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Resumen

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Resumen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.

Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Introducción

Los ganglios linfáticos son compartimentos especializados donde se inician y coordinan la respuesta inmune adaptativa contra extranjeros y los antígenos propios. El procedimiento presentado aquí describe una digestión enzimática corto combinado con pipeteo automatizado mecánica para obtener los ganglios linfáticos suspensión de células individuales y obtener acceso a las células del estroma de ganglios linfáticos viables que mantienen la expresión en la superficie de varias moléculas.

Células estromales de los ganglios linfáticos forman el andamiaje de los ganglios linfáticos y cumple tres funciones principales: en primer lugar que filtran los fluidos corporales para degustar antígenos, patógenos y sus patógenos asociados patrón molecular (PAMP), así como las citocinas y peligros asociados patrón molecular (apaga) presente en el cuerpo. En segundo lugar, que atraen e instruyen a las células presentadoras de antígeno (APC) y linfocitos de interactuar e iniciar la respuesta inmune adaptativa; y tercero, que proporcionan un entorno estructural para la homeostasis y la diferenciación de los linfocitos 1-3. Durante la inflamación de los ganglios linfáticos células estromales producen factores de crecimiento, citocinas y quimiocinas, adaptarse a la hinchazón por lo tanto la organización de la interacción entre las células dendríticas (DCs), y células T B-. La orquestación de las respuestas inmunes sólo es posible debido a la compleja arquitectura estructural formada por diferentes poblaciones de células del estroma.

Las células estromales son células de ganglios linfáticos negativos CD45 y se pueden distinguir por la expresión de CD31 o GP38 en las células endoteliales y fibroblásticas 1 -6. GP38 + CD31 - células de la zona T define reticulares (TRC, también conocidos como FRC: células reticulares fibroblásticas), GP38 + CD31 + define células linfáticas endoteliales (LEC), GP38 - CD31 + define las células endoteliales de sangre (BEC). Además, la caracterización de las subpoblaciones reveló la existencia de otras células del estroma de los ganglios linfáticos. De hecho, una pequeña población de células-pericitos se caracterizó como en elGP38 - CD31 - población 7. Por lo tanto, la adaptación del procedimiento de aislamiento es ventajoso para la identificación y caracterización de las propiedades funcionales de las diferentes células del estroma de los ganglios linfáticos.

Antes del desarrollo de los ganglios linfáticos digestión células estromales de los protocolos de estudio de las células del estroma de ganglios linfáticos se limita a las observaciones in situ usando sección de tejido y la microscopía. Sin embargo, los estudios estructurales y funcionales mostraron características importantes de las células del estroma de los ganglios linfáticos. Células del estroma de ganglios linfáticos están asociados con podoplanin, colágeno y matriz extracelular (ECM), las proteínas para formar un complejo 3 estructura dimensional llamado sistema de conductos, que transporta las proteínas de los ganglios y de masas moleculares asociados de baja desde el seno subcapsular del ganglio linfático a la alta endotelial vénulas en la zona de las células T 8. Países en desarrollo están en estrecho contacto con las células del estroma y puede observarse que sobresale en el aire tubularestructura de conducto a la muestra de fluido y detectar antígenos 8. La interacción de las células del estroma de ganglios linfáticos (TRC y LEC) con DCS es mediada por la liberación y la presentación de quimiocinas CCL21 y CCL19 9,10. CCL19 y CCL21 son reconocidos por el receptor CCR7 facilitar países en desarrollo y las células T de migrar al ganglio linfático zona de células T 4,11. A pesar de utilizar quimiocinas similares, las células DCs y T tienen diferentes rutas de migración hacia los ganglios linfáticos 12. Más tarde, usando digestión enzimática de los ganglios linfáticos y el aislamiento de las células estromales de ganglios linfáticos puros, se realizaron estudios funcionales sobre el papel de las diferentes células del estroma de los ganglios linfáticos y de su capacidad para interactuar con los DC y células T / B 6,13. En primer lugar, la diafonía entre IFN-γ que producen células T efectoras y las células del estroma de ganglios linfáticos induce la producción del óxido nítrico metabolito se muestra para amortiguar las respuestas de células T y la proliferación en los órganos linfoides secundarios 14-16. En segundo lugar, la linfa ncélulas estromales ode se han reportado para apoyar la diferenciación de subconjuntos de regulación de corriente continua a través de la producción de IL-10 17, y para modular la homeostasis de las células T naïve a través de la producción de IL-7 6,18. En tercer lugar, la expresión de TLR en las células del estroma de ganglios linfáticos sugiere que las células estromales son susceptibles a la señal derivada de una infección o de auto-moléculas liberado durante la lesión de los tejidos. De hecho, el tratamiento de las células del estroma de los ganglios linfáticos con el ligando de TLR3 poli (I: C) induce un modesto regulación positiva de la expresión principal de histocompatibilidad de clase I y la regulación positiva de la molécula inhibidora de la co-PD-L1, pero no de moléculas coestimuladoras, que resulta en cambios dramáticos en el tejido periférico antígenos expresión 19. Varios grupos han demostrado las células del estroma de los ganglios linfáticos expresan antígenos de tejidos periféricos e inducen la tolerancia de las células T autorreactivas 19,21-27. Por lo tanto, la comprensión de las interacciones entre las células del estroma de los ganglios linfáticos y la otra re migratoria ycélulas de nódulos linfáticos Sident ayudarán a encontrar nuevas moléculas diana para permitir la activación o supresión de las respuestas inmunes durante la inflamación. Por lo tanto, se necesita la aplicación de la separación enzimática publicada del ganglio linfático.

Protocolos previamente publicados utilizan diferentes combinaciones de a base de colagenasa digestión enzimática con menores esfuerzos mecánicos 6,19,20. Sin embargo, las incubaciones largas con las enzimas de fermentación y de la diferente combinación de enzimas de digestión pueden degradar diversas moléculas de la superficie necesaria para analizar el estado de activación y la identificación de nuevas células del estroma de los ganglios linfáticos. Dependiendo del tipo del análisis de células del estroma, el Protocolo de Enlace o protocolo Fletcher podrían ser más adecuado. En el procedimiento descrito, una digestión enzimática ligeramente más corto se combina con desagregación mecánica automatizada para minimizar la degradación del marcador de superficie de los ganglios viable células estromales nodo. Este procedimiento permite el aislamiento y altamente reproducibledistinción de los ganglios linfáticos poblaciones de células del estroma con baja variabilidad y más de 95% de viabilidad. Las células del estroma de ganglios linfáticos recién aisladas se pueden utilizar directamente para la expresión de marcadores de superficie, el análisis de proteínas, y los estudios de la transcripción, así como el establecimiento de líneas de células estromales para llevar a cabo ensayos funcionales in vitro.

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Protocolo

En esta publicación de vídeo y el protocolo, se llevaron a cabo todos los procedimientos con animales de acuerdo con el protocolo de los animales aprobado por la Autoridad Cantonal Basel-Stadt, Suiza.

1. linfa Preparación de nodos y digestión

  1. Agua Pre-calor en un vaso de precipitados a 37 ° C en un agitador magnético con placa de calentamiento.
  2. Preparar Básica Media de la siguiente manera: medio DMEM (sin piruvato) suplementado con FCS al 2%, 1,2 mM CaCl 2 y Pen / Strep (100 unidades de penicilina, 100 mg de estreptomicina).
  3. Esterilice todos los instrumentos de disección antes de su uso.
  4. La eutanasia a los ratones donantes nodo linfático por asfixia con CO2 y asépticamente diseccionar los ganglios linfáticos. No diseccionar la grasa circundante. NOTA: Este protocolo está optimizado para el nodo periférico-el drenaje linfático de la piel (inguinal, braquial, axilar).
  5. Coloque los ganglios linfáticos en una placa de Petri estéril que contiene 2 ml de hielo frío medio básico.
  6. Interrumpir el ca ganglio linfáticopsule usando dos agujas 25 G fijos en 1 ml jeringa.
  7. Transferir el tejido del ganglio linfático alterado en un tubo de fondo redondo de 5 ml de polipropileno que contiene 750 l medio básico suplementado con 1 mg / ml de colagenasa IV y 40 mg / ml de DNAsa I.
  8. Añadir un agitador magnético estéril en cada tubo.
  9. Colocar el tubo en el vaso de precipitados con 37 ° C precalienta el agua y agitar los tubos a una velocidad lenta (1 ronda / seg) durante 30 min.
  10. Retire el tubo del agitador magnético con placa calefactora y dejar fragmentos de ganglios linfáticos se asientan.
  11. Retire con cuidado el sobrenadante enriquecido en "células no estromal". NOTA: Si el análisis de T, B, células dendríticas y CD45 - GP38 - CD31 - se prevé, guarde el "no-células estromales" fracción.
  12. Lave restante tejido de los ganglios linfáticos una vez con 750 l medio básico. NOTA: Este paso sólo es necesario si se trabaja con ratones inmunocompetentes.
  13. Deje que los fragmentos de los ganglios linfáticos se asientan.
  14. Quite elfracción de células flotantes no estromal.
  15. Añadir a los fragmentos de los ganglios linfáticos medio básico suplementado con 750 l 3,5 mg / ml de colagenasa D y 40 mg / ml de DNasa I.
  16. Colocar el tubo de nuevo en el vaso de precipitados que contiene el 37 ° C precalentado agua.
  17. Digerir el tejido de los ganglios linfáticos durante 5 minutos mientras se agitaba lentamente.
  18. Ganglios fragmentos de tejido nodo desagregados por pipeteo y la mezcla de 700 l para 10 ciclos a máxima velocidad utilizando una pipeta multicanal automatizado. NOTA: Esto altera el tejido del ganglio linfático para mejorar la digestión.
  19. Colocar el tubo de nuevo en el vaso de precipitados con 37 ° C el agua precalentado.
  20. Fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos Digest durante otros 10 minutos, mientras que poco a poco revolviendo.
  21. Desglosar los fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos con la pipeta y mezclar durante 99 ciclos a máxima velocidad utilizando una pipeta multicanal automatizada.
  22. Añadir 7,5 l de 0,5 M EDTA para asegurar el mantenimiento de la suspensión de células individuales.
  23. Fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos desagregados por tuberíatting y mezclando durante 99 ciclos a máxima velocidad utilizando una pipeta multicanal automatizado.
  24. Añadir medio básico 750 l y pasar las células a través de una malla de nylon 70 micras.
  25. Se centrifuga la suspensión celular 5 min a 1500 × g, 4 ° C.
  26. Las células estromales se pueden utilizar ahora para su posterior análisis.

2. La tinción de células de ganglio linfático estromales

  1. Use una combinación de anti-CD45, anti-podoplanin (GP38), los anticuerpos anti-CD31 para reconocer con éxito las células TRC, LEC, BEC y DN.
  2. Incubar el tejido del ganglio linfático digerido con vivo rastreador / Dead, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-GP38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) en 100 l de HBSS que contiene 2 % de FCS durante al menos 20 min, 4 ° C, en la oscuridad.
  3. Lavar las células añadiendo 500 l de HBSS que contenía 2% de FCS
  4. Se centrifuga la suspensión celular 3 min a 1500 × g, 4 ° C.
  5. Vuelva a suspender en 100 l de HBSS que contenía 2% de FCS.
  6. Ejecute las células teñidas en un citómetro de flujo equipped con las siguientes óptica: fuente de excitación con hasta tres láseres: azul (488 nm, enfriado por aire, 20 mW de estado sólido), rojo (633 nm, 17 mW HeNe), y violeta (405 nm, 30 mW estado sólido) .
  7. Puerta de CD45 - células para excluir las células hematopoyéticas.
  8. Interiores de puertas (FSC-W) y células vivas (live / perseguidor DEAD) para excluir dobletes y células muertas.
  9. Terreno GP38 contra CD31 para visualizar TRC (GP38 + CD31 -), LEC (GP38 + CD31 +), BEC (GP38 - CD31 +) células (véase la figura 1) y DN (GP38 - - CD31).

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Resultados

El presente protocolo es un protocolo de digestión modificado publicado por Link et al., 2007 6 con un tiempo de digestión más corto (45 min máximo) debido a la disgregación mecánica con una pipeta multicanal automatizada. Además, el procedimiento es más uniforme, minimiza la degradación de marcadores de superficie en diferentes células del estroma de los ganglios linfáticos y permite la manipulación de más de una muestra a la vez.

La colagenasa IV y colagena...

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Discusión

El estudio de las células del estroma de los ganglios linfáticos se convirtió recientemente en un foco de investigación, debido al desarrollo de dos protocolos de digestión publicados 6,13. Ambos protocolos son adecuados para obtener las células del estroma sola ganglios nodo, pero difieren en el uso de enzimas de digestión y el tiempo de digestión. Dado que las células estromales y sus marcadores de superficie son sensibles a la digestión enzimática y la tensión mecánica, se requiere un protocol...

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Divulgaciones

The authors declare they have no competing financial interests.

Agradecimientos

The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLifeTechnologies-Gibco41965-039
FCSFinal concentration 2%
CaCl2Sigma499609Final concentration 1.2 mM
Collagenase IVWorthington Biochemical Corporation>160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase DRoche11088882001use at 3.5 mg/ml
DNAse IRoche 11284932001use at 40 µg/ml
Stiring magnetsFAUST5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 mlFalcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating functionIKA-RCT-standard9720250
Petri dishes 100 mm, sterileTPP6223201
25 G needlesTerumo
anti mouse CD45 AbBiolegendClone 30-F11
anti mouse CD11c AbBiolegendClone N418
anti mouse Podoplanin AbBiolegendClone 8.1.1
anti mouse CD31 AbBiolegendClone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel		Eppendorf4861 000.821/8301.250 µl max. volume
anti mouse CD140aBiolegendClone APA5
anti mouse CD80BiolegendClone 16-10A1
anti mouse CD40BiolegendClone 1C10
anti mouse I-AbBiolegendClone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1)BiolegendClone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kitInvitrogenL10119

Referencias

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