Culturas Organotípicos Slice para Estudiar Oligodendrocyte Dinámica y mielinización

Resumen

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Resumen

Células que expresan NG2 (polydendrocytes, células precursoras de oligodendrocitos) son la cuarta población de células gliales importante en el sistema nervioso central. Durante el desarrollo embrionario y postnatal proliferan activamente y generar oligodendrocitos myelinating. Estas células han sido comúnmente estudiado en cultivos primarios de neuronas disociadas, cocultivos, y en tejido fijado. Uso de líneas de ratones transgénicos recientemente disponibles cortan sistemas de cultivo pueden usarse para investigar la proliferación y diferenciación de las células del linaje de oligodendrocitos en ambas regiones de materia gris y blanca del cerebro anterior y el cerebelo. Cultivos de corte se preparan a partir de ratones postnatales tempranas y se mantienen en cultivo hasta por 1 mes. Estos cortes se pueden visualizar varias veces durante el período de cultivo para investigar el comportamiento celular y las interacciones. Este método permite la visualización de la división celular NG2 y los pasos que conducen a la diferenciación de oligodendrocitos al tiempo que permite un análisis detallado de la región-dependenent células NG2 y la heterogeneidad funcional de oligodendrocitos. Esta es una técnica poderosa que se puede utilizar para investigar las señales intrínsecos y extrínsecos que influyen en estas células a través del tiempo en un entorno celular que se asemeja mucho a la que se encuentra in vivo.

Introducción

Cultivos de corte Organoytpic del sistema nervioso central han demostrado ser de gran utilidad para el estudio de las neuronas y la biología de las células gliales en un sistema semiintact ^1-4. Estos cultivos son relativamente fáciles de adoptar y mantener muchos beneficios de los cultivos de células disociadas primarios tales como la manipulación del ambiente extracelular y fácil acceso para imágenes de células vivas repetida a largo plazo y los registros electrofisiológicos ^5-9. Además, cultivos de cortes de tejido mantienen citoarquitectura 3-dimensional, la conectividad neuronal regional, y la mayoría de tipos de células principales están presentes en el sistema. Estas propiedades hacen que estas culturas un sistema único y conveniente para investigar el comportamiento de una sola célula y fisiología con las interacciones celulares y ambientales.

NG2 células son una población de células gliales en el sistema nervioso central de los mamíferos que continúan proliferando y generar myelinating oligodendrocitos durante el desarrollo embrionario y postnatal ^10. Se han estudiado extensivamente en cultivos celulares primarios disociados, y reciente desarrollo de líneas de ratones transgénicos con NG2 expresión específica de célula de proteínas fluorescentes ha facilitado suerte de cartografía vivo y registros electrofisiológicos en preparaciones rebanada agudas en. Incluso con estos estudios, se sabe poco sobre la dinámica temporal de la proliferación celular y la diferenciación de oligodendrocitos NG2. Aunque el cultivo de células disociada es ampliamente utilizado para la instalación relativa en las manipulaciones farmacológicas y genéticas, que no es adecuado para interrogar a diferencias funcionales de estas células en diferentes regiones del cerebro en particular cuando es deseable mantener el contexto de la microambiente celular. Cultivos de cortes proporcionan una alternativa simple que es susceptible de manipulaciones farmacológicas y se han utilizado para investigar la mielinización de oligodendrocitos ^11,12, célulaular respuesta después de lisolecitina (LPC) o el anticuerpo induce desmielinización ^13,14, y la inducción de remielinización mediante tratamiento farmacológico ^15.

Un método para investigar y realizar imágenes en vivo y tejido fijado (o post-fijación) análisis de la proliferación celular y la diferenciación de oligodendrocitos NG2 en cultivos de cortes organotípicos tomadas tanto desde el cerebro anterior y el cerebelo se describe. Este es un poderoso método que se puede utilizar para estudiar el destino celular de las células individuales NG2 después de la división ¹⁶ y para descubrir diferencias de región y dependientes de la edad en el factor de crecimiento inducido por la proliferación de células NG2 ^17. Esta técnica es relativamente simple ampliamente accesible a investigar más a fondo celular intrínseco y / o ambiental mecanismos que regulan la fisiología de estas células gliales y su respuesta a la actividad neuronal o daño de mielina.

Protocolo

NOTA: Todos los animales procedimientos están siguiendo las directrices y han sido aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) de la Universidad de Connecticut.

NOTA: Para estos experimentos constitutivos NG2cre ¹⁸ (JAX # 008533) e inducibles NG2creER ¹⁶ (JAX # 008538) ratones transgénicos cruzó a Z / EG ¹⁹ (JAX # 003920) o gtRosa26: reportero YFP ²⁰ (JAX # 006148) líneas se utilizaron respectivamente a imagen células NG2 y su progenie. Para imagen oligodendrocitos maduros, se utilizaron ratones transgénicos PLPDsRed ^21. Para la supervivencia consistente, rebanadas pueden ser aislados de los ratones hasta el día postnatal 10 tanto desde el cerebro anterior y el cerebelo.

1. Preparación rebanada

1. En una campana de cultivo, colocar insertos de cultivo de tejidos en placas de seis pocillos y se añade 1 ml de medio de cultivo de cortes (receta en la sección reactivos). Poner las placas en la incubadora de cultivo celular a 37 ° C con 5% de CO ₂ al menos 2 horas antes de la disección.
2. Esterilizar todas las herramientas y cortador de tejidos con etanol al 70%.
3. Tampón de disección de la burbuja (receta en la sección reactivos) con 95% de O _2, 5% de CO ₂ en hielo durante al menos 15 min antes del inicio de la disección.
4. Anestesiar crías de ratón, colocándolos en hielo durante 5 a 10 min de acuerdo con los protocolos de los animales aprobados. Determinar la profundidad adecuada de la anestesia mediante la confirmación de que los ratones no responden a la cola y de pellizco del dedo del pie.
5. Decapita animales utilizando tijeras afiladas siguientes protocolos de animales. Quite rápidamente el cráneo sobre el cerebro anterior y el cerebelo, haciendo primero un corte sagital seguida de incisión lateral, utilizando herramientas esterilizadas. Cortar los nervios craneales desde la superficie ventral del cerebro y el cerebelo enrollando cuidadosamente el tejido a un lado.
6. Coloque el tejido en una placa de 35 mm que contiene tampón de disección estéril oxigenada enfriado con hielo.
7. Utilizando una hoja de afeitar, cortar el cerebelo y el cerebro anterior. A continuación, hacer un corte sagital medial throuf el cerebro anterior y el cerebelo, la separación de los hemisferios.
8. Cortar 300 micras de espesor secciones coronal y sagital del cerebro anterior y el cerebelo con un cortador de tejidos manual. NOTA: Un cortador de tejidos manual permite un rápido procesamiento de la disección de la incubación de cultivo sin la necesidad de incrustación de agarosa. Un vibratome también se puede utilizar como se describió anteriormente ^9.
9. Transferir las rebanadas separadas en tampón de disección en frío recién burbujeó en hielo.
10. Utilice pequeña disección o con un peso espátulas para separar secciones individuales y transferirlos a preincubada seis pocillos con insertos de cultivo.
11. Eliminar cualquier exceso de tampón de la disección de la superficie de la pieza de inserción de cultivo utilizando una pipeta de transferencia desechable o una punta de pipeta P 200. De dos a tres prosencéfalo o tres rebanadas cerebelosas se puede colocar en un inserto de cultivo.
    NOTA: Para obtener resultados consistentes con las culturas del cerebro anterior, que es ideal para las rebanadas que abarca el tercio anterior del cuerpo calloso(Figura 1 A) con el fin de estudiar ambas regiones de materia gris y blanca en el mismo segmento. Cada animal por lo general rinde 6 rebanadas del cerebro anterior y 6 rebanadas cerebelo.
12. Coloque las placas de seis pocillos en la incubadora y reemplazar el medio rebanada con 1 ml de medio rebanada 1 día después de la preparación rebanada y luego cada dos días hasta que la fijación de la rebanada.
13. Dependiendo del experimento, utilizar rebanadas después de 5-7 días en cultivo. Utilice únicamente las rebanadas que se convierten en transparentes después de los primeros días y descartar aquellas que tienen regiones opacas irregulares. NOTA: las regiones opacas dentro de rebanadas son visibles a simple vista y aparecen como un grupo de células oscuros bajo contraste de fase. Después de la técnica se ha dominado, rebanadas opacos muertas ocurren rara vez, en menos de 5.1% de las rebanadas.

2. Time-lapse de imágenes de la división de células NG2 y Oligodendrocyte Diferenciación

NOTA: Para realizar la proyección de imagen de lapso de tiempo de la proliferación celular y la diferenciación NG2 utilizamos NG2cre: ratones ZEG ¹⁶que expresan EGFP en células NG2 y su progenie (Figura 1C-E). Expresión reportero en esta línea es suficientemente robusto para obtener imágenes en directo de las buenas prácticas agrarias + células en rodajas inmediatamente después de la sección por un período de tiempo de al menos cuatro semanas. Las imágenes más claras se obtienen después del período de adelgazamiento inicial de la rebanada, que se produce durante los primeros 3-5 días en cultivo.

1. Durante todo el experimento, mantener las rodajas en un incubador de cultivo celular a 37 ° C y retirar sólo durante breves períodos de tiempo (menos de 15 min por rebanada), manteniendo la tapa en la placa de seis pocillos mientras que las imágenes.
2. El uso de un microscopio de fluorescencia invertido equipado con una cámara digital, la captura de imágenes en el primer punto de tiempo utilizando un objetivo de 10X. NOTA: los puntos de primera vez pueden variar por el experimento y puede ser el día en que se prepararon los cortes o cualquier punto de tiempo después.
3. Capturar imágenes desde múltiples regiones en el punto de una vez en las dos áreas de materia gris y blanca de la división. Nota ªe región fotografiada por puntos de referencia específicos dentro de la rebanada y mediante la asignación de la ubicación de la imagen en un esquema que puede ser utilizado para las sesiones de formación de imágenes subsiguientes. Puntos de referencia útiles pueden incluir bordes de las rebanadas y / o la orientación de tractos de sustancia blanca. Image siete y cincuenta y seis ubicaciones en cada rebanada en cada punto de tiempo.
4. Capturar las imágenes siguientes en un intervalo de 4-6 horas si el examen de la división celular y la diferenciación de oligodendrocitos NG2, idealmente más de 5-7 días.
5. Capturar una imagen final de todas las regiones y fijar las rebanadas de inmediato. Añadir 1 ml de fijador (4% PFA con 0,1 M de L-lisina 0,01 M metaperyodato de sodio) a la parte inferior de la inserción del cultivo, a continuación, añadir otros 1 ml en la parte superior de las rebanadas. Tenga cuidado de no rociar el fijador directamente en el segmento, ya que puede desprenderse de la membrana. Fijar el tejido durante 30 minutos y proceder con inmunohistoquímica utilizando marcadores específicos de la etapa de desarrollo, como se describe en la sección 4.
6. Rodajas de lavado con tampón fosfato sódico 0,2 M 3 x 10 m. Si es necesario, rebanadas almacena a 4 º C en tampón de fosfato de sodio 0,2 M durante 1-3 días antes de la inmunotinción pero lo ideal es realizar la tinción dentro de las 24 horas. Proceda con la inmunohistoquímica, como se describe a continuación en la sección 4 para determinar la proporción de células que se han diferenciado en oligodendrocitos (Figura 2D-F).

3. Destino Cartografía de la progenie de células NG2 Utilizando ratones Inducible Periodista transgénicos en cultivos de corte

NOTA: Para realizar el seguimiento del destino de las células NG2 desde un punto de tiempo particular en la cultura, NG2creER inducibles: se pueden usar ratones transgénicos YFP.

1. Inducir Cre recombinación y expresión del indicador mediante la adición de 100 nM 4OHT disuelto en etanol al medio de cultivo. NOTA: células positivas Reporter deben aparecer dentro de 1-2 días con una eficiencia de inducción de ~ 20-25% YFP células NG2 + + / + NG2 y en este punto el tiempo todo será células en la etapa de células NG2 (Figura 2A-C)
2. Fijar y lavar la rebanadas en diferentes puntos temporales después de varias manipulaciones (descritos en las secciones 2.5 y 2.6).

4. rebanada inmunohistoquímica

1. Cortar las membranas con las rodajas de adjuntos de los insertos utilizando un bisturí.
2. Transferir las rebanadas a pocillos individuales de una placa de 24 solución salina tamponada que contiene bien fosfato (PBS) usando un conjunto de pinzas, teniendo cuidado de no alterar la composición de la rebanada al momento de retirar la membrana.
3. Transferencia de las rebanadas a una placa de 24 pocillos con solución de bloqueo que contenía 5% de suero normal de cabra (NGS) y 0,1% de Triton-X100 en PBS durante 1 hr.
4. Incubar las rebanadas en anticuerpo primario O / N en un 5% en NGS en PBS a 4 ° C. Para identificar las células en la etapa de células NG2, utilizar anticuerpos contra NG2 y PDGFR. Para la identificación de los oligodendrocitos diferenciados, utilizar un anticuerpo para el antígeno de la poliposis coli adenomatosa (APC; CC1 clon).
5. En el segundo día de las rebanadas de lavado en PBS 3 x15 min, luego se incuban en Antibo secundariamuere en 5% de NGS en PBS durante 1 hora a TA. Lávese las rebanadas en PBS 3 x15 min y montar en portaobjetos. Montar con rodajas de arriba y de membrana que se enfrenta la diapositiva para que la membrana no será entre el objetivo y el tejido.

Resultados

Se dan ejemplos de datos representativos a continuación que se han obtenido usando cultivos de corte tanto del cerebro anterior y el cerebelo de P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP y PLPDsRed líneas de ratones transgénicos. NG2 células se pueden obtener imágenes en día en prosencéfalo y cerebelo rebanadas (Figura 1B-D, video 1) y el fenotipo de estas células se puede determinar después de la fijación y la inmunotinción con anticuerpos CC1 y NG2 (Figura 1E). Además de imágenes en ...

Discusión

La mielinización en el sistema nervioso central es esencial para la comunicación eficiente neuronal y la supervivencia axonal ^22. Células NG2 generan continuamente oligodendrocitos myelinating en la edad adulta, mientras que el mantenimiento de una población residente en la mayoría de las regiones del cerebro ^{16,23 - 25.} Algunos de los mecanismos genéticos y moleculares que regulan la diferenciación de estas células han sido descritas, pero mucho queda por descubrir. Cultivos de cortes orga...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slice Culture Medium
Minimum Essential Medium	Invitrogen	11090	50%
Hank’s Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175	25%
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034	25mM
L-Glutamine	Invitrogen	25030	1mM
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	1mg/L
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	0.4mM
Horse Serum	Hyclone	SH30074.03	25%
Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius
Dissection Buffer
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	124mM
KCl	Sigma-Aldrich	P5405	3.004mM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	1.25mM
MgSO4 (anhydrous)	Sigma-Aldrich	M7506	4.004mM
CaCl2 2H2O	Sigma-Aldrich	C7902	2mM
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	26mM
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	10mM
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	2.0mM
Adenosine	Sigma-Aldrich	A4036	0.075mM
Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use
Other Reagents and Supplies
4-hydroxy tamoxifen (4OHT)	Sigma-Aldrich	H7904	100nM
Paraformaldehyde (PFA)	EM Sciences	19200	4%
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L-6027	0.1M
Sodium Metaperiodate	Sigma-Aldrich	S-1878	0.01M
Rabbit anti NG2 antibody	Chemicon (Millipore)	AB5320	1:500
Mouse anti CC1 antibody	Calbiochem (Millipore)	OP80	1:200
Mouse anti Ki67 antibody	Vision Biosystems	NCL-Ki67-MM1	1:300
Mouse anti NeuN antibody	Chemicon (Millipore)	MAB377	1:500
Species specific secondary antibodies	Jackson Immunoresearch
Normal Goat Serum (NGS)			5%
Triton X-100			0.10%
Mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size	Fisher Scientific	PICM03050
Bottle top filters	Fisher Scientific	09-740-25E
Ethanol
95% O2 5% CO2 gas mix
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sterile six well plates
Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas
Manual or automatic tissue chopper
Razor blades
Disposable transfer pipettes
35mm and 60mm sterile Petri dishes
Stereomicroscope
Inverted Phase Microscope
Laminar Flow Hood
Tissue Culture Incubator
Inverted Fluorescence Microcope