La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridación en<em&gt; Xenopus</em

Resumen

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Resumen

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Introducción

The expression pattern of a specific gene is an important piece of information in determining the potential role for that gene in the development of a specific organ or cell type. Simply put, if it is not expressed at the right time and place it is unlikely to play a key role. In Xenopus, as in most early embryos, the most commonly used assay for detecting the expression of a gene is whole mount in situ hybridization using labeled antisense RNA probes. The use of antibody staining to assess expression of a gene in Xenopus is becoming more common as researchers discover antibodies, usually raised against mammalian proteins, that cross react to the Xenopus homologue or generate their own ^1-3. However, the vast majority of studies on Xenopus organogenesis still utilize antisense RNA probes. When antibodies are used, each individual antibody often requires optimization for the primary antibody concentration or fixation protocols. In contrast, the protocol for in situ hybridizations is essentially invariant for different probes. The basic concept is relatively simple and an excellent standard protocol has been well established ⁴. Our protocol is a streamlined version of the original protocol ⁴ that still provides excellent detection of gene expression patterns in the early embryo. The embryos are fixed and then prepared for hybridization by changing solutions and temperatures such that it allows for high stringency binding of the labeled antisense RNA probe to its target mRNA. The unbound probe is washed away and the embryos are then prepared for binding of an antibody against the label on the RNA probes. Excess antibody is then washed away and an enzymatic color reaction is used to localize where the RNA probe is bound in the embryo. There are now a number of Xenopus transgenic lines that drive expression of fluorescent proteins in specific tissues and these are available at the Xenopus stock centers such as the National Xenopus Resource in Woods Hole. While very useful for many experiments that require examining organogenesis in living embryos, this option requires separate housing for the transgenic lines.

In situ hybridization can clearly delineate where specific organs or cell types will form in the early embryo (Figure 1). The technique is remarkably sensitive given that one can detect gene expression in a small number of cells in a single embryo ⁵. However, in situ hybridization using the intensity of colorimetric staining is not considered quantifiable because the color reaction is not a linear one. Despite difficulty in quantifying staining intensity, changes in expression are often quite noticeable; particularly when the in situ hybridization shows quantifiable increases or decreases in the size of expression domains ^6,7.

The clear advantages of whole mount in situ hybridization make it a critical assay in the study of early development. However, it is a time consuming one that requires many steps over several days. This protocol is a simplified version of the standard protocol that eliminates several steps without reducing the quality of the in situ result. The simplification also eliminates sources of variability, making trouble shooting easier if an in situ hybridization is not optimal. Specifically, we have eliminated the use of proteinase K and RNAse treatments of the embryo, two steps that can depend on reagent quality and can also reduce signal intensity if overdone. The protocol also provides some degree of cost saving due to eliminating the use of several reagents. Finally, this protocol also provides some simple guidelines for improved capturing of images of in situ hybridization results. Although this protocol is optimized for work in Xenopus embryos, it is likely that at least some of the simplifications will be applicable to in situ hybridization work in other embryo systems.

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Protocolo

1. Preparación de embriones

1. Si no se hace rutinariamente como parte del cultivo de embriones, de-jalea los embriones utilizando 2,5% de cisteína, pH 8,0 antes de la fijación ^8. Aunque no es absolutamente necesario, es útil a continuación, quitar manualmente el sobre fertilización antes de la fijación utilizando unas pinzas finas.
   1. Utilice pipetas Pasteur de vidrio para transferir los embriones. La pipeta no es lo suficientemente amplia como para transferir los embriones a fin de utilizar una pluma de diamante para cortar la pipeta de vidrio en un punto lo suficientemente amplia como para recoger un embrión. Eliminar los bordes afilados de las pipetas después del corte pasando rápidamente la punta de corte a través de la llama de un mechero Bunsen para fundir los bordes afilados.
      NOTA: El cuidado necesita ser tomado, como el vidrio puede todavía ser lo suficientemente caliente como para causar quemaduras a pesar de que parece haber enfriado mediante inspección visual.
2. Realizar la fijación de embriones en etapas. En primer lugar, preparar viales de vidrio para su uso en la fijación del embrión. Utilice estos viales para todos los pasos incluidos definitivaalmacenamiento. Utilice viales que son claras con una buena junta de teflón en la tapa, lo que permite el seguimiento de los embriones durante todos los pasos del proceso. Etiquetar los viales con información experimental apropiado usando un marcador permanente y luego cubrir la etiqueta con cinta adhesiva transparente, ya que incluso marcador permanente se perderá en el curso del procedimiento debido a la utilización de alcoholes y otros disolventes.
   1. Utilice Mempfa para fijar los embriones. Hacer un stock de 8% de paraformaldehído en lotes de 50-100 ml a la vez. Utilice aproximadamente el 75% de la H ₂ O y se requiere calor a 50-60 ° C, la cual es necesaria para obtener el paraformaldehído en solución.
      NOTA: Esta solución es ligeramente diferente que el MEMFA utiliza en las versiones protocolo publicado de edad en que se utiliza paraformaldehído en lugar de formaldehído.
   2. Añadir 2-3 gotas de NaOH 10N o hasta que el pH es de aproximadamente 7,5 (papel de pH uso para comprobar pH). El paraformaldehido es muy tóxico, por lo tanto, generar la solución madre en una campana de humos. Una vez que el párrafoformaldehído está en disolución, filtrar la solución a través de papel Whatman en un recipiente fresco y añadir _H2O hasta el volumen final. Si es necesario, almacenar la solución de paraformaldehído al 4 ° C durante 1-2 semanas.
   3. Montar los componentes restantes de la solución de fijación Mempfa (Tabla 1). Asegúrese de que la concentración final de trabajo de paraformaldehído es del 4%. Guarde todos los componentes de la solución de fijación a 4 ° C como las acciones.
   4. Con una pipeta de cristal tallado, fijar los embriones mediante la adición de los embriones a los viales de vidrio etiquetados que se han llenado con los aproximadamente 3.4 ml de solución Mempfa (Tabla 1). Evite fijar más de 20 a 30 embriones por vial. Añadir los embriones con un mínimo de transferencia de líquido del medio de embrión. Fijar embriones en solución Mempfa durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
   5. Para estructuras endodermo finales de realizar el en situs en aislado manualmente la tripa y endodermo derivados ^9,10, Lo que permite una buena penetración de la sonda y también evita la tinción de la cavidad.
   6. Guarde una solución de metanol al 100% a -20 ° C. Después de la fijación de paraformaldehído, sustituir la solución Mempfa con aproximadamente 4 ml de la -20 ° C, 100% de metanol durante el almacenamiento de los embriones.
   7. Agitar los viales después de la adición del metanol para evitar que los embriones se pegue a la de vidrio o de otros embriones. También, asegúrese de que los viales se cierran herméticamente porque el metanol puede evaporarse en el congelador con el tiempo si suelta.
      NOTA: Los embriones se puede almacenar durante al menos un año, y probablemente más largo, en el metanol antes de la tinción sin pérdida de la calidad de hibridación in situ.

2. Preparación de la sonda

1. Utilice 1-2 g de ADN plantilla para hacer las sondas marcadas con digoxigenina. Cut plásmido que contiene la secuencia de ADN apropiada en el extremo 5 'del gen de interés con un enzima de restricción adecuado para That vector para generar sondas antisentido.
   NOTA: El plásmido debe tener un sitio de unión de ARN polimerasa apropiada (por ejemplo, T7, T3, o SP6).
2. Permitir que el ADN, el agua, mezclar y NTP tampón de polimerasa para calentar a temperatura ambiente antes de montar la reacción de síntesis de la sonda. Añadir los componentes de la reacción de síntesis de ARN a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en el orden que se enumeran en la Tabla 2. Ajustar el volumen de agua añadida para llevar el volumen total de la reacción de síntesis de la sonda a 20 l. Montar la reacción a temperatura ambiente ya que los componentes del tampón de la polimerasa pueden precipitar el ADN de la plantilla cuando se encuentra en altas concentraciones y frío.
3. Se incuba la reacción de transcripción durante 2 horas a 37 ° C.
   NOTA: Las incubaciones de poco más de dos horas conduce a efectos adversos, pero también muestran poco aumenta el rendimiento. Si se incubaron durante una hora, el rendimiento se reducirá, pero todavía suficiente para hacer una buena sonda.
   1. A la espera de la reacción de transcripción a fin, hacer un gel de agarosa que se utilizará para probar la calidad de la sonda. Derretir 1 g de agarosa en 100 ml de tampón 1x TAE (ver Tabla 1) por calentamiento de la solución a la temperatura de ebullición. Retire la solución del calor cuando el polvo de agarosa se haya disuelto completamente.
   2. Añadir 2 l de bromuro de etidio solución madre (10 mg / ml) a aproximadamente 100 ml de gel de agarosa cuando la agarosa se ha enfriado a aproximadamente 60 ° C para permitir la visualización de ARN bajo luz ultravioleta (UV).
      NOTA: Esta solución de gel de agarosa se puede mantener en una incubadora a 60 °, de modo que los geles futuras se pueden verter sin derretirse repetido. Tenga cuidado en el manejo de bromuro de etidio debido a la toxicidad potencial.
4. Añadir 1 l DNAsaI (RNasa libre de grado) a la reacción de transcripción después de la incubación de 2 horas y se incuba durante otros 10 min a 37 ° C para eliminar la plantilla de ADN.
5. Retire 1 l de la mezcla de reacción acomprobar en la agarosa TAE-gel 1% y el resto (20 l) añadir 80 l de SDS al 1% en tampón TE (10 mM Tris pH 8,0, EDTA 1 mM), 10 l de 5M NH ₄ de etilo y 220 l de etanol de frío. Vortex la mezcla vigorosamente y dejar de lado en hielo hasta que se conozcan los resultados de la verificación de la calidad del ARN.
   1. Ejecute los 1 l de ARN retirados antes de la precipitación en la agarosa-TAE gel 1%. Para facilitar la carga en el gel, añadir 4-5 l de agua y 1 l de colorante de carga estándar a la ARN. Ver el ARN en el gel usando un transiluminador de luz UV con el fin de comprobar la calidad de la sonda (véase la discusión).
6. Precipitar el ARN restante que fue anulada por el hielo en el paso 2.5 al girar en una microcentrífuga a toda velocidad durante 10 a 15 minutos. Trasvasar el sobrenadante con una pipeta de vidrio estirado hacia fuera y dejar secar brevemente.
   1. Resuspender la sonda con 1 ml de tampón de hibridación de ARN (Tabla 1) en el tubo eppendorf. Vortex y briefly calentar el tubo a 37 ° C y agitar de nuevo. Transferir la solución de la sonda a un 15 ml tornillo tubo de poliestireno tapa y rellene hasta 7-10 ml con tampón de hibridación de RNA. Nota: La sonda puede diluirse más (una dilución adicional de 10 veces todavía puede trabajar) a menudo resulta en una baja de fondo, pero las reacciones de tinción también llevará más tiempo.

3. Hibridación in situ

1. Tome los embriones que se almacenaron en -20 ° C metanol y se deja calentar a temperatura ambiente. Realice todo el procedimiento en los frascos de vidrio. Si diferentes embriones de un grupo van a ser examinado por diferentes sondas, mantenerlos en un solo vial hasta justo antes de añadir las sondas para reducir la variabilidad y el trabajo en el primer día.
   1. Rehidratar los embriones a través de una serie metanol como se indica en la Tabla 3 (véase la Tabla 1 para las recetas de lavado) en preparación para la adición de la sonda. Agite suavemente el embryos después de cada cambio para asegurarse de que no se adhiera a las paredes o entre sí, y el rock los embriones mediante el montaje de los viales en un nutator. Al transferir los líquidos, compruebe el interior de las tapas para asegurarse de que los embriones no han sido atrapados allí.
   2. Una vez en la solución de la sonda, hibridar los embriones durante la noche como se describe en la Tabla 3.
2. Retire la solución de la sonda. Guarde la sonda utilizada mediante el almacenamiento en unos 15 ml tornillo tubo de poliestireno tapa, se indica la fecha y el número de veces que la sonda se ha utilizado, a -20 ° C.
   NOTA: La misma sonda se puede reutilizar muchas veces para su posterior hibridaciones in situ hasta que las reacciones colorimétricas comienzan a tomar un tiempo anormalmente largo para llegar a la intensidad deseada.
   1. Una vez que se quita la sonda, la preparación de los embriones para la tinción de anticuerpos contra la sonda a través de la serie de lavados descritas en la Tabla 4. Cambiar la temperatura según sea necesario (Tabla 4) por t moverél nutator, con viales de embriones adjuntos, directamente en hornos de hibridación que se establecen en la temperatura adecuada.
   2. Completar el volumen apropiado del MAB + HTS + BR + contra Dig-anticuerpo (Tabla 4) en el momento en que los embriones se incuban en el MAB + HTS + BR solución de bloqueo para que el anticuerpo se bloquea antes de añadir a la embriones. Hacer las soluciones de bloqueo fresco en el día de uso.
3. Retirar la solución de anticuerpo y comenzar lavados como se indica en la Tabla 5 después de la incubación durante la noche con anticuerpo. Realizar al menos doce 30 min lavados con el fin de preparar para la tinción con el sustrato de fosfatasa alcalina y reducir el fondo tanto como sea posible. Utilice búfer MAB o solución OTC (Tabla 1) para los pasos de lavado.
   NOTA: la solución OTC es TTW que tiene 2 mg / ml de BSA.
   1. Sustituir la última solución de lavado con el sustrato de la fosfatasa alcalina púrpura BM. Realice los reac tinciónya sea en la temperatura ambiente o 37 ° C.
      NOTA: La tinción es más rápida a 37 ° C pero si se deja durante la noche, la tinción de fondo inaceptable a menudo puede ser el resultado. Las reacciones de tinción a menudo requieren tinción durante la noche y la temperatura ambiente es más seguro para esto.
   2. Si se requiere mayor tinción y la solución púrpura BM está adquiriendo un color azul, sustituir la solución de tinción con frescos BM púrpura y poner los tubos en 37 ° C. Si el ARNm diana es muy abundante, poner los embriones en la solución de tinción a 4 ° C durante la noche y luego pasar los embriones a temperatura ambiente o 37 ° C para permitir un mejor seguimiento de la reacción de tinción.
   3. Supervisar nuevas reacciones con cuidado, ya que el tiempo de resultado final varía considerablemente entre los diferentes ARN diana. Por coherencia, detener la reacción de tinción (véase 3.4) cuando no hay nuevos sitios de expresión que surge con incubación más largo. Es importante destacar que, si la hibridación in situ se utiliza como un ensayopara los experimentos que buscan en diferentes grupos de tratamiento, utilizar el mismo tiempo para reacciones de color entre el tratamiento y control de los embriones.
4. Detener la reacción de tinción y preparar los embriones para el almacenamiento y grabación de imagen cambiando los líquidos tal como se indica en la Tabla 6. No balancee los embriones en esta etapa debido a la eliminación de la mancha puede ser visualizado como coloración violeta del metanol alrededor de los embriones.
   NOTA: A menudo los embriones tienen una tinción con azul de luz de la solución de tinción y el metanol frío puede eliminar al menos parcialmente que, aunque esto no es suficiente para eliminar el fondo pesado o tinción de la cavidad. Metanol frío se refiere a metanol que se mantiene en un congelador a -20ºC.
   1. Rehidratar los embriones y fijar la mancha con Mempfa (Tabla 6). Una vez fijada, retire el Mempfa y lavar los embriones con 25% de metanol.
   2. Retire el metanol 25% y añadir la solución de blanqueo si la eliminación de pigmento endógenose requiere. Tenga cuidado en el manejo de la solución de blanqueo, ya que puede causar quemaduras. Observe el blanqueo de cerca como sucede con relativa rapidez y el grado de blanqueo se puede variar para diferentes efectos (Figura 2).
   3. Deshidratar embriones a través de una serie de metanol al 100% de metanol durante el almacenamiento a largo plazo después de blanqueo, o transferir a PBS para el almacenamiento a corto plazo y la imagen posterior (ver Tabla 6).

4. Imaging embriones

1. Una vez que un embrión se ha completado el proceso de tinción, imagen del embrión para que se captura la información en que se expresa el gen de interés para un público más amplio. Use 1% de agarosa como fondo para ver los embriones no despejadas.
   NOTA: La agarosa da un fondo azul / gris que contrasta con el embrión y el color azul de la reacción de tinción. También ayuda a difundir sombras molestas y reflexiones que desvían la atención del embrión.
   1. Añadir agarosa al agua y luego llevar a ebullición hasta que la agarosa se encuentra en solución y luego dejar enfriar a 50 antes de verter en la placa de Petri. Al igual que con la solución de gel TAE, almacenar la solución de agarosa en 55 ° C incubadora para múltiples usos. Verter la agarosa a una profundidad de aproximadamente 2 mm en la placa de Petri. Si es necesario, ajustar la profundidad de agarosa para producir un tono ligeramente diferente de la de fondo.
   2. Después de la rehidratación del almacenamiento en metanol a una solución acuosa (PBS o TTW), utilizando una serie de metanol, colocar los embriones en una placa de Petri con la base de agarosa (véase la Tabla 6). Mantenga la solución limpia y, si es necesario, utilizar el filtrado sencilla para eliminar pequeñas partículas que pueden perturbar el fondo limpio de buenas imágenes.
   3. Para la imagen de los embriones de los puntos de vista alternativos, como desde el lado ventral, cortan canales delgados en la agarosa para encajar el embrión utilizando unas pinzas finas y colocar los embriones en esos canales para la orientación (Figura 3 ). Tenga cuidado en la manipulación de los embriones, ya que se dañan fácilmente.
      NOTA: La mayoría de etapas tienen una posición característica que asumen cuando se coloca en solución. Por ejemplo, los embriones blástula etapas tienden a sentarse animales hacia arriba. Una vez que los embriones comienzan a alargarse, ponen de su lado.
2. Utilice la fuente de luz de fibra óptica para iluminar el embrión a partir de un ángulo pequeño, la creación de sombras sobre el embrión que proporcionan profundidad a la imagen y ayudar a discernir estructuras superficiales. Debido a que el blanqueamiento puede eliminar pigmento que proporciona puntos de referencia útiles, utilizar sombreado para los embriones fuertemente blanqueados.
3. Desactive los embriones a tinción imagen que es profundo dentro del embrión, como en la notocorda, pulmón, o regiones del cerebro, (Figura 4). Para lograr esto, poner los embriones a través de una serie metanol hasta en 100% de metanol.
   1. Después de la inmersión completa en metanol, transferir los embriones a una solución de una parte de alcohol bencílico y dos partes de bencilo sernzoate (BABB). Los embriones flotan inicialmente en la superficie, pero como el metanol se mezcla con el Babb, se hundirán en el BABB. Realice cada paso se trata de BABB en viales de vidrio o platos; BABB derretirá cualquier plástico o pintura.
   2. Una vez aclarado, ver los embriones con luz transmitida procedente de debajo del embrión. Ajustar la intensidad de la luz, así como el ángulo desde abajo para mejorar el contraste y proporcionar el mejor color.
   3. Al ver embriones despejadas plantean la placa de Petri de vidrio fuera de la base. Para ello, simplemente usando otros dos tapas de los recipientes de Petri para elevar de modo que la región de la placa con los embriones está elevada.
      NOTA: Esto tiene la ventaja de tomar la base fuera de foco y la eliminación de efectos de distracción de imperfecciones o manchas en la base del microscopio que puede interferir con la imagen.

5. Haga doble Hibridación in situ

1. Con el fin de ver simultáneamente el patrón de expresión de two diferentes genes en un solo embrión, sintetizar dos sondas, una para cada uno de los diferentes genes. Sintetizar una sonda utilizando DIG-11-UTP como una etiqueta como se describe anteriormente. Diluir el producto de la reacción de transcripción de ARN en tampón de hibridación para producir una sonda más concentrado 3x que se utiliza para una sola hibridaciones in situ.
   1. Sintetizar la otra sonda de interés utilizando el mismo protocolo que para DIG etiquetados sondeó excepto que fluoresceína-12-UTP debe ser sustituido por DIG-11-UTP. Diluir el producto de la reacción de transcripción de ARN en tampón de hibridación para producir una sonda más concentrado 3x que se utiliza para una sola hibridaciones in situ.
   2. Mezclar las dos sondas concentradas en una relación 1: 1. Para obtener los mejores resultados, utilice la sonda marcada con fluoresceína para el gen que muestra la expresión más fuerte en el único en el protocolo de hibridación in situ.
2. Utilice el mismo en el protocolo de hibridación in situ descrito por solo in situ </ Em> hibridaciones, excepto usar el doble de la sonda (sonda que contiene la mezcla de 1,5x concentrado de sondas marcadas con digoxigenina y marcados con fluoresceína) en el extremo de la primera día en lugar de en una sola sonda de hibridación in situ.
   1. Siga el protocolo de hibridación solo en el segundo día del doble en el protocolo de hibridación in situ, excepto fragmentos uso antifluoresceína-AP Fab en una dilución 1: 4000 en lugar de fragmentos anti-DIG-AP Fab. Lavar el exceso de anticuerpo a partir del embrión como en el único en el protocolo situ y llevar a cabo la primera reacción de color utilizando el sustrato BM-púrpura AP.
3. Después de la primera reacción de color, inactivar el anticuerpo fluoresceína en glicina 0,1 M pH 2,0 durante 40 min seguidos por cinco de diez min lavados en MAB. Bloquear los embriones en el MAB + HTS + BR durante 90 min. Añadir el anticuerpo anti-DIG a una dilución 1: 2000 en el MAB + HTS + BR y se incuba a 4 ° C durante la noche.
   1. Al día siguiente, lavar los embriones XXoroughly en el MAB (12 lavados de 30 min) para eliminar el exceso de anticuerpo.
   2. Lavar los embriones durante 10 min en tampón de AP (Tabla 1) y luego teñir con BCIP (0,5 mg / ml en tampón de AP).
      NOTA: El combinado situ deberían dar una coloración azul-púrpura oscuro para la primera reacción de color y una reacción de color azul claro para el segundo (Figura 5).
   3. Detener la reacción de color final mediante la eliminación del tampón de AP y enjuagar tres veces con MAB. Fijar los embriones con Mempfa durante 10 min. Lave los embriones con 5 lavados rápidos en el MAB o OTC.
   4. Con esta combinación de colores, el uso de metanol en los tratamientos de tinción posterior ya no es posible, ya que elimina el color solo BCIP. Almacenar los embriones después de la tinción y fijación en PBS con 0,02% de azida de sodio. Intensidad de la tinción puede ser débil con doble en situs. Si esto es un problema, reducir los lavados a cuatro, cada uno de 2 hr duración.

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Resultados

El uso de sondas específicas de tejido puede proporcionar información relevante en cuanto a la situación del desarrollo de órganos específicos. En los siguientes ejemplos, la etapa del embrión se basa en la tabla de etapas Nieuwkoop y Faber ^11. Si uno utiliza genes forman sondas expresadas después de la diferenciación, la troponina I cardiaca en etapa de 28 a 30, por ejemplo (Figura 1C), la presencia o el tamaño de un órgano diferenciado se pueden evaluar en cualquier difer...

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Discusión

La capacidad de utilizar la hibridación in situ para visualizar el patrón de expresión de genes específicos sigue siendo el método más comúnmente utilizado para identificar órganos específicos o tipos de células en el embrión de Xenopus. Esto es debido a varias ventajas ofrecidas por esta técnica. La expresión de un gen puede identificar estructuras específicas así antes de cualquier signo histológico de diferenciación como es el caso para la expresión nkx2.5 en los progenito...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labguake Tube Shakers	VWR	17-08-2011
VWR Vials	VWR	10-07-2012
L-Cysteine	BioShop	CYS342.500
Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM	Roche	11277057001
Digoxigenin-11-UTP	Roche	11209256910
Rnase inhibator (Rnase OUT)	Invitrogen	10777-019
T7 RNA Polymerase	Fermentas	EPO111
T3 RNA Polymerase	Fermentas	EPO101
SP6 RNA Polymerase	Fermentas	EPO131
Dnase 1	Invitrogen	18047-019
Sheep Serum	Wisent	31150
Blocking reagent	Roche	11096176001
BM purple Ap Substrate	Roche	11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments	Roche	11093274910
Methanol	VWR	CAMX0485-7
NaCl	BioShop	SOD002.10
SDS	EM	7910
EDTA	BioShop	EDT001.500
Tris	BioShop	TRS003.5
Tween-20	EM	9480
MgSO4	Sigma	M-2643
Mops	BioShop	MOP001.250
EGTA	Sigma	E-3889-25G
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.500
Formamide	VWR	CAFX0420-4
RNA	Roche	10109223001
Maleic Acid	VWR	CAMX0100-3
tri-Sodium Citrate	BioShop	CIT001
Hydrogen Peroxide (30% Solution)	EM	HX0635-2
BSA	BioShop	ALB001.100
PVP-40	ICN	195451
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10
Benzyl Alcohol	Sigma	B-1042
Benzyl Benzoate	Sigma	B-6630
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500