Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión

Resumen

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Resumen

Dado que el microscopio electrónico de transmisión de 1940 (TEM) ha estado proporcionando los biólogos con imágenes ultra-alta resolución de los materiales biológicos. Sin embargo, debido a los protocolos laboriosos y lentos que también exigen experiencia en la preparación de las muestras libres de artefactos, TEM no se considera una técnica fácil de usar. Preparación de la muestra tradicional para TEM utiliza fijadores químicos para preservar las estructuras celulares. Congelación de alta presión es la criofijación de muestras biológicas bajo altas presiones para producir velocidades de enfriamiento muy rápidas, restringiendo así la formación de hielo, que es perjudicial para la integridad de la ultraestructura celular. Congelación de alta presión y la sustitución de congelación son actualmente los métodos de elección para la producción de la morfología de la más alta calidad en las secciones de resina para TEM. Estos métodos reducen al mínimo los artefactos normalmente asociados con el procesamiento convencional para TEM de secciones delgadas. Después de criofijación el agua congelada en la muestra se sustituye con el líquidodisolvente orgánico a bajas temperaturas, un proceso llamado sustitución de congelación. Sustitución Freeze se lleva a cabo normalmente durante varios días en dedicado, equipos costosos. Una reciente innovación permite que el proceso se completará en tres horas, en lugar de los habituales dos días. Esto es seguido por varios días más de preparación de la muestra que incluye la infiltración y la incrustación en resinas epoxi antes de seccionar. Aquí se presenta un protocolo que combina la congelación de alta presión y la sustitución de congelación rápida que permite la fijación de la muestra planta para llevar a cabo en cuestión de horas. El protocolo puede adaptarse fácilmente para trabajar con otros tejidos u organismos. Los tejidos vegetales son de especial preocupación debido a la presencia de espacios aireados y vacuolas llenas de agua que impiden la congelación sin hielo de agua. Además, el proceso de fijación química es especialmente larga en las plantas debido a las paredes celulares que impiden la penetración de los productos químicos a lo profundo dentro de los tejidos. Los tejidos de plantas son, por lo tanto particcialmente difícil, pero este protocolo es confiable y produce muestras de la más alta calidad.

Introducción

Nuestro conocimiento de la ultraestructura de células proviene principalmente de microscopía electrónica, que puede resolver detalles en el intervalo de unos pocos nanómetros ^1. A pesar de ser tan poderoso en la resolución TEM no se considera fácil de usar, como preparación de la muestra requiere mucho tiempo y protocolos laboriosas, y exige cierta experiencia del practicante. Fijación tradicional de las muestras ha combinado el uso de aldehídos y tetróxido de osmio antes del procesamiento adicional que incluye la deshidratación, incrustación de resina y luego en seccionar para producir secciones ultra-delgada que se tiñen con metales pesados. Sin embargo, se sabe que la fijación química puede producir artefactos incluyendo la agregación de proteínas y la pérdida de lípidos ^1, y cambios a las membranas que afectan en última instancia varios compartimentos celulares ^2. Estos artefactos se atribuyen en gran parte a la lenta tasa de fijación y deshidratación a temperatura ambiente ^{3, 4, 5.}

Criofijación por alta presión congelación (HPF) evita la mayoría de los artefactos causados ​​por la fijación química. El principio de criofijación es que disminuye el punto de congelación del agua por 20 grados, se ralentiza la nucleación y crecimiento de cristales de hielo y aumenta la viscosidad del agua en una muestra biológica de modo que los constituyentes celulares son esencialmente inmovilizadas ^{6, 7.} HPF disminuye un la temperatura de la muestra a la de nitrógeno líquido, a muy alta presión (210 MPa o 2.100 bar) en milisegundos. Cuando se hace correctamente HPF previene la formación de grandes cristales de hielo que pueden causar grandes daños a ultraestructura celular. HPF se puede utilizar para fijar muestras de 100-200 micras de espesor en concentraciones típicas de solutos biológicos ^7. Hay numerosas opiniones sobre la física y los principios subyacentes HPF, por ejemplo, ^{1, 7, 8.}

Después de HPF, las muestras se incubaron a temperatura baja (-78,5 ° C a -90 y# 176; C) en presencia de disolvente que contiene fijadores químicos líquidos orgánicos como tetróxido de osmio, generalmente para unos pocos días. A esta baja temperatura, el agua en la muestra se sustituye por el disolvente orgánico, típicamente acetona o metanol ^{1, 9.} Por lo tanto, este proceso se denomina sustitución de congelación (FS). La muestra se calentó gradualmente y durante este tiempo se fija, por lo general con tetróxido de osmio y acetato de uranilo ^9. La reticulación a bajas temperaturas tiene la ventaja de la fijación de moléculas que están inmovilizadas ^1. FS, por tanto, produce muestras de calidad superior en comparación con los fijados por la fijación química convencional a temperatura ambiente, en particular, que resulta en una mejor conservación ultraestructural, mejor conservación de la antigenicidad y la reducción de la pérdida de los componentes celulares no unidas ^{10, 11.}

La mayoría de FS se lleva a cabo durante períodos de tiempo largos, normalmente de hasta varios días. Esto es particularmente true para las plantas muestras ^{12, 13, 14.} Un reciente protocolo desarrollado por McDonald y Webb reduce en gran medida el tiempo de FS desde varios días hasta unas pocas horas ^15. En su procedimiento de rápida sustitución de congelación (QFS), FS se lleva a cabo más de 3 horas, mientras que en el FS súper rápidas (SQFS) muestras se procesan en 90 minutos. La calidad de las muestras producidas por estos métodos es comparables a los generados por los protocolos de FS tradicionales. Hemos adoptado el protocolo QFS para el procesamiento posterior de las muestras de plantas después de HPF. Esto ha demostrado ahorrar no sólo tiempo, sino también dinero, como QFS y SQFS utilizan equipos de laboratorio común en lugar de las costosas máquinas FS disponibles comercialmente.

Los tejidos vegetales son a menudo muy difícil de preparar para TEM. En promedio, las células vegetales son más grandes que cualquiera de las células bacterianas o de animales. La presencia de cutícula cerosa hidrófobo, paredes celulares gruesas, grandes vacuolas llenas de agua que contienen ácidos orgánicos, hidrolasas y c fenólicocomuestos que pueden ocupar hasta el 90% del volumen total de células ^16, y la presencia de espacios aireados disminuye gravemente la conductividad de calor del sistema ^17. Además, en el caso de las plantas, el espesor de la muestra casi siempre supera 20 m, el límite para el uso de la fijación química. En estos espesores, la baja conductividad de calor de agua evita una tasa de congelación más de -10 000 ° C / seg en el centro de la muestra. Se requiere que la tasa para evitar la formación de hielo hexagonal perjudicial (cristales de hielo con una densidad más baja y más grande que de 10 a 15 nm) ^8. Juntos, estos presentan desafíos tanto a congelación adecuada de la muestra y FS posteriores. No obstante, criofijación es el mejor método para la fijación de muestras de plantas. Aquí se presenta un protocolo para HPF-QFS de muestras de tejidos vegetales. Se centra en la especie modelo Arabidopsis thaliana, pero también se ha utilizado con Nicotiana benthamiana. Los resultados típicos demuestran que HPF-QFS produce samples de calidad comparable a la tradicional HPF-FS en una fracción del tiempo. Con los ajustes adecuados, este protocolo puede usarse también para otras muestras biológicas relativamente gruesas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

NOTA: El procedimiento QFS requiere extremo cuidado y precaución por el usuario y le prestamos atencion a estas precauciones de seguridad aquí como precauciones y notas en su caso.

1.Preparación para HPF Run

1. Antes de comenzar la preparación de muestras, encienda el congelador de alta presión siguiendo las instrucciones del fabricante.
   NOTA: La unidad HPF utilizada en este protocolo es una unidad compacta Wohlwend 02 (Figura 1), y se tarda aproximadamente una a una hora y media de procedimiento de puesta en marcha antes de HPF se ejecuta puede comenzar.
   1. Encender el Wohlwend compacto de alta presión 02 congelador.
      1. Encienda el instrumento girando el interruptor principal de "0" a "1".
      2. Liberar el aire comprimido a la máquina.
      3. Liberación de nitrógeno líquido a la máquina.
      4. Presione el botón "SYSTEM DRY UP".
      5. Después de 30 minutos, pulse el botón "SYSTEBotón de nuevo M DRY UP ".
      6. Presione el botón "ON / OFF" para encender el instrumento.
      7. Pulse el botón "NITROGENO".
      8. Deje que la máquina se enfríe durante 20 minutos, incluso si el "DRIVE IN" botón ya ha iluminado.
      9. El "DRIVE IN" botón se ilumina.
      10. Pulse el "DRIVE IN" botón.
      11. Pulse el botón "AUTO".
      12. Los "SISTEMA LISTO" botón se ilumina.
      13. Coloque la sonda de temperatura y de presión en la cámara de presión y fijarlo con el pasador.
      14. Pulse el botón "AUTO JET". Este paso comprueba que el aumento de presión y el descenso de la temperatura son tan deseada; esencialmente una prueba. Se espera que las fuertes caídas de temperatura y fuertes aumentos de presión (Figura 1B).
      15. Realizar dos ciclos más JET.

2. Preparación para ReceiviLas muestras congeladas ng

1. Rellena una caja aislada que contiene los titulares criovial con nitrógeno líquido (véase Advertencias de seguridad), por lo que los titulares están cubiertos completamente (Figura 1C).
   NOTA: Use PPE incluyendo cryogloves y gafas al manipular el nitrógeno líquido.
2. Coloque el número apropiado de viales que contienen el medio FS en los soportes de tubo de aluminio en el nitrógeno líquido (Figura 1C). Con este protocolo hasta cuatro discos que contienen cada uno una sola muestra se puede colocar en una sola criovial.
   NOTA: Los viales deben ser etiquetados con un instrumento afilado como un escriba con punta de diamante y un lápiz muy suave.
   1. Para fijador durante QFS utilizar 1% OSO ₄ y 0,1% de acetato de uranilo en acetona ^9. Preparar la solución en gran volumen, dispensar alícuotas de 1,5 ml en crioviales y tienda de congelados en nitrógeno líquido.
      NOTA: los avisos de seguridad para el manejo de _OsO4 y acetato de uranilo.
      NOTA: _OsO4 y acetato de uranilo son productos químicos peligrosos y deben ser manejados en la campana de extracción, mientras que use el equipo de protección personal (PPE), incluyendo zapatos cerrados, bata de laboratorio y guantes.
      NOTA: Los crioviales se utiliza para mantener las muestras para QFS debe tener una junta tórica duro para asegurar que los tubos se mantendrán sellados durante QFS para evitar fugas de _OsO4.
3. Prepare la pasta de levadura mezclando la levadura del pan, con un volumen aproximadamente igual de metanol al 10% con un palillo de dientes u otro objeto similar hasta que la pasta esté suave. La pasta de levadura actúa como un crioprotector extracelular y se utiliza para llenar el espacio alrededor de la muestra en el portamuestras. La cantidad de pasta depende del número de muestras; para 10 muestras o menos la pasta (1 ml) se pueden mezclar en un tubo de microcentrífuga.

Congelación 3. de alta presión de las Muestras

1. Quite una hoja (u otro tejido) de interés por parte de la planta y suavemente colóquelo sobre un trozo de dental de cera u otra superficie de corte. Use un punzón de 2,0 mm o tamaño deseado para cortar una muestra de la hoja. Maneje la muestra suavemente con un par de pinzas y trabajar lo más rápido posible.
2. Trabajando bajo un microscopio de disección, coloque el disco de hoja en el lado de 0,2 mm del tipo A portador de muestras y cubrir por completo en la pasta de levadura. Asegúrese de que el disco está completamente lleno y la pasta esté al nivel del borde del soporte al suavizar la pasta con un pincel fino (Figura 2).
3. Coloque el soporte en el soporte de la muestra. Cubra la muestra con la muestra portadora Tipo B, superficie plana hacia abajo.
   NOTA: El soporte de la muestra debe estar seco ya temperatura ambiente.
4. Toma de muestras en el soporte de muestra; poner en la máquina e iniciar un ciclo de congelación presionando el botón "AUTO JET", que debe completar en un segundo o dos.
5. Trabajar lo más rápido posible, retire el soporte de la máquina y colocar la punta de la celebración de la sample en nitrógeno líquido en la caja aislada en la parte superior de la máquina HPF. Sumergir las puntas de dos pares de pinzas en el nitrógeno líquido para enfriar ellos.
   NOTA: Después de la congelación, los transportistas sólo deben ser manipulados con pinzas de nitrógeno líquido refrigerado. (Temperatura ambiente) pinzas calientes son a menudo la causa de la falla en cryotechniques.
6. Abra una criovial que contiene los medios de comunicación FS, y coloque la tapa en el lado de la caja. Con la ayuda de un par de fórceps enfriado con nitrógeno líquido, eliminar suavemente el disco de la portamuestras, asegurándose de que el disco está siempre en el nitrógeno líquido o vapor. Trabajar en el vapor de nitrógeno líquido, sostenga el tubo FS con uno fórceps pre-enfriado y utilizar la otra para colocar el soporte en el vial FS. Tornillo de la tapa del vial FS de nuevo. No cualquier trampa de nitrógeno líquido en el vial.
   NOTA: Cuando se transfieren las muestras a crioviales de QFS, garanticen que ninguna de nitrógeno líquido queda atrapado en los viales. El nitrógeno líquido se expande 700 veces durante el calentamiento y cualquier trapped nitrógeno líquido puede causar explosiones durante este tiempo.
7. Repita los pasos 3.1 a 3.7 hasta que se congelan todas las muestras deseadas. Discos de hojas múltiples que contienen el mismo tipo de muestra se pueden colocar en el mismo vial. Tenga en cuenta que el soporte de la muestra tiene que ser secado y se llevó a temperatura ambiente, entre carreras de congelación. Para hacer esto de manera rápida, calentarlo con un secador de pelo, y controlar su temperatura por medio del tacto.

4 Preparación para Congelar Sustitución

1. Inmersa por completo el bloque calentador de aluminio en nitrógeno líquido durante 10 minutos o hasta que deje de ebullición nucleada. Mientras esto sucede, coloque una capa de hielo seco (1-2 cm) en la parte inferior del recipiente utilizado como cámara de FS (Figura 3). Un recipiente de espuma de poliestireno o cubo de hielo se pueden utilizar para FS, junto con pellets de hielo seco o aplastado.
2. Inserte rápidamente los crioviales que contienen las muestras junto con la sonda de temperatura en las filas centrales del bloque del calentador. Asegúrese de que las tapas de laviales están firmemente atornillados de manera que los medios de comunicación FS no se escape durante la FS. Comience a registrar la temperatura.
   1. Hacer la sonda de temperatura mediante la colocación de un termopar a través de la parte superior de un criovial para que llegue a la parte inferior del tubo. Sellar la tapa del tubo con resina de forma que no haya fugas de líquido fuera. Llenar el tubo con 1,5 ml de acetona al inicio de cada ejecución QFS.
3. Usando cryogloves aislados o grandes pinzas, derramará todo el nitrógeno líquido desde el bloque del calentador. Tenga cuidado de no derramar los crioviales.
   NOTA: Use PPE incluyendo cryogloves y gafas al manipular el nitrógeno líquido.
4. Coloque el bloque que contiene los viales sobre la capa de hielo seco en la cámara de QFS. Asegúrese de que el bloque se coloca de manera que los tubos están en posición horizontal pero con una ligera inclinación hacia arriba. No debe haber fugas si se utilizan los crioviales correctos.
5. Empaque la cámara de QFS con hielo seco de manera que los tubos FS están cubiertos, aunque no es necesariocubrir la parte superior del bloque. Coloque la tapa en la cámara.

5. FS Rápida

NOTA: Realice la carrera QFS en una campana de humos en caso de que cualquier fuga de _OsO4 ocurre inadvertidamente a pesar de otras precauciones.

1. Coloque cámara de QFS en un agitador rotatorio plataforma en una campana de humos y girar a 125 rpm durante 120 min. Durante este tiempo la temperatura del bloque debe aumentar gradualmente a aproximadamente -80 ° C. La agitación se asegura la mezcla de los componentes de mejores FS.
   NOTA: La colocación de la coctelera en la campana de humos y la posición de la puerta campana de humos debe ser la misma durante todo el procedimiento QFS y por cada QFS ejecutar para asegurar el calentamiento consistente de muestras.
2. Retire el hielo seco de la cámara y continuar agitando durante otra hora.
   NOTA: la temperatura debe aumentar a alrededor de -15 ° C a -20 ° C.
3. Retire las muestras y la sonda de temperatura de la cámara de QFS y colocarlo en elagitador a temperatura ambiente durante otros 10-15 minutos, hasta que alcancen la temperatura ambiente. Detener la grabación de la temperatura.
4. Durante FS, apague la máquina de HPF.
   1. Cierre la llave del tanque de nitrógeno líquido, mientras que la máquina de HPF se llena con nitrógeno.
   2. Pulse el botón "NITROGENO".
   3. Espere hasta que los rojos "pistón hacia abajo" se apaga la luz.
   4. Presione el botón "ON / OFF".
   5. Presione el botón "SYSTEM DRY UP".
   6. Corte el suministro de aire comprimido para la máquina.
   7. Después de un mínimo de 12 horas (para asegurar el secado de la humedad), apague la máquina girando el interruptor principal de "1" a "0".

6. Mensaje FS Procesamiento

1. Retire con cuidado los medios de comunicación FS con pipetas de transferencia de plástico y colocar en el recipiente apropiado para desechos tóxicos.
   NOTA: _OsO4 y acetato de uranilo son productos químicos peligrososy debe ser manejado en la campana de extracción, mientras que use el equipo de protección personal (PPE), incluyendo zapatos cerrados, bata de laboratorio y guantes.
2. Lávese las muestras cuatro veces con acetona al 100%. Recoge los dos primeros lavados y colocarlo en el contenedor de residuos tóxicos.
3. Con unas pinzas finas, eliminar las muestras de tejido de los titulares. Mantener las muestras mojado con acetona como se hace esto, y trabajar con mucho cuidado para evitar romper las muestras.
   NOTA: No es inusual y que en realidad puede ser útil disponer de la pasta de levadura se alejan de las muestras en este punto. La pasta de levadura es generalmente de color marrón muy oscuro, mientras que el tejido de la hoja aún está verde.
4. Recoger las muestras en crioviales que contienen acetona. Proceder a la preparación de muestras (infiltración y la incrustación) para TEM de acuerdo a los protocolos habituales.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Los resultados presentados a continuación han sido obtenidos utilizando un Wohlwend compacto 02 para HPF (Figura 1A). Una gran ventaja de este instrumento es la facilidad de uso de los portadores de muestra y sus titulares. Si se utilizan otros instrumentos, McDonald recomienda que dos usuarios deben llevar a cabo la preparación de la muestra y HPF, una preparación de las muestras, mientras que el otro hace la congelación y traslado al FS crioviales ^9. Sin embargo, la Wohlwend espécimen ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

El éxito del protocolo que se presenta aquí depende en gran medida del usuario. En primer lugar, se requiere una preparación avanzada para asegurar que todos los materiales necesarios son fácilmente disponibles y en cantidad suficiente para completar toda una carrera HPF-QFS. En segundo lugar, el usuario debe trabajar con rapidez, moviéndose desde el paso-a-paso de una manera eficiente que minimiza la manipulación de la muestra, minimizando de este modo los cambios en el estado nativo del tejido. Una vez que las m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch - Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 ml	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs