In vitro modelo de cultivo celular para Toxic inhalado Prueba química

Resumen

Este protocolo está diseñado para demostrar método de exposición de cultivos de células a productos químicos tóxicos inhalados. La exposición de diferenciada interfaz aire-líquido (ALI) cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias proporciona un modelo único de la exposición de las vías respiratorias a los gases tóxicos tales como el cloro. En este manuscrito se describe el efecto de la exposición al cloro en las culturas de la interfaz aire-líquido de las células epiteliales y la cultura sumergida de los cardiomiocitos. In vitro sistemas de exposición permiten importantes estudios sobre el mecanismo para evaluar las vías que podrían entonces ser utilizados para desarrollar nuevos agentes terapéuticos.

Resumen

Los cultivos celulares son indispensables para desarrollar y estudiar la eficacia de los agentes terapéuticos, antes de su uso en modelos animales. Tenemos la capacidad única de modelar las células del epitelio de la vía aérea humana y del músculo del corazón bien diferenciadas. Esto podría ser una herramienta muy valiosa para estudiar los efectos nocivos de los productos químicos tóxicos inhalados, como el cloro, que normalmente pueden interactuar con las superficies de las células, y forman varios subproductos al reaccionar con el agua, y la limitación de sus efectos en cultivos sumergidos. Nuestro modelo utilizando cultivos de células epiteliales de la vía aérea humana bien diferenciados en la interfaz aire liqiuid elude esta limitación, así como proporciona una oportunidad para evaluar los mecanismos fundamentales de la toxicidad de los potenciales químicos inhalados venenosas. Describimos una mayor pérdida de la integridad de la membrana, la liberación de caspasa y la muerte sobre químicos tóxicos inhalados, como la exposición al cloro. En este artículo, se propone métodos para modelar la exposición al cloro en el corazón de los mamíferos y de las vías respiratorias epiteliales cells en la cultura y sencillas pruebas para evaluar su efecto en estos tipos de células.

Introducción

La exposición a productos químicos tóxicos inhalados (TICs) / gases como el cloro (Cl ₂₎ sigue siendo un problema de salud en curso en exposiciones accidentales, así como en su uso potencial como un agente de amenaza química. Aunque los pulmones son el blanco principal, órganos como el corazón y el cerebro también se ven afectados ^1-3. Modelos in vivo se utilizan generalmente para las pruebas de toxicidad de las TIC, pero en los ensayos in vitro para la evaluación de la toxicidad son más simples, más rápido y más rentable. En modelos in vitro también permiten la extensa investigación de las interacciones célula-agente que pueden ser difíciles de evaluar in vivo. Tales sistemas de exposición in vitro en son raros y por otra parte, en algunos modelos convencionales donde se añaden agentes tóxicos al medio de cultivo en el que se sumergen las células, las propiedades de los agentes pueden cambiar debido a las interacciones y la unión a componentes en el medio. En tales sistemas de cultivo de células escenarios tales como la interfaz aire-líquido (ALI) cultivos de células primarias vías respiratorias humanas epiteliales, que aquí se proponen, que pueden estar expuestos directamente a los agentes gaseosos podrían ser prometedores.

Las células epiteliales que recubren las vías respiratorias son las primeras líneas de defensa contra sustancias químicas tóxicas inhaladas. El epitelio de la vía aérea humana forma una barrera física entre la luz y las células subyacentes en el pulmón y participa en la respuesta del pulmón. Se produce un número de citoquinas y otros agentes pro-y anti-inflamatorias, así como segrega líquido de la superficie de moco / las vías respiratorias (ASL) que cubre el epitelio. Una de las limitaciones en sumergido en sistemas de cultivo in vitro convencionales es también que la ASL y el moco que cubre la superficie epitelial se quita o se diluyen. Esto no refleja el estado fisiológico de las células epiteliales del pulmón que se exponen al aire. Por lo tanto, un ideal sistema in vitro para las pruebas de toxicidad TIC debe replicar esta arquitectura. Hay un gran interés en el desarrollo de la detección rápida métodos que predicen la toxicidad in vivo. Las células epiteliales cultivadas en el ALI diferenciar y tienen estructuras y funciones bien diferenciadas en comparación con las células cultivadas sumergidas y servir a un modelo superior de las vías respiratorias.

En este estudio, se describe el uso de la cultura-líquido interfaz aérea de las vías respiratorias humanas (traqueobronquiales) las células epiteliales para las pruebas de toxicidad por inhalación de gas venenoso y lo comparamos con un cultivo de células sumergida de los cardiomiocitos, estudiando, por lo tanto otro objetivo importante de la toxicidad.

Protocolo

1. Culturas Rata cardiomiocitos

1. Todos los experimentos se realizaron bajo protocolos aprobados por el cuidado de los animales y el uso comité institucional, IACUC.
2. Obtener cardiomiocitos de rata de los corazones (ventrículos) de ratas macho (240-260 g) empleando los métodos descritos anteriormente ^4. En pocas palabras, anestesiar a los animales con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (100 mg / kg; confirmar la anestesia por el método pizca dedo del pie) y luego retire corazones en 10,0 ml, 1 mM Ca ^{2 +} que contiene tampón Krebs Ringer, pH 7,4.
3. Enjuague los corazones 5-6x para quitar la sangre y luego cambiar a un ² tampón Krebs Ringer Ca ⁺ gratuito que contiene 0,02% de proteasa y 0,06% de colagenasa A (5,0 ml / corazón). Incubar los corazones en esta solución durante 10-15 min a 37 ° C con agitación ocasional.
4. Después de 10-15 minutos, lavar la solución enzimática con tampón Ca ^{2 +} libre de Krebs Ringer durante 5 min. Liberar las células del tejido fláccido nosotrosing una pipeta de 25 ml con la pipeta la suspensión arriba y abajo varias veces.
5. Separar las células de los tejidos mediante el filtrado a través de una malla de nylon de 70 micras y permitir que se asienten en tampón Krebs Ringer que contenía 0,1 mM Ca ^{2 +.} Suspender el sedimento de células en 1,0 ml de tampón Krebs Ringer que contenía 0,2 mM Ca ^{2 +.}
6. Capa cuidadosamente más de 5,0 ml 60 / ml de albúmina de suero bovino mg, BSA, en 15 ml tubos de centrífuga, para separar los cardiomiocitos de nonmyocytes y permitir que se asienten durante 30 min. Los cardiomiocitos son más pesados ​​y se mueven a la parte inferior del tubo. Retire con cuidado las células sobrenadante y medios de comunicación. Repita este paso una vez para purificar aún más las células.
7. Transición gradual por lavado (en pasos utilizando 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, y 1,0 mM de Ca ² tampón ⁺ que contiene) los miocitos ventriculares / cardiomiocitos a 1,0 mM de Ca tampón ^{2 +} que contiene y se resuspendieron en medio ACCT que consiste en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco , DMEM containing 2 mg / ml de BSA, 2 mM de L-carnitina, creatina 5 mM, 5 mM de taurina, 100 UI / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina.
8. Placa de los cardiomiocitos en medio ACCT a una densidad de 100 a 150 células / mm ² en 100 mm o 35 mm de laminina recubierto placas de cultivo de plástico o 40 x 22 mm cubreobjetos de vidrio recubiertos previamente con laminina (1 g / cm ^2). Después de 1 hora, lavar los platos con ACCT 2,0 ml para eliminar las células que no están conectados. Añadir 10,0 ml de medio fresco y se incuban las células.

2. Interfaz de aire-líquido diferenciada (ALI) Cultivo de células de las vías respiratorias humanas epiteliales basales

1. Adquirir tejidos traqueobronquiales humanos de la enfermedad de Investigaciones Científicas de intercambio bajo la Junta de Revisión Institucional de los protocolos aprobados. Cosecha celular y realizar cultivo utilizando un ^5,6 procedimiento publicado. Este procedimiento utiliza cultivos de células, ya que son un modelo preciso de la exposición por inhalación humana a TICs, sin embargo, si es necesario se puede aislar y crecer a ALI moutilizar y / o células epiteliales de las vías respiratorias de rata ^7,8.
2. Brevemente, hacer piezas pequeñas (~ ¼ de pulgada) de tejido después de la eliminación de todos los nodos de tejido conjuntivo y los ganglios. Lave el tejido varias veces en solución de Ringer con lactato. Añadir los tejidos a un tubo cónico de 50 ml y añadir solución de proteasa (1% Protease/0.01% de DNasa en medio mínimo esencial, MEM, tejido a la proporción de fluido (01:10)).
3. Rock the tejido a 4 ° C durante la noche. Fin de la disociación del tejido mediante la adición de suero bovino fetal al 10%. Raspar la superficie epitelial con un bisturí quirúrgico y recoger las células por centrifugación (2000 rpm durante 10 min).
4. Las células de la placa en el paso uno en snapwells recubiertas de colágeno en medio especial ALI preparados como se describe en detalle por Fulcher et al ^9. Cultura durante 5 días antes de cambiar a la interfase aire-líquido (ALI) mediante la eliminación de los medios apicales.
5. Alimentar a las células por medio de los medios de comunicación ALI cada dos días y permitir que las células se diferencien por 2-3 semanas adicionales (observar numerosos cilios paliza y la secreción de moco) antes de realizar las exposiciones. Lave la superficie apical con PBS caliente junto con los cambios de los medios.

3. La exposición al cloro

1. Contener el sistema de exposición al cloro (CES) dentro de una campana química calificada con una velocidad de extracción de funcionamiento de 100 pies por minuto que proporciona la contención secundaria necesaria para evitar la exposición del personal en caso de fugas accidentales de cloro.
2. Haga funcionar el sistema bajo presión ligeramente positiva (0,5 pulgadas de agua). El aire seco se alimenta a 15 L / min y un nivel adecuado de cloro se alimenta para alcanzar la concentración de cloro final deseado. Las cámaras tienen una tapa de cierre con 4 mini cerraduras BCU y una junta de silicona de durómetro bajo para proporcionar el sello de presión.
3. Entregar la mezcla de Cl ₂ a través de un controlador de flujo másico. El CES utiliza un cilindro de gas comprimido que contiene 1,0% de Cl ₂ en nitrógeno seco.
4. Regular el flujo de aire de dilución utilizando eldiseñado a medida del panel de control y del mismo modo regular la concentración de _Cl2 entregado a las cámaras de exposición. Una bomba de muestreo de bajo volumen saca los gases de escape de las cámaras en un analizador de cloro para controlar las concentraciones que luego se graban en un registrador de datos conectado al analizador.
5. Medir las tasas de flujo dentro de las cámaras antes de la exposición usando un medidor de flujo para asegurar velocidades de suministro y de escape iguales.
6. Preparar los cultivos celulares para la exposición mediante la eliminación de los medios de comunicación de sobrenadante y añadir medio fresco (medio basolateral en culturas ALI). Cualquier pretratamientos con agentes podrían ser realizados en este momento.
7. Exponga las culturas ALI de las células epiteliales de la vía aérea a Cl ₂ gas (50, 100, o 300 ppm durante 30 minutos) en las dos cámaras bioconfinamiento polisulfona selladas. Los cardiomiocitos (sumergidas o culturas en las membranas confluentes) están expuestos a 50 o 100 ppm de Cl ₂ durante 15 min.
8. Después de la exposición limpiar las cámaras de aire hasta que la Cl ₂ nivel cae por debajo de 1 ppm y se puede abrir de forma segura para eliminar las células (dentro de 5 min).

4. Resistencia eléctrica transepitelial (TER) Medición

1. Mida la TER de aire-líquido-interfaz, ALI, culturas utilizando un voltohmmeter epitelial con un par de electrodos de cloruro de "palillos" de plata.
2. Equilibrar el electrodo palillo en el ALI medios 15 min antes de su uso.
3. Añadir media caliente al apical (1,0 ml) y basolateral (2,0 ml) de la superficie y medir la TER usando los electrodos palillos del voltohmmeter.
4. Sumergir el brazo más corto del electrodo en medios apical y el brazo más largo en los medios de comunicación basolateral. Haga clic en el botón de "medida" en el voltohmmeter para evaluar la resistencia eléctrica.
5. El voltohmmeter tiene la opción para medir ohmios o K ohmios. Restar la resistencia a través de un soporte de cultivo libre de células a partir de la resistencia medida a través de cada capa de células para producir el transresistencia epitelial (TER).

5. Medición de Caspasa

1. Añadir medios ALI fresco (2,0 ml) a la exposición basolateral mensaje superficie e incubar la célula a temperatura ambiente. Recoger medio sobrenadante a las 4 y 24 horas.
2. Medir la caspasa 3/7 actividad en los sobrenadantes de los medios de comunicación mediante el uso de una caspasa comercial 3/7 kit de ensayo.

6. Western Blot e inmunocitoquímica

1. Realizar transferencias de Western usando lisados ​​de células como se ha descrito previamente ^10. Suspender el lisado de proteínas (20 g) en tampón de muestra 5x reducida y hervir durante 5 min. Se somete el lisado de proteínas a SDS-PAGE (4-15%) y transferir las proteínas separadas a una membrana de nitrocelulosa mediante transferencia electroforética.
2. Bloquear la unión no específica mediante la incubación de la membrana con leche 5% en tampón de lavado (PBS + 0,1% de detergente) y la sonda las membranas con anticuerpos primarios contra SERCA2 o actina sarcomérica en dilución 1:1000, durante la noche a 4 ° C. A continuación, lavar e incubar las membranas con los respectivos anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y desarrollar para la detección como se ha descrito antes ¹⁰ usando el kit de detección de peroxidasa comercial.
3. Por inmunocitoquímica tratan células vivas cultivadas en insertos o cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos con 0,4% Triton-X-100 en mM tampón de citrato de sodio 10 durante 20 minutos después de enjuagar con PBS.
4. Bloquear la unión no específica tratando las células con 5% de suero de burro durante 20 min, y luego incubar las células con IgG no específica o anticuerpos primarios individuales específica a la actina sarcomérica o Ki-67.
5. Lavar las células con PBS y se incuban con anticuerpos secundarios fluorescentes conjugado para detectar el anticuerpo primario y un tinte nuclear (1 g / ml DAPI).
6. Lavar con PBS y montar cubreobjetos utilizando medio de montaje comercial.
7. Visualizar la tinción utilizando un microscopio de fluorescencia.

Resultados

Cardiomiocitos en forma de varilla primaria se adhieren sobre matrices de laminina y se propagan y se diferencian en cultivos confluentes (Figura 1A y su inserción). Estas células se caracterizan además sobre la base de actina sarcomérica y la expresión de SERCA2 (Figuras 1B y 1C). Cardiomiocitos de rata son altamente susceptibles a la toxicidad de cloro como 15 minutos de exposición a 100 ppm de cloro causó grandes redondeo celular y muerte en cultivos sumergido...

Discusión

El tipo más común de exposición a sustancias tóxicas agudas se produce cuando se respira un producto químico venenoso en los pulmones. Estas sustancias químicas también pueden ser tomadas rápidamente en el torrente sanguíneo y pueden afectar otros órganos, como el cerebro y el corazón. Toxicidad por inhalación de diversos agentes que utilizan modelos animales son estudiados e informó ampliamente, sin embargo los mecanismos son menos conocidos. Esto es un obstáculo importante en el desarrollo de terapias ef...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode	World Precision Instruments	EVOM and STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon cell strainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment chambers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomeric actin antibody	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antibody	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antibody	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-conjugated secondary antibody	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer solution	Abott Laboratories	7953
Donkey serum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detection kit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497
Collagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ