a 3.6
3. Localice región previamente fotografiado al comparar el patrón de vascularización a Mapa 1 y el patrón de ramificación dendrítica a Mapa 2.
4. Si se realiza la creación de las imágenes dentro de 1 semana, repita el paso 2.3 para quitar la fina capa de hueso recién crecido en la parte superior de la re adelgazadaregión utilizando la cuchilla microquirúrgica. Si reimaging se realiza después de más de 1 semana, repita los pasos tanto de 2.2 y 2.3 Nota:. La capa de hueso recién crecido consiste en una estructura menos condensada en comparación con la capa de hueso compacto original, que conduce a una menor calidad de imagen. Por lo tanto, para adquirir la misma calidad, es necesario diluir el cráneo ligeramente más de la sesión de formación de imágenes anterior.
5. Ajuste la posición y la orientación para obtener pilas de imágenes que coinciden previamente tomadas pilas de imágenes en el microscopio de dos fotones.
6. Adquirir imágenes como en el paso 4.6.
7. Repita los pasos 5.1 a 5.5 después de la impresión.

Resultados

En YFP-H línea de ratones ^25, proteína fluorescente amarilla expresa en un subconjunto de neuronas piramidales capa de V, que se proyectan sus dendritas apicales de las capas superficiales de la corteza. A través de la preparación de calavera adelgazado, los segmentos dendríticas marcados con fluorescencia pueden ser repetitivamente reflejados bajo el microscopio de dos fotones a través de varios intervalos de formación de imágenes, que van desde horas a meses. Aquí se muestra un ejemplo de una image...

Discusión

Para obtener una exitosa preparación de calavera adelgazado, varios pasos de este protocolo son cruciales. 1) El espesor del cráneo. El hueso craneal tiene una estructura de sándwich, con dos capas de hueso compacto de alta densidad y una capa intermedia de hueso esponjoso de baja densidad. Mientras que el micro taladro de alta velocidad es adecuado para la eliminación de las capas externas de hueso compacto y el hueso esponjoso, la cuchilla microquirúrgica es ideal para el adelgazamiento de la capa interior de hue...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Bioniche Pharma	67457-034-10	Mixed with xylazine for anesthesia
Xylazine	Lloyd laboratories	139-236	Mixed with ketamine for anesthesia
Saline	Hospira	0409-7983-09	0.9% NaCl for injection and imaging
Razor blades	Electron microscopy sciences	72000	Double-edge stainless steel razor blades
Alcohol pads	Fisher Scientific	06-669-62	Sterile alcohol prep pads
Eye ointment	Henry Schein	102-9470	Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant
High-speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area
Micro drill steel burrs	Fine Science Tools	19007-14	1.4 mm diameter
Microsurgical blade	Surgistar	6961	The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone
Cyanoacrylate glue	Fisher Scientific	NC9062131	Fix the head plate onto the skull
Suture	Havard Apparatus	510461	Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament
Dissecting microscope	Olympus		SZ61
CCD camera	Infinity
Two-photon microscope	Prairie Technologies		Ultima IV
10X objective	Olympus		NA 0.30, air
60X objective	Olympus		NA 1.1, IR permeable, water immersion
Ti-sapphire laser	Spectra-Physics		Mai Tai HP