La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejidos<em&gt; In Situ</em

Resumen

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Resumen

Los estudios realizados en Drosophila melanogaster embriones y larvas proporcionan información fundamental en los procesos de desarrollo, tales como la especificación del destino celular y la organogénesis. La inmunotinción permite la visualización de desarrollo de tejidos y órganos. Sin embargo, una cutícula protectora que se forma en el extremo de la embriogénesis impide la penetración de los anticuerpos en embriones de fase tardía y las larvas. Mientras que la disección antes de la inmunotinción se utiliza regularmente para analizar los tejidos larvarios Drosophila, resulta ineficaz para algunos análisis porque los tejidos pequeños pueden ser difíciles de localizar y aislar. La sonicación proporciona una alternativa a la disección en los protocolos de inmunotinción Drosophila larval. Permite la rápida tramitación y simultánea de un gran número de embriones en etapa tardía y larvas y mantiene en la morfología situ. Después de la fijación en formaldehído, se sometió a ultrasonidos una muestra. Muestra a continuación, se somete a inmunotinción con la hormiga primaria específica de antígenoibodies y secundaria de anticuerpos marcados con fluorescencia para visualizar los tipos de células diana y proteínas específicas mediante microscopía de fluorescencia. Durante el proceso de sonicación, la colocación apropiada de una sonda de sonicación encima de la muestra, así como la duración y la intensidad de la sonicación, es crítico. Modificaciones menores Adicionales a los protocolos de inmunotinción estándar pueden ser necesarios para las manchas de alta calidad. Para los anticuerpos con baja relación señal a ruido, los tiempos de incubación más largos son típicamente necesario. Como una prueba de concepto para este protocolo de tratamiento con ultrasonidos-facilitado, mostramos inmunotinciones de tres tipos de tejidos (testículos, los ovarios y los tejidos neuronales) en una serie de etapas de desarrollo.

Introducción

Embriones y larvas de Drosophila proporcionan un excelente modelo para estudiar los procesos de desarrollo en muchos órganos y tejidos. Obtención de imágenes de células individuales es a menudo necesario en estos estudios a fin de determinar los entornos complejos en los que se desarrollan las células. Visualización de las células en los tejidos se puede lograr mediante inmunotinción. Bueno-describen inmunotinción existen protocolos para tejidos embrionarios de Drosophila <17 h después de la puesta de huevos (AEL) ^1-3. Sin embargo, una protección formas cutícula hacia el final de la embriogénesis, la prevención de la permeación de anticuerpo eficaz. Por lo tanto, estos protocolos de inmunotinción son ineficientes en el análisis de los tejidos en embriones de la última etapa y en etapas posteriores de desarrollo de las larvas (1 ^st estadio (L1), 2 ^nd estadio (L2), y 3 ^º estadio (L3)). Esta ineficiencia impone una barrera para nuestra comprensión de los procesos dinámicos que ocurren durante este período de desarrollo prolongado ^4. Tissdisección ue es una técnica ampliamente utilizada para eludir esta barrera ^5-7. Sin embargo, la disección puede resultar ineficaz. La extracción puede ser gravado por la dificultad en localizar o aislar embriones y tejidos larvarios. Por otra parte, la eliminación física de los tejidos diana puede causar daño rompiendo ellos o al no extraer en su totalidad.

La sonicación es un método que emplea ondas sonoras para perturbar las interacciones intermoleculares. Se ha utilizado para interrumpir la integridad de la cutícula de las larvas de Drosophila con el fin de inmunotinción desarrollo de tipos de células neuronales ^6. Este protocolo ha sido adaptado a inmunotinción de embriones en etapa tardía y las gónadas de larvas, que pueden ser tan pequeñas como 50 micras de diámetro ^8-10. A través de estos estudios, el proceso de células madre de línea germinal (GSC) formación nicho macho se ha caracterizado en la etapa tardía embriones de Drosophila ^8-10 y los mecanismos que regulan el desarrollo de células madre y el DIFdiferencia- en la etapa tardía gónadas embrionarias y las larvas se han dilucidado ^9-12. Por lo tanto, sonicación proporciona una alternativa eficiente para la disección de tejidos que puede ser difícil debido al tamaño del tejido. Además, permite la inmunotinción de tejidos de Drosophila in situ, dejando a las células en el contexto de todo el organismo y mantener en la morfología situ. A continuación, describimos un protocolo paso a paso para la fluorescencia inmunotinción de la última etapa embrionaria hasta principios / mediados de los tejidos L3 in situ. Análisis de Drosophila gonadal y neural tejido se muestra en los resultados representativos para demostrar la eficacia de este protocolo. Además, este protocolo de inmunotinción puede estar adaptado para analizar otros tejidos de Drosophila, así como en otros organismos tejidos con una cutícula externa.

Protocolo

1 Preparación de una jaula de Colección

1. Anestesiar jóvenes, moscas fértiles con CO _2. Transferencia moscas anestesiados a una jaula. Para obtener un rendimiento óptimo, utilice 100-120 moscas adultas que van de 2-7 días de edad en una proporción de 4: 1 de mujeres a hombres. Permitir moscas un período de aclimatación apropiada, ~ 24 horas antes de la obtención de la muestra para la fijación. Si la jaula se creó con hembras vírgenes se aparearon con machos, un uso un 36 - periodo de aclimatación de 48 horas.
2. En el extremo libre de la jaula, coloque una placa de agar de zumo de manzana preparado previamente con una gota tamaño de una moneda de la pasta de levadura en el centro sobre la abertura de la jaula. A continuación, fije con cinta adhesiva. Sellar la unión entre la placa de agar de zumo de manzana y la jaula con Parafilm.
3. Coloque la jaula en un recipiente secundario con placa de agar jugo de manzana como la base y permitir que las moscas para reproducir a una temperatura definida durante un período adecuado de tiempo determinado por el experimento.
   Nota: Los tiempos de recogida de muestras will variar. Por ejemplo, en la recogida de embriones en fase tardía / larvas L1 precoz (17 - 24 horas), permitirá a las moscas ponen sus huevos en placas de agar de jugo de manzana durante 7 horas a 25 ° C antes del envejecimiento de la muestra durante 17 horas a 25 ° C. Del mismo modo, para una colección de larvas de primer instar a mediados-finales (36 - 48 hr) permiten a las moscas ponen huevos durante 12 horas a 25 ° C antes del envejecimiento de la muestra durante 36 horas a 25 ° C.
4. Una vez que el período de tiempo es completa, puntee en la jaula en una mesa para que las moscas caen fuera de la placa de agar jugo de manzana sin anestesia. Colocar inmediatamente la placa utilizada por una nueva que contiene una gota de pasta de levadura. Asegure la placa fresca con cinta y parafina y almacenar la jaula con placa de agar jugo de manzana como base.
5. Retire con cuidado la caída de la levadura de la placa utilizada con una espátula de metal. Coloque la tapa en la placa de jugo de manzana se utiliza y permitir embriones puso a la edad si experimentalmente necesario.
   Nota: Si bien el envejecimiento muestras, placas pueden almacenarse a 25 ° C menos que las temperaturas más altas son ExperimentaLLY necesario. Ejemplos de cómo los embriones para la recolección se ha descrito anteriormente la edad (ver nota para el paso 1.3). La eliminación de pasta de levadura antes de probar el envejecimiento se realiza para evitar que las larvas de meterse en la levadura y romper el agar debajo. El residuo agar jugo de manzana y pasta de levadura restante proporcionan nutrientes para el crecimiento de las larvas. Mientras que los embriones fijados directamente en la pasta de levadura se pierden a través de la eliminación de pasta de levadura, esta pérdida es preferible a la levadura y agar residuo de la muestra que puede reducir la eficiencia de la tinción. Si uno elegir no eliminar la pasta de levadura, la levadura puede ser licuado con tampón fosfato Triton X-100 (PbTx), mezclado con un pincel, y luego se retira de la muestra con un filtro de células antes de la fijación.

2. Fijación

1. Una vez que los embriones fijados sobre la placa de agar jugo de manzana han envejecido hasta el punto de tiempo deseado, use un pincel pequeño humedecido con tampón fosfato Triton X-100 solución (PbTx) para quitar cuidadosamente la muestra de jue plato.
   Nota: Las larvas más viejas son móviles y puede gatear en el interior de la tapa. Esta muestra se puede recoger de manera similar por la eliminación con un pincel.
2. Limpie el pincel-muestra cargado contra la arista interior-frente de un filtro celular. Luego, enjuague las paredes del colador y el pincel con una botella con atomizador que contiene solución PbTx. Coloque una cubierta de placa de Petri debajo del filtro para capturar la solución PbTx.
3. Después de toda la muestra se ha transferido al colador, vierta suficiente PbTx en el colador para elevar la muestra fuera de la malla. A continuación, levante el colador y verter el contenido de la placa de Petri en un contenedor de residuos líquidos.
4. Repita el paso 2.3 tres veces para eliminar la levadura y los residuos que puedan haber sido transferido junto con la muestra vuelan.
5. Vierta suficiente 50% de lejía (NaOCl) / agua _(ddH2O) solución en el colador para elevar las larvas fuera de la malla. Permita que las larvas que se siente en la solución durante 5 minutos. Luego, levante el colador y verter tque el contenido de la placa de Petri en un contenedor de residuos líquidos.
   Se requiere Bleach sólo en las muestras embrionarias de edades comprendidas 0-22 hr a fin de eliminar la membrana coriónica: Nota. La aplicación de cloro para muestras de mayor edad se puede omitir, pero su inclusión no es perjudicial. Si se desea omisión, sustituya la lejía en este paso con PbTx. Lejía diluida debe utilizarse dentro de las 24 horas de preparación de la solución.
6. Lavar la muestra en el colador con PbTx vertiendo suficiente PbTx en el colador para elevar la muestra fuera de la malla. Permita que la muestra que se siente en la solución durante 3 min. A continuación, levante el colador y verter el contenido de la placa de Petri en un contenedor de residuos líquidos.
7. Repita el paso 2.6 de cinco veces.
8. Frote la parte inferior del filtro celular seco, a continuación, transferir la muestra a un vial de centelleo que contiene 1,75 ml de solución PEMS usando un pincel.
9. Trabajar en una campana de humos con ventilación, añadir 250 l de formaldehído al 37% y 8 ml de heptano grado reactivo en el vial de centelleo.
   Nota: El formaldehído y el heptano son peligrosos. Por razones de seguridad, seguirá trabajando en una campana extractora ventilada y usar guantes apropiados para los pasos 2.9 a 3.3.
10. Dejar que el vial agitar a 200 rpm o velocidad moderada similar para 20 min.
11. Añadir 10 ml de metanol para vial de centelleo sin la eliminación de la fase acuosa anterior y permitir que el vial para agitar vigorosamente a 500 rpm durante 1 min.
    Nota: El metanol es peligroso. Continuar trabajando en una campana extractora bien ventilada y use guantes adecuados.
12. Retire el vial de agitador e inmediatamente vierta el contenido en un filtro de células sobre un recipiente de residuos líquidos en la campana. Añadir metanol adicional para el vial y ejecutar a través del filtro como sea necesario para asegurar que todos célula de muestra se ha eliminado.
    Nota: coladores celulares pueden drenar lentamente. Para remediar esto, tocar un tejido de laboratorio para la parte inferior del filtro de células a fin de extraer la solución a través del filtro más rápidamente. El metanol, formaldehído, y heptano debería seralmacenada en contenedores para residuos apropiados hasta la eliminación adecuada según las directrices institucionales.
13. Fondo seco del filtro de células utilizando un tejido de laboratorio, a continuación, utilizar un pincel para transferir la muestra capturada en el colador a un tubo de 1.5 ml contiene 0,5 ml de metanol.
    Nota: Si hay varios viales de centelleo están en uso, complete los pasos 2.12 y 2.13 un vial a la vez para evitar que la muestra se seque en células coladeras.
14. Una vez que la muestra se ha añadido al tubo de microcentrífuga, eliminar el metanol con una pipeta. Asegurar la muestra ha depositado en el fondo del tubo.
15. Enjuague muestra en el tubo de microcentrífuga mediante la adición de aproximadamente 0,5 ml de metanol al tubo. Espere a que la muestra que conformarse entonces eliminar el metanol con una pipeta.
16. Repita el paso 15 de tres veces.
17. Añadir 0,5 ml de metanol en el tubo, y luego almacenar en un congelador -20 ° C para su uso posterior.

3. Rehidratación y Preparación de la muestra para la inmunotinción

1. Eliminar el metanol desde el tubo de microcentrífuga con una pipeta, dejando la muestra en el tubo. Tienda metanol residuos al contenedor de desechos apropiado hasta el momento de su eliminación adecuada.
   Nota: Para mejorar la eficiencia de tratamiento con ultrasonidos, utilizan no más de 3 mm de la muestra se establecieron en la parte inferior del tubo de 1.5 ml. El exceso de muestra puede ser transferida a un tubo separado con una pipeta antes de comenzar la etapa de rehidratación anteriormente. Cortar la punta de la pipeta con una cuchilla de afeitar limpia se puede utilizar para prevenir la obstrucción de la punta de pipeta.
2. Añadir 1,0 ml de una / tampón fosfato Tween (PBTw) solución de metanol 50% al tubo y de la roca durante 3 min.
3. Eliminar la solución de metanol al recipiente de desechos adecuado y enjuague con 1,0 l de PBTw dos veces. Después de cada enjuague dejar que la muestra se asiente antes de sacar fuera de la PBTw con una pipeta.
4. Añadir 1,0 ml de albúmina de suero bovino / Phosphate Buffered Tween (BBTw) mezclar al vial y el rock. Después de 3 minutos en un agitador, permitir que el sample se asiente y retire la BBTw con pipeta.
5. Repita el paso 3.4 dos veces, teniendo cuidado de eliminar la mayor cantidad BBTw como sea posible sin perder la muestra después del último lavado.
6. Añadir 0,5 ml de BBTw al tubo y colocar el tubo en hielo.

4. La sonicación de la Muestra

1. Ajuste el aparato de ultrasonidos a 10% de la amplitud máxima y designar un tiempo de ejecución de sonicación constante 2 seg.
   Nota: Estos ajustes son específicos para el aparato de ultrasonidos se indica en los materiales y equipos Mesa y pueden requerir de optimización para diferentes sonicadores.
2. Antes de la sonicación de la muestra, limpiar la sonda de ultrasonidos mediante la colocación de la punta de la sonda en un tubo cónico de 50 ml lleno de agua desionizada y ejecutar sonicador para limpiar la sonda. Sonda de ultrasonidos en seco con papel de laboratorio después de la ejecución.
3. Sumergir la sonda en el tubo de microcentrífuga que contiene la muestra de modo que se sitúe aproximadamente 3 a 4 mm por encima de la muestra y empezar a sonicación.
4. Retire la microcentrifuge tubo y colocarlo en hielo durante al menos 30 segundos para disipar el calor de sonicación y permitir que la muestra se asiente en la parte inferior del tubo de microcentrífuga.
5. Repita los pasos 4.3 y 4.4, según sea necesario por motivos de edad de la muestra que se está procesando.
   Nota: Para obtener el volumen de muestra sonicación óptima, los embriones menos de 17 horas, no requieren tratamiento con ultrasonidos, pero aquellos entre 17 y 24 horas (etapa 17 / early-L1) requieren dos sonicaciones. Las larvas entre 24 - 36 (a principios / mediados de L1), 36 - 48 (mediados / finales-L1), 48 - 60 (a principios / mediados de L2), 60 - 72 (mediados / finales-L2), 72-84 ( principios-L3), 84-96 (principios / mediados de L3), 96-108 (mediados / finales-L3) hr requieren 5, 9, 11, 13, 15, 18, y 22 sonicaciones respectivamente. Véase la discusión para más explicaciones sobre los tiempos de sonicación.
6. Enjuague con 1,0 ml BBTw dos veces. Después de cada enjuague dejar que la muestra se asiente antes de sacar fuera BBTw con una pipeta.
7. Añadir 1,0 ml de BBTw al vial y el rock. Después de 3 minutos en el balancín, dejar que la muestra se asiente y retire la BBTw con pipeta.
8. Repita el paso 4.7 dos veces.

5. Inmunoticción

1. Bloque de muestras mediante la adición de 5% de suero normal diluida en BBTw al tubo de microcentrífuga. Retire el bloque después de balanceo durante 1 hora.
   Nota: Utilice el suero normal de la especie en la que se generan los anticuerpos secundarios.
2. Diluir anticuerpos primarios para apropiarse de la concentración de trabajo en solución / BBTw suero normal de 5%.
3. Muestra de la roca en la solución de anticuerpo primario O / N a 4 ° C o por lo menos durante 3 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C.
   Nota: Los tiempos de incubación de anticuerpos y las temperaturas pueden variar. O / N de incubación a 4 ° C o 3 horas a RT es típicamente suficiente. Sin embargo, un período de incubación de dos días puede mejorar la calidad de la tinción, especialmente con muestras mayores o cuando se utilizan anticuerpos primarios de baja afinidad. Incubaciones más largas se realizan normalmente a 4 ° C. Consideraciones similares se deben hacer al utilizar anticuerpos secundarios (véase 5.10).
4. Permita que la muestra se deposite enparte inferior del tubo de microcentrífuga. Trasvasar anticuerpos primarios con pipeta. Ahorra anticuerpos para la reutilización, si lo desea.
5. Enjuague con 1,0 ml de BBTw dos veces. Después de cada lavado deje la muestra se asiente antes de sacar fuera BBTw con una pipeta.
6. Añadir 1,0 ml de BBTw al vial y el rock. Después de 3 minutos en el balancín, deje la muestra se asiente y eliminar BBTw con pipeta.
7. Repita el paso 5.6 de cinco veces.
8. Bloque de muestras mediante la adición de solución al 5% / suero normal de BBTw al tubo de microcentrífuga. Retire el bloque después de balanceo durante 30 minutos a 1 hora.
   Nota: No se requiere este paso adicional de bloqueo, pero puede mejorar la calidad de la tinción de anticuerpos específicos.
9. Diluir anticuerpos secundarios de apropiarse de la concentración de trabajo en solución / BBTw suero normal de 5%.
10. Envuelva tubo de microcentrífuga en papel de aluminio para reducir el desvanecimiento debido a la exposición a la luz. Muestra de la roca en la solución de anticuerpo secundario durante 12 a 48 horas a 4 ° C o por lo menos durante 3 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C.
11. Permita que la muestra se deposite en el fondo del tubo de microcentrífuga. Trasvasar anticuerpos secundarios con pipeta.
12. Enjuague con 1,0 ml de PBTw dos veces. Después de cada lavado deje la muestra se asiente antes de sacar fuera de la PBTw con una pipeta.
13. Añadir 1,0 ml de PBTw al vial y el rock. Después de 5 minutos en el balancín, dejar que la muestra se asiente y retire la PBTw con pipeta.
14. Repita el paso 5.13 tres veces.
15. OPCIONAL: Añadir DAPI diluido 1: 1000 en PBTw. Muestra de la roca envuelta en papel de aluminio durante 3 min; a continuación, eliminar la solución de DAPI con una pipeta. Enjuague cinco veces con 1,0 ml de PBTw, permitiendo que la muestra se asiente antes de extraer PBTw con la pipeta.
16. Añadir 80-100 l de 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano solución (DABCO) al tubo de microcentrífuga y se almacenan a -20 ° C.
    Nota: Otro agente anti-fade basado en glicerol puede ser sustituido por.

6. Análisis

1. Antes de la muestra de montaje en portaobjetos, añadir un extra de 5 - 10 l de DABCO / p-phenilenodiamina (PPD) Antifade solución al tubo de microcentrífuga.
   Nota: La muestra se puede añadir a las diapositivas sin disección. El volumen de muestra añadido a una diapositiva varía con el tamaño de hoja de la cubierta. Cuando el pipeteado de la muestra en un portaobjetos, la punta de pipeta se puede cortar utilizando una cuchilla de afeitar para prevenir muestra de cizallamiento. A menudo es útil para alinear muestra en filas para el análisis fácil. La adición de PPD como un agente Antifade adicional puede no ser necesaria, pero puede evitar photobleaching si las muestras se almacenan a largo plazo.
2. Coloque suavemente hoja de la cubierta de vidrio sobre la muestra. Entonces, cubreobjetos seguro en su lugar con el esmalte de uñas.
3. Ver muestra montada mediante microscopía de fluorescencia.

Resultados

Para demostrar la eficacia de la inmunotinción a base de ultrasonidos en el análisis de embriones en etapa tardía y tejidos larvarios in situ, de tipo salvaje embriones y larvas fueron procesadas para la inmunotinción de los testículos, los ovarios, y el tejido neural. Las muestras se obtuvieron imágenes a través de microscopía confocal y los resultados representativos se muestran (Figura 1 y Figura 2). Los resultados revelan que el protocolo descrito es eficaz para la ...

Discusión

Este protocolo proporciona un método para dirigir con éxito inmunotinción Drosophila embrionario y en los tejidos de las larvas in situ, eliminando así la necesidad de disección. Según los protocolos anteriores para la tinción de embriones tempranos ^1,2,3, la membrana coriónica se elimina usando 50% de lejía (NaOCl). Las muestras se fijaron en formaldehído y metanol. Debido a la cutícula de las larvas causa de muestra mayores a flotar, toda la muestra se hace pasar luego a través...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx)			For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)			For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10%			For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS			0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes			For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde			37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane		CAS 142-82-5	n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol		CAS 67-56-1	Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10%			For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)		CAS: 281-57-9	To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution			1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates			To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10%			To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste			~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa			1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
mouse anti-Repo	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Goat anti-rabbit Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Goat anti-mouse Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Goat anti-rat Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.		Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 μm cellulose nitrate membrane filter