En Vivo microinyección y electroporación del mouse Testis

Resumen

Este artículo describe la microinyección y electroporación de testículo de ratón in vivo como una técnica de transfección de células de ratón testiculares para estudiar procesos únicos de la espermatogénesis. El protocolo presentado implica etapas de preparación capilar de vidrio, microinyección a través del conducto eferente, y transfección por electroporación.

Resumen

Esta contribución de video y artículo da una descripción completa de microinyección y electroporación de testículo de ratón in vivo. Esta técnica particular para la transfección de células de ratón testiculares permite el estudio de los procesos únicos en la espermatogénesis.

El siguiente protocolo se centra en la transfección de células testiculares de ratón con construcciones de plásmidos. Específicamente, se utilizó el vector reportero pEGFP-C1, que expresa mayor proteína verde fluorescente (EGFP) y también el vector pDsRed2-N1 que expresa la proteína fluorescente de color rojo (DsRed2). Ambos genes indicadores codificados estaban bajo el control del promotor de citomegalovirus humano temprano inmediato (CMV).

Para llevar a cabo la transferencia génica en los testículos de ratón, los constructos de plásmido reportero se inyectan en los testículos de ratones vivos. Para ello, el testículo de un animal anestesiado está expuesto y el sitio de microinyección se prepara. Nuestro lugar preferido deinyección es el conducto eferente, con la rete testis en última instancia conectado como la ruta de transporte anatómica de los espermatozoides entre el testículo y el epidídimo. De esta manera, el llenado de los túbulos seminíferos después de la microinyección se gestiona de manera excelente y controlada debido a la utilización de soluciones de ADN teñidos. Después de observar un relleno suficiente de los testículos por su estructura túbulo coloreado, el órgano se electroporación. Esto permite la transferencia de la solución de ADN en las células testiculares. Después de 3 días de incubación, se retira el testículo y se investigó bajo el microscopio para fluorescencia verde o roja, que ilustra el éxito de la transfección.

En general, este protocolo puede ser empleado para la entrega de ADN o ARN construye en la vida testículo del ratón con el fin de (sobre) expresa o derribar los genes, lo que facilita el análisis de la función génica in vivo. Además, es adecuado para el estudio de construcciones informadoras o putativo Regula genelementos tory. Por lo tanto, las principales ventajas de la técnica de electroporación son un rendimiento rápido en combinación con bajo esfuerzo, así como el equipo técnico moderado y habilidades requeridas en comparación con las técnicas alternativas.

Introducción

La espermatogénesis en mamíferos se considera que es un proceso sofisticado de células madre auto-renovación sometidos sucesivamente la mitosis, la meiosis y diferenciación con el fin de desarrollar en espermatozoides maduros haploide. Estos cambios morfológicos son orquestados por diferentes tipos de células, ya pesar de profundos intentos, todavía es imposible de imitar estos procesos en cultivo celular ^1,2. Por lo tanto, la investigación sobre la espermatogénesis hasta ahora se basa en organismos vivos como modelos in vivo. En general, los estudios de la función génica se basan generalmente en animales transgénicos. Sin embargo, la generación y el mantenimiento de este tipo de modelo animal consume tiempo, costo intensiva y bastante elaborada. Esto se atribuye al proceso de mejora genética a largo requerido para generar y mantener el transgén largo de las generaciones. Además, la manipulación genética de todo el organismo por el enfoque transgénico o knockout es propenso a causar alteraciones fisiológicas cuando la orientación genes con funciones esenciales en múltiples regiones, por ejemplo, fuera de los testículos o sistémica.

Además, algunos métodos de transfección transitoria se asocian con algunas desventajas cruciales. Por ejemplo, inconvenientes típicos de la transferencia de genes mediada por virus son la posible provocación de inmunorreacciones y reglamentos de seguridad adicionales, mientras que la lipofección y bombardeo de micropartículas ^{3 4} podría dañar el tejido y están limitadas a una cierta profundidad suficiente de células para la eficiencia de transfección.

En contraste, la electroporación (EP) como otra forma común de transfección transitoria, parece constituir una técnica prometedora para permitir la transfección in vivo y análisis in vivo de genes consistente en. En general, EP se conoce como un fenómeno dinámico que depende de la tensión transmembrana local con poros en consecuencia mediadas dentro de nanosegundos. Estas lagunas se pueden mantener durante milisegundos, suficiente to conceder acceso a ADN, ARN o moléculas pequeñas ^5. Cuando el voltaje aplicado es demasiado alto, el carácter generalmente transitoria de EP se contrarresta debido a la producción de calor y la inducción de permeabilización demasiado amplia con el consiguiente daño irreversible de la célula ^5.

Aquí, se muestra que la electroporación es un sistema de transfección eficaz y económico que es capaz de ser utilizado para la transformación genética testículo con el fin de dilucidar las características testiculares de genes in vivo. En este artículo se aborda la preparación de plásmido, microinyección por el conducto eferente y la posterior electroporación de testículos de ratón. Este procedimiento puede ser el medio de elección para lograr la transfección rápido, específico y eficaz de los túbulos seminíferos de los testículos de ratón in vivo con el fin de investigar los procesos de la espermatogénesis.

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Protocolo

Todos los experimentos realizados en animales han sido aprobados por el comité de ética local (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Alemania).

1. preparación de plásmido

1. Para la preparación de plásmido, utilizar kits de purificación de plásmido (ver tabla Materiales) o métodos similares con tampón de eliminación de endotoxina de manera que las reacciones inmunes del animal pueden ser evitados. Siga las instrucciones del manual. Emplear _ddH2O para diluir la solución de plásmido.
2. Eliminar los residuos haciendo girar la solución de ADN a la velocidad máxima (20.000 xg). Luego recoger el sobrenadante.
3. Determinar la concentración de plásmido con un espectrofotómetro (ver materiales).
4. Ajustar la concentración de plásmido con _ddH2O a 1.3 mg (ADN) / l. Nota: Las concentraciones más bajas reducen la eficiencia de la transfección, mientras que las concentraciones más altas pueden causar una solución de inyección demasiado viscoso. Además, ella eficacia de transfección depende del tamaño del plásmido y tiene que ser ensayada por separado.
5. Antes de la inyección, preparar una mezcla de solución con, por ejemplo 40 l plásmido junto con 5 l de PBS (10x) y 5 l Verde Rápido (0,5%). Fast Green es necesaria para el seguimiento del proceso de inyección. Preferiblemente, utilice pared PCR tubos delgados o Parafilm. Nota: Dependiendo del tamaño de los testículos, se necesitará un volumen de 20-50 l para cada testículo.

2 Preparación de la pipeta de microinyección

1. Utilice los capilares de borosilicato (ver tabla Materiales) para la preparación de las pipetas de microinyección.
2. Tire de capilares de vidrio con un extractor capilar vertical (ver tabla Materiales).
3. Rompa la punta capilar con fórceps por suavemente bandas. La punta es usualmente 50-80 micras de diámetro y aproximadamente 1 cm de largo. Trate de evitar las puntas que son demasiado largos ya que estos no son lo suficientemente rígido como para penetrar en el tejido.
4. Por fin, sharpen la punta en unos 30 ° a 45 ° de ángulo usando un biselador micropipeta (ver tabla Materiales).
5. Cargar la pipeta de microinyección con la mezcla de solución inyectable (ver Preparación de plásmido). Aplicar la solución en la parte posterior del capilar de vidrio con una pequeña jeringa. Nota: Trate de evitar las burbujas de aire durante la carga, de lo contrario estos serán inyectados en los túbulos seminíferos, junto con la solución de plásmido y por lo tanto reducirá la conductividad, así como posiblemente causar daño a los tejidos.

3. Anestesia y Cirugía

1. Realice la operación en condiciones asépticas utilizando material estéril (es decir, jeringa, aguja, instrumentos quirúrgicos, etc). Esto reducirá la infección del animal y asegurar buenas tasas de supervivencia.
2. Utilice ratones machos para la electroporación a una edad de 6-8 semanas.
3. Para inicializar tratamiento analgésico postquirúrgico, proporciona el ratón con analgésicos añadió agua potable en el día antes de la cirugía. Este culoUres una analgesia preventiva en caso de hipodipsia postquirúrgica altamente probable (consumo de agua disminuyó). Para este fin, exponer el agua potable con, por ejemplo una suspensión de ibuprofeno pediátrico (20 mg / ml). El agua de bebida medicada también debe ser suministrada en el día uno y dos de la recuperación en la concentración idéntica. Esto significa una dosis diaria de 7,5 mg / kg, válido para 5 ml / d de agua potable y el peso corporal de 25 g durante 8 semanas C57BL / 6J años de edad. Este régimen analgésico garantiza un alivio del dolor y la recuperación acelerada fundamental junto con la alta bienestar ^26.
4. Para la preparación de la anestesia solución en el día de la cirugía de trabajo, mezclar 10% ketamina y 2% xylazin en una proporción de 1: 1 (ver tabla Materiales).
5. Para anestesiar al animal, se aplican 0,25 ml / 100 mg de peso corporal por vía subcutánea de solución anestésica (ketamina = 0,125 g / kg; xylazin = 0,025 g / kg). Usar un sitio de inyección entre la pelvis y extremidad a fin de evitar daños en los órganos y lesiones de los ratones. Por lo general, se necesitan 10 minhasta que el ratón está profundamente anestesiados.
6. Cubra los ojos de ratones con ungüento veterinario para prevenir la sequedad durante la anestesia.
7. Pruebe profunda arresto anestésico, que es notable por la falta total de respuesta. Para ello, simplemente pellizcar el dedo del pie del animal.
8. Para iniciar la cirugía, eliminar el vello abdominal con una máquina de afeitar eléctrica o similar y desinfectar el área de operación con sterilium o similar.
9. Hacer una incisión ventral directamente encima de las glándulas prepuciales en el centro de la zona abdominal. En ese lugar, primero tire de la piel lejos y llevar a cabo una pequeña incisión cutánea transversal de aproximadamente 8-14 mm. Luego, continuar por la capa muscular abdominal.
   Nota: La lesión debe ser tan pequeña como sea posible para reducir el daño al animal.
10. Tire hacia arriba de las almohadillas de grasa abdominales cuidadosamente para exponer el testículo adjunto y colocarlo en un impermeable cortina de papel desechable antes preparado justo al lado del lugar de la incisión (Figura 2A).
11. Use binoculares a find el conducto eferente como el objetivo de la inyección. El ductus eferente se identifica como la unión entre el recipiente bien testículo y el epidídimo. Se encuentra junto a la destacada arteria testicular. El conducto se extiende casi en un ángulo de 45 ° a la arteria y visiblemente entra en el epididymidis caput. Nota: Dependiendo de la edad del ratón, el ductus se suele enterrado en el tejido graso.
12. Utilice unas pinzas finas para despejar el conducto eferente de este tejido graso. Después de eso, coloque el ductus liberado en una tira de papel estéril para asegurar la clara visibilidad de la vía sin perjudicar entorno.

4. La microinyección y la Solicitud de ADN

1. Conectar la pipeta de microinyección, que se carga con la solución de plásmido a la unidad de micromanipulador / inyector.
2. Coloque la aguja de microinyección paralelo al conducto eferente con la punta apuntando hacia la rete testis (Figura 2B).
3. Use unas pinzas finas ypelar el conducto sobre la pipeta de microinyección. Asegúrese de que el capilar se mantiene paralelo al conducto mientras tira de la vuelta.
   Nota: Este procedimiento es más conveniente que penetrar en el recipiente moviendo la aguja con el micromanipulador.
4. Dirija la aguja con cuidado hacia el testículo y detener al igual que penetra en la red testicular directamente debajo de la túnica albugínea (Figura 2C).
   Nota: En el caso de extralimitación de la rete testis, la solución de plásmido se escapará hacia el espacio intersticial. Esto conduce comúnmente al fracaso de la transfección de los túbulos seminíferos.
5. Para la inyección de la solución de plásmido utilizar el microinyector con los siguientes ajustes: pi: 100 hPa ti,: 0,2 seg, y pc: 0 hPa (Figura 2D).
6. Supervisar todo el proceso de inyección mediante la observación de los testículos estado de llenado con la ayuda de el color verde. Tenga cuidado de que el testículo sólo se llena hasta 2/3 de su volumen con la plsolución asmid (Figura 2E).
   Nota: Si se excede el volumen de inyección, el tejido testicular podría ser dañado.

5. electroporación de Testículo

1. Para activar la electroporación efectiva, remoje los electrodos de pinza en PBS (1x). Esto asegura la conductancia adecuado.
2. Suavemente apriete el testículo entre los electrodos húmedos (Figura 2F). Medir la resistencia eléctrica con el electroporador.
3. Aplicar corriente a los testículos. Realizar ocho pulsos cuadrados de 40 V a los 4 sitios testículo diferentes con una duración constante de tiempo de pulso 50 ms y 950 ms tiempo de intervalo.

6. cierre de la herida y después de la cirugía

1. Cuando se termina la electroporación, colocar el testículo de nuevo en la ubicación original.
2. Coser la capa muscular interna con sutura quirúrgica (ver materiales).
3. Cierre de la piel mediante el empleo de clips de sutura (ver tabla Materiales). Tire de la piel encima de ingenioh pinzas. Asegúrese de excluir a la capa muscular. Coloque los clips, cada uno a una distancia de no más de 5 mm.
   Nota: Debido a que la sutura quirúrgica puede ser tragada por el ratón, clips de sutura son favorecidos para el cierre de la lesión cutánea.
4. Deje que el ratón se recupere de la anestesia en las toallas de papel estéril colocados en una jaula del ratón vacío estéril, que está templado sobre una almohadilla caliente 37 ° C. La almohadilla debe garantizar el calentamiento de una mitad de la jaula de la creación de un gradiente de calor. Para el animal esto hace posible la búsqueda de la zona individual, más cómodo debido a la variedad de temperatura en la jaula. Además, el ratón cubrir con una hoja de toalla de papel estéril de modo que el estrés puede reducirse aún más. Nota: Dado que la superficie corporal del ratón es extraordinariamente alta en relación a la masa corporal, en comparación con los animales de mayor tamaño, el apoyo térmica es de particular importancia para la recuperación exitosa de los roedores.
5. Cuando el animal operado ha despertado completamente, transferir it para su posterior recuperación a una nueva jaula de ratón completamente equipada. No ponga el animal de nuevo a su antigua jaula o en un grupo de ratones. Asegúrese de que la jaula es tan limpio y estéril como sea posible para evitar la infección de la herida. Controle todo el proceso de recuperación. Para transferir el ratón de nuevo a las instalaciones de cuidado animal, espere hasta que se haya recuperado por completo y parece comportarse normalmente.
   Nota: persona adicional y estrategias post-quirúrgicas se discuten por Pritchett-Corning KR et al ^6.

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Resultados

La configuración experimental para realizar la microinyección y electroporación de testículos de ratón in vivo, ya que se utiliza de acuerdo con el protocolo se ilustra en la Figura 1. Aunque es posible adquirir micropipetas fabricados industrialmente, preferimos generar nuestras propias pipetas tirando (Figura 1A ) y biselado (Figura 1B) capilares de vidrio para que satisfizo nuestras necesidades. El equipo para la microinyección y electroporación se il...

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Discusión

La investigación en el campo de la biología reproductiva, particularmente en el área de la fertilidad masculina y la espermatogénesis, inevitablemente, se basa en los organismos vivos. Con el fin de examinar la función testicular, sin cultivo celular adecuado / sistema in vitro se ha establecido capaz de reflejar todas las cruciales cambios morfológicos de una espermatogonia diploide a un ^1,2 espermatozoide maduro haploide. Por lo tanto, la generación de animales modificados g...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Sigma	1-15 PK
Spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
Microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
Micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
Electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
Tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
Microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	homemade		XYZ cross table
Surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
Fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
Surgical suture	Catgut, Markneukirchen, Germany	Catgut 00
Syringe with 30 G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10% Ketamine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Urotamin	mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Xylazin	mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
Vet ointment	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl	Carl Roth	3957.1
Ibuprofen, Dolormin	Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany	01094902	analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl	Carl Roth	6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O	Carl Roth	T106.2
18 mM KH2PO4	Carl Roth	3904.1