En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Resumen

La naturaleza de las interacciones entre las células madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) y nichos de la médula ósea es poco conocido. Modificaciones de hardware personalizados y un protocolo de adquisición de múltiples pasos permiten el uso de dos fotones y microscopía confocal a la imagen ex vivo HSPCs etiquetados alojados dentro de las áreas de la médula ósea, las interacciones de seguimiento y el movimiento.

Resumen

A través de un delicado equilibrio entre la quiescencia y la proliferación, la auto renovación y la producción de progenie diferenciada, las células madre hematopoyéticas (HSC) mantener la rotación de todos los linajes de células sanguíneas maduras. La coordinación de las señales complejas que conducen a destinos específicos de HSC se basa en la interacción entre las HSC y el microambiente intrincada médula ósea, lo que aún es poco conocido ^[1-2].

Se describe cómo mediante la combinación de un soporte de la muestra de nuevo desarrollo para el posicionamiento de animales estable con múltiples pasos confocal y de dos fotones en las técnicas de imagen in vivo, es posible obtener de alta resolución 3D pilas que contienen HSPCs y sus nichos circundantes y para su seguimiento a través del tiempo a través de múltiples puntos de time-lapse. Formación de imágenes in vivo de alta definición permite que las células madre y progenitoras hematopoyéticas ex detección etiquetados (HSPCs) que reside dentro de la médula ósea. Por otra parte, múltiples puntos de imagen en 3D de lapso de tiempo, obtained con los ajustes de adquisición más rápidos, proporciona información precisa sobre el movimiento HSPC y las interacciones recíprocas entre HSPCs y células del estroma.

Seguimiento de HSPCs en relación a las células osteoblásticas positivo GFP se muestra como un ejemplo de aplicación de este método. Esta técnica puede ser utilizada para el seguimiento de cualquier hematopoyéticas o células estromales apropiadamente marcada de interés dentro del espacio de la médula ósea bóveda craneal de ratón.

Introducción

A pesar de haber sido reconocidos nichos de células madre desde hace décadas ³ y caracterizan en muchos tejidos, así como el bulbo olfatorio, la fibra muscular, abultamiento del folículo del pelo o del SNC zona subventricular ^4-7, las interacciones entre las células madre hematopoyéticas (HSC) y microambiente de la médula ósea ( BM) son aún poco conocidos debido a la dificultad de observar directamente las células individuales a través del hueso, así como la naturaleza extremadamente fluido del propio tejido. Se ha demostrado, a través de una serie de estudios funcionales sobre la base de la ablación o la sobreexpresión de genes específicos en cualquiera de las CMH o las células del estroma del propio microambiente, que una intrincada red de diferentes tipos de células y señales reguladoras es responsable de regular el delicado equilibrio entre la quietud , la proliferación, la expansión y diferenciación de las HSC ^1-2. La diafonía entre HSC y sus nichos se puede entender en profundidad sólo a través de la observación directa. Este es ACHievable gracias a la elaboración de protocolos de imagen avanzadas, combinando la tecnología disponible no sólo en términos de la microscopía, sino también de soluciones de soporte de la muestra y del software de adquisición.

Resolución de celda individual de imágenes en vivo de las células trasplantadas madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) en el compartimiento de la BM de los huesos calvaria ratón mostró que HSPCs de injerto se localizan en la proximidad de los vasos SDF-1 y VCAM-1-positivas ^8-9 y que las células más inmaduras se encuentran dentro de 15 - 20 micras a partir de células osteoblásticas positivas para GFP (línea de ratón transgénico Col2.3-GFP, en la que el promotor 1α colágeno osteoblastos restringida conduce la expresión de GFP), mientras que su progenie son más distal ^10. Observaciones similares se han obtenido a partir de huesos de fémur fracturados disecados y ¹¹ y de los huesos tibeal adelgazadas ^12. Obtención de imágenes de la médula ósea de calota sigue siendo el método menos invasivo para lograr la visualización directa de HSPCs dentro ªeir microambiente nativa.

Con cualquier imagen espécimen vivo hay una necesidad inherente para mantener la muestra lo más quieto posible para evitar artefactos innecesarios debido al movimiento de la muestra. La respiración causa movimientos oscilatorios de la cabeza del ratón, que deben ser evitados cuando la formación de imágenes de médula ósea de calota. Titulares estereotácticas convencionales, utilizados por ejemplo para formación de imágenes del cerebro y electrofisiología, no son adecuados para formación de imágenes bóveda craneal porque obstruyen los huesos frontales. A partir de un soporte de ratón utilizado para disminuir el sufrimiento durante la formación de imágenes y electrofisiología estudios en vivo ^13, un soporte de 2 componente fue desarrollado, con una pequeña pieza fija para la cabeza del ratón para crear una ventana de imágenes conectado a un brazo mayor asegurar asimiento estable con un placa base pesada que asegura firmemente en la platina del microscopio. Fijación de la pieza de cabeza en el cráneo del ratón permite la respiración libre, mientras que todavía la inmovilización de la cabeza en su sitio y eliminar adecuadamente movements debido a la respiración. Un mecanismo 'y llave de bloqueo' que une la cabeza-pieza para el cuerpo de soporte permite que el tamaño de la ventana para minimizar así como una mayor precisión de posicionamiento, por lo tanto, la simplificación de la cirugía, y el ajuste de la placa de base en la etapa permite la alineación precisa en el microscopio. Para controlar con precisión células móviles, un protocolo de lapso de tiempo de múltiples puntos fue diseñado para permitir el rastreo de células en el tiempo con intervalos de 5 min entre puntos de tiempo. HSC Aquí, DiD marcadas se inyectaron en ratones reportero col2.3GFP osteoblasitc ^10,14 y la imagen de aproximadamente 20 horas más tarde. El titular de ratón que fue diseñado y la configuración de imagen necesarios para realizar rápida de múltiples puntos de lapso de tiempo de formación de imágenes de las mismas áreas durante un período de múltiples hr se describen en detalle.

Protocolo

Todos los procedimientos que implican el uso de animales se realizan de acuerdo con la legislación local. Nuestro trabajo es aprobado por el Ministerio del Interior del Reino Unido, así como el grupo de revisión ética Imperial College. Los procedimientos permitidos se describen en la documentación de licencia de proyecto y siguen las pautas que aseguren el bienestar de los animales en todo momento. Asegúrese de cumplir con la legislación sobre la experimentación con animales en el país donde se realiza el trabajo.

1. Etiquetado e Inyección de HSPCs:

1. Cosecha células descritas por Lo Celso ^14-15.
2. Preparar las células a una concentración de 10 ⁶ células / ml en PBS. NOTA: Utilice un hemocitómetro o la información proporcionada por el clasificador de células para contar las células; el número de células para ser etiquetados y se inyecta varía dependiendo del tipo de célula (por ejemplo, tinción de 10.000 - 20.000 HSCs, 100000 - 300000 HPC); si se trabaja con menos de 10 ⁵ células, resuspender en 100 l de PBS; es importante tener las células en PBS sin suero, como suero inhibe la tinción.
3. Agregar DiD a la suspensión celular a una concentración final de 5 M y agitar la suspensión de inmediato para garantizar que el tinte no precipite fuera de la solución y dejar de marcar las células.
4. Incubar durante 10 min a 37 ° C luego se lava por centrifugación a 500 xg durante 5 min, decantar el líquido y resuspender el sedimento en un volumen apropiado para inyección IV (~ 100 - 150 l)
5. Resuspender las células en 200 l de PBS y recoger en una jeringa de insulina. NOTA: una jeringa de insulina se recomienda más de una jeringuilla convencional porque no tiene aguja del espacio muerto y por lo tanto permite administrar toda la suspensión celular para el ratón.
6. Inyectar células en un ratón irradiado letalmente a través de inyección en la vena de la cola. NOTA: La irradiación ha conocido, un impacto considerable en el microambiente de la médula ósea (tanto hematopoyéticas y del estroma componentes), que se desarrolla sobre timí. Por tanto, es muy importante mantener el tiempo constante para la irradiación, la inyección de células (4 a 24 horas de la irradiación para el mejor injerto) y de imagen. Aquí la irradiación se lleva a cabo de 6 horas antes de la inyección y formación de imágenes se realizó 20 h después de la inyección.
   1. Coloque el ratón en una cámara caliente (37 ° C) hasta que la vena de la cola aparece vasodilatación.
   2. Mueva el ratón en el retenedor y deslice cuidadosamente la aguja en la vena de la cola.
   3. Inyectar las células en la vena - sin resistencia a la inyección debe ser encontrado.
   4. Deje el ratón O / N a fin de permitir que las células migren a los espacios de la médula ósea.

2. Preparación del ratón for Imaging

1. Autoclave de un par de pinzas finas y un par de tijeras finas, así como un casco antes de usar y almacenar en un ambiente estéril.
2. Invente anestésico lo más fresco posible, (0,38 ml de ketamina + 0,25 ml medetomidina + 4,47 ml de agua). NOTA: otsus anestésicos aprobados, incluido el isoflurano y el otro inyectable, serán eficaces también. El cóctel se describe es para ser administrado por vía intraperitoneal en 0,1 ml por 10 g de peso corporal, con recargas de 30 - 50 l administrados cada 45 min a 1 h.
3. Encienda el láser de dos fotones, si es necesario a continuación, iniciar el microscopio y software, la calibración de la etapa en que se le solicite. Encender el láser y permitir que se caliente y se estabilice mientras se prepara el ratón para la imagen.
4. Anestesiar al ratón usando la mezcla anestésica preparada (paso 2.2) para que el anestésico elegido a través de inyección intraperitoneal. Vigilar la aparición de la anestesia profunda a través del reflejo pedal ahora ya intervalos regulares durante todo el protocolo. NOTA: el ratón debe ser monitoreado cuidadosamente durante el procedimiento y si la anestesia parece ser un rayo (por lo general después de 45 - 60 min) y luego administrar una dosis de recarga (como se detalla en el apartado 2.2). Se espera algo de variación entre los ratones de diferentes edades y sexo. Es importante para discutir el protocolo de anestesia con su funcionario veterinario local para asegurar las debidas precauciones se toman para asegurar el bienestar del ratón.
5. Hisopo la parte superior del cuero cabelludo con etanol al 70% en un tejido, asegurando de no obtener ninguna etanol en los ojos del ratón.
6. Usando fórceps y tijeras estériles, retirar cuidadosamente la porción central del cuero cabelludo para exponer el área bóveda craneal en ser fotografiado: hacer una pequeña incisión en la parte posterior de la cabeza entre las orejas mediante el levantamiento de la piel con los fórceps. Mientras mantiene la piel hacia arriba, deslice la tijera debajo de la piel y cortar con cuidado a lo largo de la parte exterior del área de imagen deseada.
7. Limpie el hueso expuesto con un bastoncillo de algodón estéril humedecido con PBS estéril para mantenerlo húmedo.
8. Coloque la pieza de cabeza de metal en el cráneo del ratón listo para la imagen.
   1. Mezclar una cantidad adecuada de cemento dental en un barco pesan hasta que se convierte en una pasta y aplicar rápidamente a la superficie inferior de la pieza de cabeza que se adhiera a la skull.
   2. Antes de que los conjuntos de cemento, coloque el casco en el cráneo del ratón, asegurándose de no conseguir cualquier cemento dental en el área de la imagen, a continuación, esperar a que se va a establecer.
   3. Aplique una pequeña cantidad de Intrasite hidrogel que mantiene el cráneo húmedo.
9. Coloque la pieza de cabeza para el titular y seguro en su lugar con el tornillo, asegurándose de que las ranuras encajan en las muescas titular.
10. Retire el hidrogel del cráneo con bastoncillos de algodón estériles y limpias con PBS estéril antes de ser transferido al microscopio.
11. Inserte el soporte en la platina del microscopio, coloque la rejilla de calefacción bajo el ratón, insertar la sonda del termómetro rectal y asegurar todo en su lugar en el escenario con cinta adhesiva.
12. Coloque una pequeña gota de pomada oftálmica en los ojos del ratón para asegurarse de que no se sequen mientras que bajo anestesia. NOTA: el ratón no debe ser dejado sin atención en ningún momento durante el proceso de formación de imágenes, mientras que bajo anestesia.

3 En Vivo Imaging: Pilas de alta resolución y Adquisición Time-lapse

1. Concéntrese en el cráneo a través de los oculares.
   1. Llenar la ventana de imagen con, agua estéril purificada y usando una lente de inmersión en agua, bajarlo de modo que toque la gota de agua.
   2. Se centran en la parte superior del cráneo usando los oculares del microscopio, usando una lámpara externa como la fuente de luz.
   3. Coloque el área de imagen en la sutura central y moverse hacia la parte posterior de la cabeza para encontrar la sutura coronal como una posición de partida.
2. Ajuste el microscopio para permitir la excitación y la detección eficaz de los fluoróforos aplicables especificados en la tabla de excitación y emisión. NOTA: mientras que un confocal Leica SP5 en posición vertical con una cabeza de exploración galvanómetro convencional corriendo la plataforma de software LAS-AF se utiliza aquí, el procedimiento puede ser fácilmente replicado en otras plataformas microscopio / software. La lente se utiliza aquí es el Leica HCX IRAPO L 25x W / 0,95 NA blentes equivalentes ut de otros fabricantes están disponibles con un aumento adecuado y de alta NA
   1. Coloque el software en un modo para capturar ambas imágenes XY, así como una pila Z 3D y ajustar la velocidad de formación de imágenes a 400 Hz y la resolución de 512 x 512 píxeles. NOTA: la configuración de hardware y aquí resulta en un campo de visión de 620 micras y esto puede diferir en otras plataformas.
   2. Configure el software para que varios canales / pistas son capaces de ser capturado, así como asegurar que el método de recolección está listo para cambiar la configuración entre pilas si es posible o entre bastidores, como mínimo. Establecer 3 configuraciones de captura independientes, la desconexión de la iluminación láser en el extremo de la adquisición de cada pila. NOTA: Se requieren tres canales para este procedimiento para reducir la diafonía entre los canales.
   3. Configuración de los ajustes para la primera secuencia de exploración para la señal de hueso SHG dos fotones (840 nm de excitación; 400-440 nm de emisión); abrir el obturador para que el láser MP y garantizar MP Gain y Offset son configurados correctamente, la potencia del láser es de 12,5 - 25% y el láser se enciende. Seleccione un PMT apropiado como el único detector y cambiar el color a blanco. Nota: detectores de NDD con filtros apropiados se deben utilizar para la detección de hueso cuando esté disponible para lograr una señal más brillante, más profundo.
   4. Repita el procedimiento de configuración de canal utilizado para el canal de las buenas prácticas agrarias para una autofluorescencia combinado (excitación 543 nm; 560 - 600 nm de emisión) y DiD (excitación 633 nm; 650-720 nm de emisión) en las segundas opciones de escaneado, utilizando dos PMT apropiadas. Cambiar el color de canal a verde para la autofluorescencia y rojo para el DiD. Nota: el uso de verde como el canal de auto-fluorescencia permite la detección más fácil de células positivas hicieron cuando los dos canales se superponen - células autofluorescentes aparecen como amarillo / naranja debido a que en ambos canales, mientras DiD células sólo aparecen como rojo, ya que sólo aparecen en el DiD canal. El canal de auto-fluorescenciasólo se utiliza para esta comparación y no se utiliza en ningún análisis final, sin embargo, si el usuario desea, esto se puede cambiar a un color diferente para fines de visualización para evitar la confusión con el canal de GFP.
   5. Por último, la configuración de la tercera y última exploración para GFP (excitación 488 nm; 500-530 nm de emisión); asegúrese de que el obturador está abierto, si es necesario y luego establecer la potencia del láser de la línea de láser de 488 nm a alrededor de 15% o un nivel apropiado para el láser que se utiliza, seleccione un PMT apropiado como el único detector activo y cambiar su pseudocolor a verde.
   6. Activar un modo de imagen "en vivo" para comenzar una exploración preliminar del canal seleccionado y ajuste de ganancia del detector y Offset para una exposición óptima. Repita esto para cada escaneo en la ventana secuencial.
   7. Guarde los ajustes de estas exploraciones multi-canal para fácil reutilización. NOTA: esto permite al usuario para volver a cargar los ajustes en las sesiones posteriores.
3. Activar la captura de múltiples posiciones, denominado «Marcar unnd Encuentra "en el software demostrado, y restablecer los puntos de coordenadas.
4. Explore el área de imágenes de los huesos, a partir de la intersección entre la sutura central y coronal, escanear la profundidad de la zona de la médula ósea utilizando tanto autofluorescencia (pseudo color verde) y DiD con una vista compuesta (de color rojo pseudo). NOTA: células autofluorescentes estarán presentes en ambos canales y aparecerá de color naranja / amarillo en la imagen compuesta mientras que hice células marcadas aparecerán como-sólo rojo células en la imagen compuesta.
5. Cuando se detecta una célula, marcar esto como una nueva posición de coordenadas (x, y, z) en el 'Marcos y Encuentra "herramienta haciendo clic en la ventana" Agregar nuevo icono de posición en el lado izquierdo de la "Marca y Encuentra" .
6. Cuando se ha examinado el campo de vista actual, mover el escenario de la distancia de un campo de visión ya sea izquierda / derecha / arriba / abajo. Repita este proceso para cada campo de visión, trabajando poco a poco por todo el área de la ventana de imagen a la izquierda de jue sutura central, moviéndose hacia la nariz del ratón. Una vez que la bifurcación de sutura central es la vista, mueva hacia el lado derecho de la sutura y repetir el procedimiento de exploración del lado izquierdo en la dirección inversa (es decir, hacia la sutura coronal). Marque las coordenadas de las nuevas células de interés utilizando el 'Marcos y Encuentra' herramienta.
7. Una vez que la exploración de la ventana de imagen es completa, utilice el 'Marcos y Encuentra "herramienta para revisar los puntos (seleccionar el punto deseado y revisar cada punto por separado). Ajuste la parte superior e inferior de una pila Z alrededor de cada celda para cada posición, (muchas plataformas de software le permitirá realizar z-pilas independientes para cada posición, lo que reduce la captura de espacio vacío). Para cada punto, se centran arriba y hacia abajo y fijar posiciones superior e inferior Z para 3D captura z-stack y actualizar el punto individual en la 'Mark y Encontrar'. Fije el intervalo Z-Stack a 5μm y un promedio para cada canal de recorrido secuencial a una calidad adecuada: Línea opromedio Frame r. NOTA: Aumentar el número de exploraciones para promediar aumenta la longitud del tiempo de adquisición.
8. Adquirir una pila de referencia de alta calidad para cada punto de interés, comenzando todo el procedimiento de escaneo (a menudo referido como "Start" en lugar de "Capture"). NOTA: esta exploración puede actuar como referencia para futuras imágenes de alta velocidad.
9. Una vez finalizado el escaneo de alta calidad, activar un ajuste de lapso de tiempo por la captura.
10. En la configuración de lapso de tiempo, establecer el intervalo de tiempo de 5 minutos y el tiempo total de ejecución a la longitud deseada (por ejemplo, 5 h). 'Aplicar' estos ajustes para la exploración general. NOTA: con el fin de reducir este tiempo de exploración para permitir un intervalo de tiempo transcurrido 5 minutos, uno puede tener que reducir el número de análisis utilizados para promediar, limitar la resolución a 512 x 512 píxeles, convertir la exploración para bidireccional (con corrección de fase requerido para alinear los dos sentidos de escaneo), y / o aumentar la velocidad de exploración a 600 Hz o más (más de 600Hz hará que el zoom del área de imagen de la plataforma de software demostrado). También es importante señalar que mientras que un modo de imagen secuencial se utiliza para adquirir una imagen de alta calidad pila inicialmente, adquisición simultánea se utiliza para aumentar la velocidad de formación de imágenes durante el lapso de tiempo - esto puede resultar en una ligera diafonía entre los canales que sitúa adicional importancia en la captura inicial de las pilas de referencia separados con precisión.
11. Comenzar por imágenes (como antes haciendo clic en el botón 'Inicio' en el software demostrado). NOTA: asegúrese de mantener el nivel adecuado de anestesia mediante la administración de más, dosis más pequeñas cuando sea necesario, teniendo cuidado de no sufrir una sobredosis con el ratón, regularmente recargar el agua para asegurar el objetivo no se seque y vigila los signos vitales y la temperatura de calentamiento-pad todo.
12. Cuando termine, levante la lente del soporte y luego retirar el soporte de la platina del microscopio, asegurando los cables de la sonda rectal y hcomer estera no estén dañados.
13. Desenrosque el cabezal del soporte de la platina y retirar con cuidado el ratón. Cull el ratón por dislocación cervical y eliminar el metal cabeza pieza asentándola fuera del cráneo. Guarde los datos en el disco y transferir al servidor para su posterior análisis. NOTA: La pieza de cabeza está idealmente limpiada por inmersión en acetona durante unas pocas horas y finalmente fuera frotando el cemento residual.

Resultados

El encargo, titular de ratón de alta precisión incluyendo una ventana de imagen bóveda craneal de formación de imágenes permite prolongado de FACS HSPCs purificados, marcados inyectados en ratones receptores irradiados letalmente (Figura 1A). Típicamente, después de la inyección de entre 15 a 20.000 células marcadas, de 8 a 15 células son generalmente reconocible dentro de la zona de formación de imágenes de la médula ósea del cráneo al día siguiente. Aquí se muestra cómo adquirir resolución celular pilas individuales en 3D de HSPC-que contiene áreas de la médula ósea de aproximadamente 90 a 120 micras de espesor, (Figura 1B), seguido de 4D películas a intervalos de los HSPCs identificados (Figura 1C y películas).

Se obtienen resultados subóptimos si el cemento dental no se prepara de manera óptima, por ejemplo, el agua podría gotear de áreas no selladas, y aunque se puede recargar desde la parte superior del soporte, cualquier período de tiempo en el que no se sumerge la lente en agua conduce a negro f rames. Algunos de deriva en las imágenes es inevitable debido a la expansión térmica de los materiales del soporte de ratón, sin embargo, puede ser acentuada por la adhesión de cemento subóptima, que conduce a desprendimiento progresivo del ratón, y por perturbaciones de la formación de imágenes establecido, dando lugar a saltos repentinos del enfoque durante el time-lapse. Drift durante múltiples puntos time-lapse también puede ser causada por inexactitudes en los movimientos escénicos al Revisando posiciones previamente fotografiados. Drift y tartamudeo artefactos en películas a intervalos pueden ser corregidos por el uso de algoritmos de registro de imágenes.

Tabla 1. de excitación y de emisión de configuración.

Canal de Color	Excitación	Emisión
GFP	500-530 nm
Autofluorescencia	543 nm	560-610 nm
DiD	633 nm	640-700 nm
SHG	840 nm (MP)	400-450 nm

13px; "> 488 nm

Figura 1 En imágenes 4D vivo de HSPCs en la bóveda craneal de ratón. Células ejemplos de los resultados obtenidos (B) rodajas de 2D a partir de una pila 3D (profundidad total es de 114 micras), que contiene la señal de la médula colágeno (blanco), DiD marcados (rojo) - (A) Esquema del experimento (C B).. , cel autofluorescentels (amarillo) y las células osteoblásticas (verdes). Las barras de escala: 100 micras rodajas (C) 2D a partir de una película de lapso de tiempo 4D muestra una HSC DiD marcado (rojo) la migración en la proximidad de las células osteoblásticas (verdes).. La línea de puntos destaca el desplazamiento de la célula. Las barras de escala: 50 micras (B) y 100 m (c). NOTA:. La película obtenida a partir de la adquisición de lapso de tiempo en (C) se muestra en el artículo de vídeo Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

¿Qué se logró?

El protocolo utiliza imágenes multidimensionales-lapso de tiempo para controlar la migración de FACS purificada, ex vivo etiquetados, HSPCs trasplantadas en ratones calvarial médula ósea. La identificación de las células trasplantadas individuales se ha logrado y éstos han sido objeto de seguimiento durante períodos prolongados de tiempo (hr) con gran precisión. Respirar los artefactos de movimiento inducidos se han minimizado y las células se han reimaged repetidamente durante un tiempo prolongado curso.

¿Cuáles son las direcciones futuras?

Desarrollo de la técnica podría avanzar hacia experimentos de recuperación para permitir la formación de imágenes en varios días, en el transcurso de una semana o más y el uso de anestésicos tales como gas isoflurano para acortar y simplificar el proceso de recuperación para el ratón (Nota: los experimentos de recuperación requieren estrictamente condiciones de cirugía estériles y la administración de analgésicos apropiados). Development de un mayor color paleta de tintes en vivo, así como el etiquetado genética eficiente de células hematopoyéticas también facilitará experimentos multi-etiquetado, permite comprender mejor las interacciones célula-célula en la médula ósea y permitir experimentos más complejos en el futuro. Además, el etiquetado simultáneo de las estructuras de la médula ósea y varios componentes del estroma proporcionará una imagen más completa de los eventos que tienen lugar en nichos HSPC. Estabilidad de imagen de las películas a intervalos podría mejorarse preadquisición estabilizando el microscopio más, así como minimizar los gradientes de temperatura en la muestra y posterior a la adquisición mediante el uso de algoritmos de registro de imágenes.

Limitaciones:

La técnica descrita presenta algunas limitaciones. La supervivencia de los ratones después de la administración de anestésicos inyectables es impredecible y es muy fácil de experiencia complicaciones dependiendo de la respuesta individual a laanestésico. En general, cuanto más tiempo una sesión de imágenes, más difícil es para el ratón se recupere de la anestesia y por ello es importante planificar cuidadosamente si el ratón se va a recuperar, lo ideal es limitar la duración de las imágenes de lapso de tiempo. El uso de anestésicos inyectables limita el tiempo de cada sesión de formación de imágenes puede durar. Si bien es posible prolongar la anestesia por readministración una dosis más pequeña de anestésico, es difícil realizar esta precisión y una sobredosis del ratón es una de las causas más frecuentes de la terminación prematura de imágenes in vivo. Anestesia de gas es menos tóxico y permite una sesión más larga de imagen inicial, sin embargo rápida recuperación del ratón después de> 2 hr a largo administración de isoflurano es raramente exitosa. Otra limitación de la técnica es la resolución limitada de las imágenes que se pueden obtener durante múltiples puntos de imagen de lapso de tiempo, debido a la necesidad de adquirir imágenes rápidamente. Esto, unido a la deriva o campo focal salta (discoussed arriba), puede hacer el seguimiento de las células difícil.

Comparación con métodos alternativos:

HSPCs suelen ser etiquetados con el colorante lipófilo DiD, pero DiR y DiI colorantes son alternativas equivalentes y otros colorantes celulares pueden ser usados ​​siempre y cuando lo suficientemente brillante, tal como fue revisado en ^[16]. A pesar de que el etiquetado ex vivo de células con DID se ha demostrado que no afecta a la función a largo plazo de las HSC, tiene la limitación de que DiD (o cualquier otro colorante químico) se diluye en la división celular. Desde HSCs proliferan durante los primeros días después del trasplante, la relación señal a ruido para estas células se deteriora rápidamente. Etiquetado endógena de las células por medio de la manipulación genética y expresión de proteínas fluorescentes es un método alternativo viable, siempre y cuando las proteínas fluorescentes se expresan a niveles suficientemente altos para generar la señal detectable a través del hueso del cráneo. Hay un número de techn alternativaiques disponibles para realizar las imágenes de HSPCs dentro del espacio de la médula ósea, cada uno con sus propias ventajas y limitaciones. La inserción de dispositivos de imagen basado en fibra óptica para formación de imágenes permitió la reconstitución de médula ósea en huesos largos ^[8], mientras que la imagen confocal después de la exposición quirúrgica de la tibia y el adelgazamiento del esmalte hueso con un taladro quirúrgico ^[12] produce imágenes detalladas de HSPCs residente en las zonas periféricas de los huesos largos. Sin embargo, estos métodos son mucho más invasivo que el descrito aquí y por lo tanto no permiten repetir las sesiones de formación de imágenes se centran en la misma zona de la médula ósea en el mismo ratón. Además, es posible que estas técnicas pueden afectar a las células observadas dada la respuesta inevitable a grandes daños en el tejido circundante. HSPCs han sido fotografiadas por cortos períodos de tiempo a través de cubreobjetos colocados sobre extirpados, fémures fracturados ^[11], sin embargo, el impacto de esta dura preparación del tejido en HSPCs no es clear y la técnica se utilizó únicamente para obtener observaciones de un solo punto de tiempo. Huesos de uso han sido seccionadas en cortes seriados, manchado, y las imágenes obtenidas reconstruido en un modelo 3D, que proporciona una excelente resolución en 3D, especialmente cuando se utilizan moldes vasculares ^[17], y recientemente de barrido láser de Citometría (CSL) se ha utilizado para obtener cuantitativa medidas sobre HSPCs in situ, destacaron por inmunotinción ^[18] pero no son capaces de proporcionar cualquier información temporal sobre el comportamiento de las células. Las técnicas descritas en esta nueva técnica proporcionan una combinación de buena resolución en 3D, el muestreo temporal suficiente para el seguimiento de las células en 4D y son relativamente no invasiva, por lo tanto ofrecer un enfoque ideal para lograr el seguimiento a largo plazo de HSPCs interactuar con la médula ósea microambiente.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (Narketan 100 mg/ml)	Vetoquinol	407575 0107 C	Other anesthetics may be used in place of this.
Medetomidine (Domitor 1 mg/ml)	Elanco	134800-2	Other analgesics may be used in place of this.
Vibrant DiD cell labeling solution	Roche Products Ltd.	V22887	Other colors are available and may be used if required.
Lacrilube ophtalmic ointment	Allergan	n/a	avaliable by prescription by the local vet
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement	Associated Dental Products Ltd. via Kemdent	SUN527	We use shade A3, but any shade of cement can be used.
PBS	multiple equivalent
Insulin syringes	Terumo Medical Corporation	SS10M3109	1 ml, 31 G
Mouse restrainer	Harvard Apparatus	340031	Cone type (small)
Autoclaved forceps and scissors	Agar Scientific	AGT577 AGT5034	Iris scissors - 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip)
Weigh boat and cement stirrer	VWR	611-1996/231-0370	5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser	Leica Microsystems		Call for quote
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)	Leica Microsystems	11506323	HCX IRAPO L lens
Custom designed mouse holder	Imperial College Engineering Workshop		See Figure 1 for details
Heating pad with rectal thermometer probe	BASi Instrumentation	FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502	Heat mat/ Control box/ Thermometer probe